Organoidy komórek macierzystych glejaka pochodzące od pacjentów

Mediana przeżycia całkowitego pacjentów z glejakiem wielopostaciowym (GM) wynosi około 15 miesięcy. Standardowe leczenie GM obejmuje maksymalną resekcję chirurgiczną, po której następuje radioterapia i chemioterapia z użyciem temozolomidu (TMZ) (1). Niezależnie od początkowej odpowiedzi guza, nawrót nowotworu jest nieunikniony, po czym przeżywalność spada do mniej niż 6 miesięcy. Dostosowane do potrzeb GM podejścia ukierunkowane na onkogeny, które mogą napędzać wzrost większości guzów pierwotnych, jak dotąd nie powiodły się w badaniach klinicznych(2), tworząc dużą niezaspokojoną potrzebę uzasadniającą nowe podejścia do przezwyciężenia wrodzonej i nabytej oporności na obecne schematy leczenia. Celem tych badań jest ustalenie pierwotnych kultur organoidów pochodzących od pacjentów z GM w celu zbadania mechanizmów, które przyczyniają się do agresywnego wzrostu guza i oporności na leczenie w pierwotnym i nawracającym GM.

1. Heterogeniczność między i wewnątrz guza w glejaku wielopostaciowym. Dostosowane do guza podejście do GM jest utrudnione przez heterogeniczność między i wewnątrz guza zarówno mikrośrodowiska, jak i zmian genomowych w komórkach GM. Wykazano, że nowotwory składają się z wielu klonów niosących różne zmiany genetyczne (3-7). Model ewolucji klonalnej zakłada, że ​​tworzenie guza jest inicjowane w komórce pochodzenia, po czym następuje późniejsza akumulacja wielu zmian genetycznych i epigenetycznych, co prowadzi do przeżycia i wzrostu komórek nowotworowych (8). Rozbieżne zmiany genetyczne we wczesnych transformowanych komórkach powodują powstanie różnych klonów pod presją selekcyjną mikrośrodowiska guza (3-7). Ważnym stresorem mikrośrodowiskowym jest niedotlenienie wewnątrz guza, które często występuje w GM i jest negatywnym czynnikiem prognostycznym i predykcyjnym związanym ze zmniejszoną przeżywalnością (9,10).

   Pojawiające się dowody sugerują, że subpopulacja komórek nowotworowych o cechach normalnych komórek macierzystych, tak zwanych komórek macierzystych glejaka (GSC), jest związana z wewnętrzną i nabytą opornością na leczenie. GSC są obdarzone specyficznymi właściwościami, w tym wysoką zdolnością inicjacji nowotworu, nieograniczonym potencjałem samoodnawiania i zdolnością do multipotentnego różnicowania, generując zróżnicowane potomstwo(11). GSC są oznaczone powszechnymi markerami komórek macierzystych, w tym CD133+, SOX2, Olig1, i wykazano, że znajdują się w regionie okołonaczyniowym, jak również w obszarach niedotlenienia. GSC ulegają ekspansji w warunkach niedotlenienia12 w zależności od glikolizy (13,14).

   W połączeniu z ich niską proliferacją, zwiększoną naprawą DNA, wysoką aktywnością przeciwutleniającą i między innymi, czynią GCS bardziej odpornymi na konwencjonalne leczenie (promieniowanie i temozolomid) niż na nie-GSC (15,16) {Jamal, 2012 #52}.

   Oznacza to, że GSC stanowią ważny czynnik napędzający nawrót GM po chemioradioterapii. Obecnie nie ma skutecznych metod leczenia eliminujących komórki macierzyste glejaka. Blokowanie sygnalizacji niedotlenienia w guzach (hamowanie samoodnawiania i przeżycia komórek GSC)(12,17) oraz blokowanie szlaku komórek macierzystych NOTCH (uczynienie GSC wrażliwymi na promieniowanie(18) i TMZ(19-21)), wydaje się obiecujące, ale leki zakłócające te szlaki nie wyszły jeszcze poza badania kliniczne wczesnej fazy(22).

   Obecny standard postępowania z nowo rozpoznanym glejakiem wielopostaciowym jest multimodalny i obejmuje operację, radioterapię oraz TMZ, środek alkilujący modyfikujący zasady purynowe DNA (O6-guanina; N7-guanina i N3-adenina). Dodanie TMZ do radioterapii znacznie zwiększyło całkowite przeżycie pacjentów GM, ale tylko do 14,6 miesiąca(1). Wykazano, że hipoksja wewnątrz guza zmniejsza skuteczność terapeutyczną RT i chemioterapii(23). Niedotlenione komórki GM są genetycznie niestabilne i wykazują zwiększoną ekspresję MGMT, a tym samym oporność na chemioterapię alkilującą TMZ(24).

   W komórkach innych niż GSC metylacja promotora MGMT jest markerem predykcyjnym odpowiedzi na leczenie TMZ(25,26). Jednak interpretacja testu metylacji MGMT jest złożona, ponieważ zakres metylacji promotora MGMT w GM jest niejednorodny, a poziom heterogeniczności jest niedoszacowany, ponieważ analizowane są tylko biopsje GM lub fragmentacja tkanki GM(27,28). Co ważne, MGMT ulega również ekspresji w normalnych komórkach śródbłonka mózgu oraz w komórkach odpornościowych, w tym komórkach naciekających guz(29). Zatem w zależności od stopnia zanieczyszczenia normalnej tkanki w biopsjach GM poziom metylacji MGMT może się również różnić.

   Ponieważ nie można zobiektywizować heterogenności ekspresji MGMT wewnątrz guza za pomocą obecnie dostępnej diagnostyki i ponieważ należy zawsze zapobiegać niedostatecznemu leczeniu pacjentów, obecnie większość pacjentów, u których zdiagnozowano GM „de novo”, otrzymuje TMZ; chociaż wydaje się, że TMZ przynosi niewielkie korzyści w przypadku GM z niemetylowanymi komórkami glejaka MGMT.

   Projektowanie nowych protokołów leczenia nowo zdiagnozowanego glejaka wielopostaciowego jest dość skomplikowane, ponieważ brakuje narzędzi diagnostycznych, które przewidywałyby między- i wewnątrz-GM niejednorodność statusu metylacji promotora MGMT (lub poziomu ekspresji MGMT). Ponadto nie jest znany poziom ekspresji MGMT potrzebny do znaczącej odpowiedzi na TMZ i poprawy wyników klinicznych. Tak więc, ponieważ większość GM jest zdefiniowana przez klony nowotworowe zarówno z metylacją MGMT, jak i niemetylowaną MGMT, konieczne może być połączenie TMZ z lekami ukierunkowanymi na niemetylowane komórki glejaka / komórki macierzyste glejaka i / lub mikrośrodowisko.

2. Nawrót glejaka wielopostaciowego Nawet jeśli można uzyskać makroskopowo całkowitą resekcję GM, komórki nowotworowe pozostają w miejscu resekcji. Wykazano, że komórki GM mają dużą zdolność do rozprzestrzeniania się. Atakujące komórki nowotworowe uciekają na obrzeżach masy guza i dyfuzyjnie naciekają normalny miąższ mózgu. Głęboko naciekające komórki nowotworowe z większym prawdopodobieństwem unikną operacji, a nie wiadomo, czy naciek jest właściwością bardziej odpornej populacji komórek, która inicjuje i napędza nawrót nowotworu. Nawet po chemioterapii pooperacyjnej i radioterapii poza polem operacyjnym w celu zmniejszenia naciekających komórek nowotworowych, prawie wszystkie GM nawracają, głównie wokół jamy po resekcji. Jeśli nie można wykonać całkowitej całkowitej resekcji; pierwotna radioterapia i chemioterapia są również w stanie zmniejszyć różnorodność klonów, ale w związku z tym są niewystarczające, aby zapobiec nawrotom.

Oznacza to, że komórki nowotworowe oporne na wiele terapii utrzymują się w miąższu mózgu wokół jamy guza po całkowitej resekcji guza lub w pozostałym guzie po chemioradioterapii, które są odpowiedzialne za ponowną populację guza, co czyni je krytycznym celem do przezwyciężenia nawrotu guza. Analiza genomowa GM wykazała, że ​​dominujące klony w guzach nawrotowych składają się z klonów reprezentatywnych dla guza pierwotnego, jak również nowych klonów, które są mało podobne do pierwotnego guza(3,30,31,32,33). W konsekwencji cele zidentyfikowane na podstawie analizy guza pierwotnego mogą nie być pouczające dla identyfikacji najlepszych celów molekularnych, aby zapobiec nawrotom(5).

Po niepowodzeniu pierwszego rzutu leczenia GM (promieniowanie, TMZ) nawrotowi wydaje się towarzyszyć przesunięcie fenotypowe GSC do podtypu mezenchymalnego (MES) (utrata CD133; przyrost BMI1, SOX2 i CD44)(34-38). Takie komórki są bardziej agresywne, inwazyjne i angiogenne niż GSC pochodzące z guza pierwotnego, głównie podtyp proneuralny (PN) (CD133+, CD15+)(39-41). MES GSC wykazują również wyższą ekspresję genów inflamasomu, takich jak IL6, IL8, IL1B1C i CXCL2, co potwierdza pogląd, że współgrają one z mikrośrodowiskiem i odgrywają ważną rolę w nawrotach i progresji(42,43). Opracowywane są badania kliniczne specyficzne dla GM z wykorzystaniem modulatorów odporności. Wykazano, że mutacje MSH (homolog mutS) korelują z opornością na TMZ, ponieważ nie występują one ani w GM przed leczeniem, ani w GM po radioterapii, ale zostały wykryte u około połowy pacjentów z nawrotową GM leczonych TMZ i radioterapią. To silnie wskazuje, że zmiany MSH6 są związane z opornością na terapię środkami alkilującymi. Tak więc pacjenci GM, którzy początkowo reagują na TMZ, mogą nabyć fenotyp hipermutatora z defektem MMR(44-46). Dobrze wiadomo, że naprawa nienaruszonych niedopasowań i naprawa przez wycięcie zasady (BER) przyczyniają się do skutecznej cytotoksyczności TMZ. Farmakologiczne hamowanie BER za pomocą inhibitorów PARP, samych lub w połączeniu z TMZ, okazało się obiecujące w badaniach klinicznych. Jednak nabyta oporność na inhibitory PARP jest obserwowana poprzez regulację w górę naprawy przez wycięcie zasad i naprawę rekombinacji homologicznej w celu skompensowania zmniejszonego BER (47,48).

Podsumowując, zrozumienie wywołanych terapią zmian genetycznych i epigenetycznych pozostałych komórek nowotworowych i GSC, a także wpływu standardu opieki na mikrośrodowisko/niszę, w której występuje nawrót, pokieruje rozwojem nowych metod leczenia.

W tym projekcie wykorzystamy organoidy komórek macierzystych glejaka pochodzące od pacjentów(49), naśladując GM de novo i jego heterogeniczność wewnątrz guza. Również te organoidy pochodzące od pacjentów (PDO) będą wykorzystywane do badania nabytej oporności na temozolomid, a zatem mogą być stosowane do identyfikacji nowych środków celowanych.

Heterogeniczność komórek nowotworowych w ekspresji MGMT i jej znaczenie dla odpowiedzi TMZ zostanie również omówiona przy użyciu tych organoidów, przy użyciu proteomiki pojedynczych komórek i IHC dla MGMT, markerów GSC i sekwencjonowania egzomu (w przypadku typowych mutacji kierowców) w celu zidentyfikowania populacji, które klonalnie rozwijają się pod wpływem TMZ ( RT) wybór i te, które znikają.

Inną interesującą cechą, którą będziemy badać za pomocą PDO, jest możliwość analizy supernatantów pod kątem krążącego DNA nowotworu (ctDNA) lub egzosomów (wydzielanych pęcherzyków zawierających RNA, małe niekodujące RNA, białka oraz DNA) przed nabytą opornością na TMZ, która może prowadzić do identyfikacji odpowiedzi farmakologicznej i biomarkerów prognostycznych. Takie biomarkery „płynnej biopsji” mogą stać się przydatne do pomiaru odpowiedzi na leczenie we krwi lub płynie lędźwiowym pacjentów GM i umożliwić modyfikację dawki (eskalacja lub deintensyfikacja lub przerwanie).

Sfinansowany zostanie rozwój PDO (koszty materiałów) (607061 PI M. Vooijs, MASTRO i KWF przyznają Alpe D'Huzes PI M.Vooijs, MASTRO. Pobranie tkanki nowotworowej nie wiąże się z żadnymi dodatkowymi kosztami.