Organoidi di cellule staminali di glioma derivate dal paziente

I pazienti con glioblastoma (GM) hanno una sopravvivenza globale mediana di circa 15 mesi. La terapia standard per GM comprende la massima resezione chirurgica seguita da radioterapia e chemioterapia con temozolomide (TMZ) (1). Indipendentemente dalla risposta iniziale del tumore, la recidiva del tumore è inevitabile, dopodiché la sopravvivenza scende a meno di 6 mesi. Gli approcci su misura GM mirati agli oncogeni che potrebbero guidare la crescita della maggior parte dei tumori primari, finora non hanno avuto successo negli studi clinici(2), creando un grande bisogno insoddisfatto che giustifica nuovi approcci per superare la resistenza intrinseca e acquisita agli attuali programmi di trattamento. L'obiettivo di questa ricerca è stabilire colture organoidi derivate da pazienti primari da GM per studiare i meccanismi che contribuiscono alla crescita tumorale aggressiva e alla resistenza al trattamento nella GM primaria e ricorrente.

1. Eterogeneità inter e intratumorale nel glioblastoma. Gli approcci su misura del tumore per GM sono ostacolati dall'eterogeneità inter e intratumorale sia del microambiente che delle alterazioni genomiche nelle cellule GM. È stato dimostrato che i tumori sono composti da più cloni che ospitano alterazioni genetiche distinte (3-7). Il modello di evoluzione clonale postula che la formazione del tumore sia iniziata in una cellula di origine ed è seguita dal successivo accumulo di molteplici alterazioni genetiche ed epigenetiche, portando alla sopravvivenza delle cellule tumorali e al vantaggio della crescita (8). Alterazioni genetiche divergenti nelle prime cellule trasformate danno origine a una varietà di cloni sotto la pressione selettiva del microambiente tumorale (3-7). Un importante fattore di stress microambientale è l'ipossia intratumorale, che è frequente nella GM e un fattore prognostico e predittivo negativo associato a una ridotta sopravvivenza (9,10).

   Prove emergenti implicano una sottopopolazione di cellule tumorali con caratteristiche delle cellule staminali normali, le cosiddette cellule staminali del glioma (GSC), nella resistenza al trattamento intrinseca e acquisita. Le GSC sono dotate di proprietà specifiche tra cui un'elevata capacità di iniziare il tumore, un illimitato potenziale di auto-rinnovamento e capacità di differenziazione multipotente, generando una progenie diversificata (11). Le GSC sono contrassegnate da marcatori di cellule staminali comuni tra cui CD133+, SOX2, Olig1 e hanno dimostrato di risiedere nella regione perivascolare e nelle aree ipossiche. Le GSC si espandono sotto ipossia12dipende dalla glicolisi (13,14).

   In combinazione con la loro bassa proliferazione, l'aumento della riparazione del DNA, l'elevata attività antiossidante e, tra gli altri, rendono i GCS più resistenti ai trattamenti convenzionali (radiazioni e temozolomide) rispetto ai non-GSC (15,16) {Jamal, 2012 #52}.

   Ciò implica che le GSC costituiscono un importante motore di recidiva GM dopo chemioradioterapia. Attualmente non esistono trattamenti efficaci per eliminare le cellule staminali del glioma. Il blocco della segnalazione dell'ipossia nei tumori (inibizione dell'auto-rinnovamento e della sopravvivenza delle cellule GSC)(12,17) e il blocco della via delle cellule staminali NOTCH (rendendo le GSC sensibili alle radiazioni(18) e TMZ(19-21)), sembrano promettenti ma i farmaci che interferiscono con questi percorsi non sono ancora andati oltre gli studi clinici in fase iniziale(22).

   L'attuale standard di cura del glioblastoma di nuova diagnosi è multimodale e consiste in chirurgia, radioterapia e TMZ, un agente alchilante che modifica le basi puriniche del DNA (O6-guanina; N7-guanina e N3-adenina). L'aggiunta di TMZ alla radioterapia ha aumentato significativamente la sopravvivenza globale dei pazienti GM, ma solo fino a 14,6 mesi(1). È stato dimostrato che l'ipossia intratumorale diminuisce l'efficacia terapeutica della RT e della chemioterapia(23). Le cellule GM ipossiche sono geneticamente instabili e mostrano una maggiore espressione di MGMT e quindi resistenza alla chemioterapia TMZ alchilante(24).

   Nelle non GSC, la metilazione del promotore MGMT è un marker predittivo per la risposta al trattamento con TMZ (25,26). Tuttavia l'interpretazione del test di metilazione MGMT è complessa, poiché l'estensione della metilazione del promotore MGMT in GM è eterogenea e il livello di eterogeneità è sottovalutato, poiché vengono analizzate solo biopsie GM o tessuto GM frammentato (27,28). È importante sottolineare che MGMT è espresso anche nelle normali cellule endoteliali cerebrali e nelle cellule immunitarie, comprese le cellule infiltranti il ​​tumore (29). Pertanto, a seconda dell'entità della normale contaminazione dei tessuti nelle biopsie GM, anche il livello di metilazione MGMT può variare.

   Poiché l'eterogeneità intratumorale nell'espressione di MGMT non può essere oggettivata utilizzando la diagnostica attualmente disponibile e poiché il sottotrattamento dei pazienti dovrebbe essere evitato in ogni momento, attualmente la maggior parte dei pazienti con diagnosi di GM "de novo" riceve TMZ; sebbene sembri che ci siano pochi benefici di TMZ nei GM con cellule di glioma non metilate MGMT.

   La progettazione di nuovi protocolli di trattamento per il glioblastoma di nuova diagnosi è piuttosto complessa, poiché mancano strumenti diagnostici che prevedano l'eterogeneità inter e intra-GM dello stato di metilazione del promotore MGMT (o livello di espressione di MGMT). Inoltre, non è noto il livello di espressione di MGMT, necessario per una risposta significativa di TMZ e per il miglioramento dell'esito clinico. Pertanto, poiché la maggior parte degli GM è definita da cloni tumorali sia MGMT metilati che MGMT non metilati, potrebbe essere necessario combinare TMZ con farmaci che prendono di mira le cellule di glioma non metilate/cellule staminali di glioma e/o il microambiente.

2. Recidiva del glioblastoma Anche se è possibile ottenere una resezione macroscopicamente completa di un GM, le cellule tumorali rimangono nel sito di resezione. È stato dimostrato che le cellule GM hanno un'elevata capacità di disseminazione. Le cellule tumorali invasori sfuggono alla periferia della massa tumorale e si infiltrano diffusamente nel normale parenchima cerebrale. Le cellule tumorali profondamente infiltrate hanno maggiori probabilità di sfuggire all'intervento chirurgico e ciò che non è noto è se l'infiltrazione sia una proprietà di una popolazione cellulare più resiliente che avvia e guida la recidiva del tumore. Anche dopo la chemioterapia postoperatoria e le radiazioni al di fuori del campo chirurgico per ridurre le cellule tumorali infiltrative, quasi tutti i GM recidivano, principalmente intorno alla cavità di resezione. Se non è possibile eseguire una resezione totale lorda; anche la radioterapia primaria e la chemioterapia sono in grado di ridurre la diversità clonale, ma sono quindi insufficienti per prevenire le recidive.

Ciò implica che le cellule tumorali resistenti a più terapie persistono nel parenchima cerebrale attorno alla cavità tumorale dopo resezione totale grossolana o nel tumore rimanente dopo chemioradioterapia che sono responsabili del ripopolamento tumorale, rendendole un bersaglio critico per superare la recidiva tumorale. L'analisi genomica del GM ha dimostrato che i cloni dominanti nei tumori ricorrenti sono composti da cloni rappresentativi del tumore primario e da nuovi cloni con poca somiglianza con il tumore originale (3,30,31,32,33). Di conseguenza, i bersagli identificati sulla base dell'analisi del tumore primario potrebbero non essere informativi per identificare i migliori bersagli molecolari per prevenire le recidive(5).

Dopo il fallimento del trattamento GM di prima linea (radiazioni, TMZ), la recidiva sembra essere accompagnata da uno spostamento fenotipico delle GSC al sottotipo mesenchimale (MES) (perdita di CD133; aumento di BMI1, SOX2 e CD44) (34-38). Tali cellule sono più aggressive, invasive e angiogeniche rispetto alle GSC derivate dal tumore primario, principalmente il sottotipo proneurale (PN) (CD133+, CD15+)(39-41). MES GSC mostra anche una maggiore espressione dei geni dell'inflammasoma, come IL6, IL8, IL1B1C e CXCL2, rafforzando l'idea che interagisca con il microambiente e svolga un ruolo importante nella recidiva e nella progressione (42,43). Sono in fase di sviluppo sperimentazioni cliniche specifiche per GM, utilizzando modulatori immunitari. È stato dimostrato che le mutazioni MSH (mutS homologue) sono correlate con la resistenza a TMZ, poiché non si trovano né nella GM pre-trattamento né nella GM post-trattamento radioterapico, ma sono state rilevate in circa la metà dei pazienti GM ricorrenti trattati con TMZ e radioterapia. Ciò indica fortemente che le alterazioni di MSH6 sono associate alla resistenza alla terapia con agenti alchilanti. Pertanto, i pazienti GM che inizialmente rispondono a TMZ possono acquisire un fenotipo ipermutatore difettoso MMR (44-46). È ben noto che una riparazione intatta del mismatch e una riparazione per escissione di base (BER) contribuiscono a un'efficace citotossicità di TMZ. L'inibizione farmacologica del BER utilizzando inibitori PARP da soli o in combinazione con TMZ ha mostrato risultati promettenti negli studi clinici. Tuttavia, la resistenza acquisita agli inibitori di PARP si osserva attraverso l'up-regulation della riparazione dell'escissione della base e della riparazione della ricombinazione omologa per compensare la diminuzione del BER (47,48).

In conclusione, la comprensione delle alterazioni genetiche ed epigenetiche indotte dalla terapia delle rimanenti cellule tumorali e GSC e anche l'impatto dello standard di cura sul microambiente/nicchia, in cui si verifica la recidiva, guiderà lo sviluppo di nuovi trattamenti.

In questo progetto utilizzeremo organoidi derivati ​​da cellule staminali di glioma (49), mimando de novo GM e la sua eterogeneità intratumorale. Anche questi organoidi derivati ​​dal paziente (PDO) saranno usati per studiare la resistenza acquisita alla temozolomide e quindi possono essere usati per identificare nuovi agenti mirati.

L'eterogeneità delle cellule tumorali nell'espressione di MGMT e la sua rilevanza per la risposta TMZ saranno affrontate anche utilizzando questi organoidi, utilizzando la proteomica di singola cellula e IHC per MGMT, marcatori GSC e sequenziamento dell'esoma (per mutazioni driver comuni) per identificare quelle popolazioni che si espandono clonalmente sotto TMZ ( RT) selezione e quelli che scompaiono.

Un'altra caratteristica interessante che esploreremo utilizzando il DOP è la possibilità di analizzare i surnatanti per il DNA tumorale circolante (ctDNA) o gli esosomi (vescicole secrete che contengono RNA, piccolo RNA non codificante, proteine ​​e DNA) prima durante dopo la resistenza TMZ acquisita che potrebbe portare all'identificazione della risposta farmacologica e dei biomarcatori predittivi. Tali "biopsie liquide" di biomarcatori possono diventare utili per misurare la risposta al trattamento nel sangue o nel liquido lombare dei pazienti GM e consentire la modifica della dose (aumento o deintensificazione o interruzione).

Lo sviluppo dei PDO (costi dei materiali) sarà finanziato (607061 PI M. Vooijs, MAASTRO e KWF grant Alpe D'Huzes PI M.Vooijs, MAASTRO. Non ci sono costi aggiuntivi associati all'ottenimento del tessuto tumorale.