Patienthärledda gliomstamcellsorganoider

Patienter med glioblastom (GM) har en genomsnittlig total överlevnad på cirka 15 månader. Standardbehandling för GM omfattar maximal kirurgisk resektion följt av strålning och kemoterapi med temozolomid (TMZ) (1). Oavsett initialt tumörsvar är tumörrecidiv oundvikligt, varefter överlevnaden sjunker till mindre än 6 månader. GM-anpassade tillvägagångssätt riktade mot onkogener som kan driva tillväxten av huvuddelen av primära tumörer, har hittills varit misslyckade i kliniska prövningar(2), vilket skapar ett stort ouppfyllt behov som motiverar nya metoder för att övervinna inneboende och förvärvad resistens mot nuvarande behandlingsscheman. Syftet med denna forskning är att etablera primära patienthärledda organoidkulturer från GM för att studera mekanismer som bidrar till aggressiv tumörtillväxt och behandlingsresistens i primär och återkommande GM.

1. Inter- och intratumoral heterogenitet i glioblastom. Tumöranpassade tillvägagångssätt för GM hämmas av inter- och intratumoral heterogenitet av både mikromiljö och genomiska förändringar i GM-celler. Det har visat sig att tumörer är sammansatta av flera kloner med distinkta genetiska förändringar (3-7). Den klonala evolutionsmodellen hävdar att tumörbildning initieras i en ursprungscell och följs av den efterföljande ackumuleringen av flera genetiska och epigenetiska förändringar, vilket leder till tumörcellöverlevnad och tillväxtfördelar (8). Divergerande genetiska förändringar i tidigt transformerade celler ger upphov till en mängd olika kloner under det selektiva trycket från tumörens mikromiljö (3-7). En viktig mikromiljöstressfaktor är intratumoral hypoxi, som är frekvent vid GM och en negativ prognostisk och prediktiv faktor förknippad med minskad överlevnad (9,10).

   Nya bevis implicerar en subpopulation av tumörceller med egenskaper hos normala stamceller så kallade gliomstamceller (GSC) i inneboende och förvärvad behandlingsresistens. GSC är utrustade med specifika egenskaper inklusive hög tumörinitierande förmåga, obegränsad självförnyelsepotential och kapacitet för multipotent differentiering, vilket genererar en mångsidig avkomma(11). GSC märks av vanliga stamcellsmarkörer inklusive CD133+, SOX2, Olig1, och har visats finnas i den perivaskulära regionen såväl som i hypoxiska områden. GSC expanderas under hypoxi12beroende på glykolys (13,14).

   I kombination med deras låga spridning, ökade DNA-reparation, höga antioxidantaktivitet och bland annat gör GCS mer motståndskraftig mot konventionella behandlingar (strålning och temozolomid) än icke-GSC (15,16) {Jamal, 2012 #52}.

   Detta innebär att GSC utgör en viktig drivkraft för återfall av GM efter kemoradiation. Det finns för närvarande inga effektiva behandlingar för att eliminera gliomstamceller. Blockering av hypoxisignalering i tumörer (hämmar självförnyelse och överlevnad av GSC-celler)(12,17) och blockering av NOTCH-stamcellsvägen (gör GSC känsliga för strålning(18) och TMZ(19-21)), verkar lovande men Läkemedel som interfererar med dessa vägar har ännu inte gått längre än kliniska prövningar i tidiga faser(22).

   Nuvarande standard för vård av nydiagnostiserade glioblastom är multimodal och består av kirurgi, strålbehandling och TMZ, ett alkyleringsmedel som modifierar purinbaser av DNA (O6-guanin; N7-guanin och N3-adenin). Tillägget av TMZ till strålbehandling har ökat den totala överlevnaden för GM-patienter avsevärt, men bara upp till 14,6 månader(1). Intratumoral hypoxi har visat sig minska den terapeutiska effekten av RT och kemoterapi(23). Hypoxiska GM-celler är genetiskt instabila och visar ökat MGMT-uttryck och därmed resistens mot alkylerande TMZ-kemoterapi(24).

   I icke-GSCs är MGMT-promotormetylering en prediktiv markör för svar på TMZ-behandling (25,26). Tolkningen av MGMT-metyleringsanalysen är dock komplex, eftersom omfattningen av MGMT-promotormetylering i GM är heterogen och nivån av heterogenitet är underskattad, eftersom endast GM-biopsier eller fragmenterad GM-vävnad analyseras (27,28). Viktigt är att MGMT också uttrycks i de normala endotelcellerna i hjärnan och i immunceller inklusive tumörinfiltrerande celler(29). Beroende på omfattningen av normal vävnadskontamination i GM-biopsier kan nivån MGMT-metylering också skilja sig åt.

   Eftersom intratumoral heterogenitet i MGMT-uttryck inte kan objektiveras med för närvarande tillgänglig diagnostik och eftersom underbehandling av patienter hela tiden bör förhindras, får för närvarande de flesta patienter som diagnostiserats med ´de novo´ GM TMZ; även om det verkar vara liten fördel med TMZ i GM:er med MGMT-ometylerade gliomceller.

   Att utforma nya behandlingsprotokoll för nydiagnostiserade glioblastom är ganska komplicerat, eftersom diagnostiska verktyg som förutsäger inter- och intra-GM-heterogenitet av MGMT-promotormetyleringsstatus (eller nivå av MGMT-uttryck) saknas. Dessutom är nivån av MGMT-uttryck, som behövs för signifikant TMZ-svar och förbättring av kliniskt resultat, inte känd. Eftersom de flesta GM definieras av både MGMT-metylerade och MGMT-ometylerade tumörkloner, kan det vara nödvändigt att kombinera TMZ med läkemedel som riktar sig mot icke-metylerade gliomceller/gliomstamceller och/eller mikromiljö.

2. Återkommande glioblastom Även om en makroskopiskt fullständig resektion av en GM kan uppnås, finns tumörceller kvar på resektionsstället. Det har visat sig att GM-celler har en hög kapacitet för spridning. Invaderande tumörceller flyr vid tumörmassans periferi och infiltrerar diffust det normala hjärnparenkymet. Djupt infiltrerade tumörceller är mer benägna att slippa kirurgi och vad som inte är känt är om infiltration är en egenskap hos en mer motståndskraftig cellpopulation som initierar och driver tumörrecidiv. Även efter postoperativ kemoterapi och strålning utanför operationsområdet för att minska infiltrativa tumörceller återkommer nästan all GM, mest runt resektionshålan. Om en total resektion inte kan utföras; primär strålbehandling och kemoterapi kan också minska den klonala mångfalden, men är därmed otillräckliga för att förhindra återfall.

Detta innebär att tumörceller som är resistenta mot flera terapier kvarstår i hjärnparenkymet runt tumörhålan efter total resektion eller i den återstående tumören efter kemoradiation som är ansvariga för tumörrepopulation, vilket gör dem till ett kritiskt mål för att övervinna tumörrecidiv. Genomisk analys av GM har visat att dominanta kloner i återkommande tumörer är sammansatta av kloner som är representativa för den primära tumören såväl som nya kloner med liten likhet med den ursprungliga tumören (3,30,31,32,33). Följaktligen är mål identifierade baserat på analys av primärtumören kanske inte informativa för att identifiera de bästa molekylära målen för att förhindra återfall(5).

Efter misslyckande med första linjens GM-behandling (strålning, TMZ) verkar återfall åtföljas av en fenotypisk förändring av GSC till den mesenkymala (MES) subtypen (förlust av CD133; ökning av BMI1, SOX2 och CD44)(34-38). Sådana celler är mer aggressiva, invasiva och angiogena än primärtumörhärledda GSCs, mestadels den proneurala (PN) subtypen (CD133+, CD15+)(39-41). MES GSC visar också ett högre uttryck av inflammasomgener, såsom IL6, IL8, IL1B1C och CXCL2, vilket förstärker uppfattningen att samspelet med mikromiljön och spelar en viktig roll i återfall och progression(42,43). GM-specifika kliniska prövningar håller på att utvecklas med användning av immunmodulatorer. Det har visat sig att mutationer av MSH (mutS-homolog) korrelerar med TMZ-resistens, eftersom de varken återfinns i före-behandling GM eller strålbehandling efter behandling GM, utan upptäcktes hos ungefär hälften av återkommande GM-patienter som behandlats med TMZ och strålbehandling. Detta indikerar starkt att MSH6-förändringar är associerade med resistens mot alkyleringsmedelsterapi. Således kan GM-patienter som initialt svarar på TMZ få MMR-defekt hypermutatorfenotyp (44-46). Det är väletablerat att en intakt felparningsreparation och basexcisionsreparation (BER) bidrar till effektiv TMZ-cytotoxicitet. Farmakologisk hämning av BER med PARP-hämmare antingen ensamma eller i kombination med TMZ har visat sig lovande i kliniska prövningar. Men förvärvad resistens mot PARP-hämmare observeras genom uppreglering av basexcisionsreparation och homolog rekombinationsreparation för att kompensera för minskad BER (47,48).

Sammanfattningsvis, förståelse av terapiinducerade genetiska och epigenetiska förändringar av de återstående tumörcellerna och GSCs och även inverkan av standardvård på mikromiljön/nisch, där återfall inträffar, kommer att styra utvecklingen av nya behandlingar.

I detta projekt kommer vi att använda patienthärledda gliomstamcellsorganoider(49), som efterliknar de novo GM och dess intratumorala heterogenitet. Även dessa patient-derived organoids (PDO) organoids kommer att användas för att studera förvärvad temozolomidresistens och kan således användas för att identifiera nya målinriktade medel.

Tumörcellsheterogenitet i MGMT-uttryck och dess relevans för TMZ-svar kommer också att tas upp med användning av dessa organoider, med användning av enkelcellsproteomik och IHC för MGMT, GSC-markörer och exomsekvensering (för vanliga drivrutinmutationer) för att identifiera de populationer som klonalt expanderar under TMZ ( RT) urval och de som försvinner.

En annan intressant egenskap som vi kommer att utforska med PDO är möjligheten att analysera supernatanterna för cirkulerande tumör-DNA (ctDNA) eller exosomer (utsöndrade vesiklar som innehåller RNA, litet icke-kodande RNA, proteiner såväl som DNA) innan under efter förvärvad TMZ-resistens som kan leda till identifiering av farmakologisk respons och prediktiva biomarkörer. Sådana biomarkörer "vätskebiopsi" kan bli användbara för att mäta behandlingssvar i blod eller ländvätska hos GM-patienter och möjliggöra dosändring (eskalering eller deintensifiering eller avbrytande).

Utvecklingen av SUB (materialkostnader) kommer att finansieras (607061 PI M. Vooijs, MAASTRO och KWF beviljar Alpe D'Huzes PI M.Vooijs, MAASTRO. Det finns inga extra kostnader förknippade med att skaffa tumörvävnaden.