Organoidy gliomových kmenových buněk odvozené od pacienta

Pacienti s glioblastomem (GM) mají medián celkového přežití přibližně 15 měsíců. Standardní terapie GM zahrnuje maximální chirurgickou resekci následovanou ozařováním a chemoterapií pomocí temozolomidu (TMZ) (1). Bez ohledu na počáteční odpověď nádoru je recidiva nádoru nevyhnutelná, po níž přežití klesne na méně než 6 měsíců. Přístupy přizpůsobené GM zaměřené na onkogeny, které by mohly řídit růst většiny primárních nádorů, byly dosud v klinických studiích neúspěšné (2), což vytvořilo velkou neuspokojenou potřebu opravňující nové přístupy k překonání vnitřní a získané rezistence vůči současným léčebným schématům. Cílem tohoto výzkumu je vytvořit primární organoidní kultury odvozené od pacienta z GM za účelem studia mechanismů, které přispívají k agresivnímu růstu nádoru a odolnosti vůči léčbě u primárních a rekurentních GM.

1. Inter-a intratumorální heterogenita u glioblastomu. Nádorové přístupy pro GM jsou omezovány internádorovou a intratumorální heterogenitou jak mikroprostředí, tak genomových změn v GM buňkách. Bylo prokázáno, že nádory jsou složeny z mnoha klonů nesoucích odlišné genetické změny (3-7). Model klonální evoluce předpokládá, že tvorba nádoru je zahájena v buňce původu a je následována následnou akumulací mnoha genetických a epigenetických změn, což vede k přežití nádorových buněk a výhodě růstu (8). Divergentní genetické změny v časně transformovaných buňkách vedou ke vzniku různých klonů pod selektivním tlakem nádorového mikroprostředí (3-7). Důležitým mikroenvironmentálním stresorem je intratumorální hypoxie, která je častá u GM a je negativním prognostickým a prediktivním faktorem spojeným se sníženým přežitím [9,10].

   Objevující se důkazy implikují subpopulaci nádorových buněk s charakteristikami normálních kmenových buněk, tzv. gliomových kmenových buněk (GSC) ve vnitřní a získané rezistenci na léčbu. GSC jsou obdařeny specifickými vlastnostmi včetně vysoké schopnosti iniciovat nádor, neomezeného potenciálu sebeobnovy a schopnosti multipotentní diferenciace, generující různorodé potomstvo(11). GSC jsou označeny běžnými markery kmenových buněk včetně CD133+, SOX2, Olig1 a bylo prokázáno, že sídlí v perivaskulární oblasti i v hypoxických oblastech. GSC jsou expandovány při hypoxii12 v závislosti na glykolýze (13,14).

   V kombinaci s jejich nízkou proliferací, zvýšenou opravou DNA, vysokou antioxidační aktivitou a mimo jiné činí GCS odolnější vůči konvenčním léčbám (záření a temozolomid) než non-GSC (15,16) {Jamal, 2012 #52}.

   To znamená, že GSC tvoří důležitou hnací sílu recidivy GM po chemoradiaci. V současné době neexistuje žádná účinná léčba k odstranění kmenových buněk gliomu. Blokování signalizace hypoxie u nádorů (inhibice sebeobnovy a přežití buněk GSC)(12,17) a blokování dráhy kmenových buněk NOTCH (učiní GSC citlivými na záření(18) a TMZ(19-21)), se zdají být slibné, ale léky interferující s těmito cestami zatím nepřekročily ranou fázi klinických studií(22).

   Současný standard péče o nově diagnostikovaný glioblastom je multimodální a sestává z chirurgie, radioterapie a TMZ, alkylačního činidla modifikujícího purinové báze DNA (O6-guanin; N7-guanin a N3-adenin). Přidání TMZ k radioterapii výrazně zvýšilo celkové přežití pacientů s GM, ale pouze do 14,6 měsíce(1). Bylo prokázáno, že intratumorální hypoxie snižuje terapeutickou účinnost RT a chemoterapie(23). Hypoxické GM buňky jsou geneticky nestabilní a vykazují zvýšenou expresi MGMT, a tím odolnost vůči alkylační chemoterapii TMZ(24).

   U non-GSC je methylace promotoru MGMT prediktivním markerem odpovědi na léčbu TMZ(25,26). Interpretace testu metylace MGMT je však složitá, protože rozsah methylace promotoru MGMT v GM je heterogenní a úroveň heterogenity je podhodnocena, protože jsou analyzovány pouze biopsie GM nebo fragmentovaná GM tkáň (27,28). Důležité je, že MGMT je také exprimován v normálních mozkových endoteliálních buňkách a v imunitních buňkách včetně buněk infiltrujících nádor(29). V závislosti na rozsahu kontaminace normální tkáně v biopsiích GM se tedy může lišit i úroveň methylace MGMT.

   Vzhledem k tomu, že intratumorální heterogenitu exprese MGMT nelze objektivizovat pomocí aktuálně dostupných diagnostických metod a protože je třeba neustále předcházet nedostatečné léčbě pacientů, dostává v současnosti většina pacientů s diagnózou „de novo“ GM TMZ; ačkoli se zdá, že TMZ má malý přínos u GM s MGMT nemethylovanými gliomovými buňkami.

   Navrhování nových léčebných protokolů pro nově diagnostikovaný glioblastom je poměrně složité, protože diagnostické nástroje, předpovídající inter- a intra-GM heterogenitu stavu metylace promotoru MGMT (nebo úrovně exprese MGMT), chybí. Kromě toho není známa úroveň exprese MGMT, která je potřebná pro významnou odpověď TMZ a zlepšení klinického výsledku. Protože většina GM je definována jak MGMT metylovanými, tak MGMT nemethylovanými nádorovými klony, může být nezbytné kombinovat TMZ s léky, které se zaměřují na nemethylované gliomové buňky/gliomové kmenové buňky a/nebo mikroprostředí.

2. Recidiva glioblastomu I když lze dosáhnout makroskopicky kompletní resekce GM, nádorové buňky zůstávají v místě resekce. Bylo prokázáno, že GM buňky mají vysokou kapacitu pro šíření. Invazní nádorové buňky unikají na periferii nádorové hmoty a difúzně infiltrují normální mozkový parenchym. Hluboce infiltrované nádorové buňky s větší pravděpodobností unikají chirurgickému zákroku a není známo, zda je infiltrace vlastností odolnější buněčné populace, která iniciuje a řídí recidivu nádoru. I po pooperační chemoterapii a ozařování mimo oblast chirurgie k redukci infiltrativních nádorových buněk se téměř všechny GM opakují, většinou v okolí resekční dutiny. Pokud nelze provést hrubou celkovou resekci; primární radiační terapie a chemoterapie jsou také schopny redukovat klonální diverzitu, ale jsou tak nedostatečné k prevenci recidivy.

To znamená, že nádorové buňky rezistentní na více terapií přetrvávají v mozkovém parenchymu kolem nádorové dutiny po celkové totální resekci nebo ve zbývajícím nádoru po chemoradiaci, které jsou zodpovědné za repopulaci nádoru, což z nich činí kritický cíl pro překonání recidivy nádoru. Genomická analýza GM ukázala, že dominantní klony v recidivujících nádorech jsou složeny z klonů reprezentativních pro primární nádor a také z nových klonů s malou podobností s původním nádorem (3,30,31,32,33). V důsledku toho cíle identifikované na základě analýzy primárního nádoru nemusí být informativní pro identifikaci nejlepších molekulárních cílů pro prevenci recidivy (5).

Zdá se, že po selhání léčby první linie GM (radiace, TMZ) je recidiva doprovázena fenotypovým posunem GSC k mezenchymálnímu (MES) subtypu (ztráta CD133; zisk BMI1, SOX2 a CD44)(34-38). Takové buňky jsou agresivnější, invazivnější a angiogennější než GSC derivované z primárního tumoru, většinou proneurálního (PN) podtypu (CD133+, CD15+)(39-41). MES GSC také vykazuje vyšší expresi inflammasomových genů, jako jsou IL6, IL8, IL1B1C a CXCL2, což posiluje představu, že se vzájemně ovlivňují s mikroprostředím a hrají důležitou roli v recidivě a progresi (42,43). Vyvíjejí se klinické studie specifické pro GM s použitím imunitních modulátorů. Bylo prokázáno, že mutace MSH (mutS homologue) korelují s rezistencí na TMZ, protože se nenacházejí ani u GM před léčbou, ani u GM po léčbě radioterapií, ale byly detekovány přibližně u poloviny pacientů s recidivující GM léčených TMZ a radioterapií. To silně naznačuje, že změny MSH6 jsou spojeny s rezistencí na léčbu alkylačními činidly. Pacienti s GM, kteří zpočátku reagují na TMZ, mohou získat MMR defektní hypermutátorový fenotyp (44-46). Je dobře známo, že oprava intaktního chybného párování a oprava základní excize (BER) přispívají k účinné cytotoxicitě TMZ. Farmakologická inhibice BER pomocí inhibitorů PARP buď samostatně, nebo v kombinaci s TMZ se v klinických studiích ukázala jako slibná. Získaná rezistence k inhibitorům PARP je však pozorována prostřednictvím up-regulace opravy excize bází a opravy homologní rekombinací ke kompenzaci snížené BER (47,48).

Závěrem lze říci, že pochopení terapií vyvolaných genetických a epigenetických změn zbývajících nádorových buněk a GSC a také dopadu standardní péče na mikroprostředí / výklenek, ve kterém dochází k recidivě, povede k vývoji nových léčebných postupů.

V tomto projektu použijeme organoidy z gliomových kmenových buněk pacienta(49), napodobující de novo GM a jeho intratumorální heterogenitu. Také tyto organoidy odvozené od pacienta (PDO) budou použity ke studiu získané rezistence na temozolomid, a tak mohou být použity pro identifikaci nových cílených látek.

Heterogenita nádorových buněk v expresi MGMT a její význam pro odpověď TMZ budou také řešeny pomocí těchto organoidů, pomocí jednobuněčné proteomiky a IHC pro MGMT, GSC markerů a sekvenování exomu (pro běžné řidičské mutace) k identifikaci těch populací, které se klonálně rozšiřují pod TMZ ( RT) výběr a ty, které zmizí.

Další zajímavou funkcí, kterou prozkoumáme pomocí PDO, je možnost analyzovat supernatanty na cirkulující nádorovou DNA (ctDNA) nebo exozomy (sekretované vezikuly, které obsahují RNA, malou nekódující RNA, proteiny a také DNA) před po získání rezistence na TMZ, která může vést k identifikaci farmakologické odpovědi a prediktivních biomarkerů. Takové biomarkery „tekutá biopsie“ se mohou stát užitečnými pro měření léčebné odpovědi v krvi nebo bederní tekutině pacientů s GM a umožnit úpravu dávky (eskalace nebo deintenzifikace nebo ukončení).

Vývoj CHOP (náklady na materiály) bude financován (607061 PI M. Vooijs, MAASTRO a KWF grant Alpe D'Huzes PI M.Vooijs, MAASTRO. Se získáním nádorové tkáně nejsou spojeny žádné dodatečné náklady.