Patiënt-afgeleide glioma stamcelorganoïden

Patiënten met glioblastoom (GM) hebben een mediane totale overleving van ongeveer 15 maanden. Standaardtherapie voor GM omvat maximale chirurgische resectie gevolgd door bestraling en chemotherapie met gebruik van temozolomide (TMZ) (1). Ongeacht de initiële tumorrespons, is tumorrecidief onvermijdelijk, waarna de overleving daalt tot minder dan 6 maanden. Op GM toegesneden benaderingen gericht op oncogenen die de groei van het grootste deel van de primaire tumoren zouden kunnen stimuleren, zijn tot nu toe niet succesvol geweest in klinische onderzoeken(2), waardoor een grote onvervulde behoefte ontstond die nieuwe benaderingen rechtvaardigde om intrinsieke en verworven resistentie tegen de huidige behandelingsschema's te overwinnen. Het doel van dit onderzoek is om primaire patiënt-afgeleide organoïde culturen van GM vast te stellen om mechanismen te bestuderen die bijdragen aan agressieve tumorgroei en behandelingsresistentie in primaire en recidiverende GM.

1. Inter- en intratumorale heterogeniteit bij glioblastoom. Tumorspecifieke benaderingen voor GM worden belemmerd door inter- en intratumorale heterogeniteit van zowel micro-omgeving als genomische veranderingen in GM-cellen. Het is aangetoond dat tumoren zijn samengesteld uit meerdere klonen met verschillende genetische veranderingen (3-7). Het klonale evolutiemodel stelt dat tumorvorming wordt geïnitieerd in een cel van oorsprong en wordt gevolgd door de daaropvolgende accumulatie van meerdere genetische en epigenetische veranderingen, wat leidt tot overleving en groei van tumorcellen (8). Uiteenlopende genetische veranderingen in vroeg getransformeerde cellen leiden tot een verscheidenheid aan klonen onder de selectieve druk van de micro-omgeving van de tumor (3-7). Een belangrijke micro-omgevingsstressor is intratumorale hypoxie, die vaak voorkomt bij GM en een negatieve prognostische en voorspellende factor is die verband houdt met verminderde overleving (9,10).

   Opkomend bewijs impliceert een subpopulatie van tumorcellen met kenmerken van normale stamcellen, de zogenaamde glioomstamcellen (GSC) in intrinsieke en verworven behandelingsresistentie. GSC hebben specifieke eigenschappen, waaronder een hoog tumor-initiërend vermogen, onbeperkt zelfvernieuwingspotentieel en capaciteit voor multipotente differentiatie, waardoor een divers nageslacht wordt gegenereerd(11). GSC worden gemarkeerd door gemeenschappelijke stamcelmarkers, waaronder CD133+, SOX2, Olig1, en er is aangetoond dat ze zich zowel in het perivasculaire gebied als in hypoxische gebieden bevinden. GSC worden uitgebreid onder hypoxie12afhankelijk van glycolyse (13,14).

   Gecombineerd met hun lage proliferatie, verhoogde DNA-reparatie, hoge anti-oxidantactiviteit en onder andere, maken ze GCS beter bestand tegen conventionele behandelingen (straling en temozolomide) dan niet-GSC (15,16) {Jamal, 2012 #52}.

   Dit impliceert dat GSC's een belangrijke aanjager vormen van GM-recidief na chemoradiatie. Er zijn momenteel geen effectieve behandelingen om glioomstamcellen te elimineren. Het blokkeren van hypoxiesignalering in tumoren (het remmen van zelfvernieuwing en overleving van GSC-cellen)(12,17) en het blokkeren van de NOTCH-stamcelroute (het gevoelig maken van GSC's voor straling(18) en TMZ(19-21)), lijkt veelbelovend, maar Geneesmiddelen die deze routes verstoren, zijn nog niet verder gekomen dan klinische proeven in de vroege fase(22).

   De huidige zorgstandaard voor nieuw gediagnosticeerd glioblastoom is multimodaal en bestaat uit chirurgie, bestralingstherapie en TMZ, een alkyleringsmiddel dat de purinebasen van het DNA modificeert (O6-guanine; N7-guanine en N3-adenine). De toevoeging van TMZ aan radiotherapie heeft de algehele overleving van GM-patiënten aanzienlijk vergroot, maar slechts tot 14,6 maanden(1). Van intratumorale hypoxie is aangetoond dat het de therapeutische werkzaamheid van RT en chemotherapie vermindert(23). Hypoxische GM-cellen zijn genetisch onstabiel en vertonen verhoogde MGMT-expressie en daardoor weerstand tegen alkylerende TMZ-chemotherapie(24).

   In niet-GSC's is MGMT-promotormethylering een voorspellende marker voor respons op TMZ-behandeling(25,26). De interpretatie van de MGMT-methylatietest is echter complex, aangezien de mate van MGMT-promotermethylering in GM heterogeen is en het niveau van heterogeniteit wordt onderschat, aangezien alleen GM-biopsieën of gefragmenteerd GM-weefsel worden geanalyseerd(27,28). Belangrijk is dat MGMT ook tot expressie wordt gebracht in de normale endotheelcellen van de hersenen en in immuuncellen, waaronder tumor-infiltrerende cellen(29). Dus afhankelijk van de mate van normale weefselbesmetting in GM-biopten kan het niveau van MGMT-methylatie ook verschillen.

   Aangezien intra-tumorale heterogeniteit in MGMT-expressie niet kan worden geobjectiveerd met behulp van de momenteel beschikbare diagnostiek en aangezien onderbehandeling van patiënten te allen tijde moet worden voorkomen, ontvangen momenteel de meeste patiënten met de diagnose 'de novo' GM TMZ; hoewel er weinig voordeel lijkt te zijn van TMZ bij GM's met MGMT-ongemethyleerde glioomcellen.

   Het ontwerpen van nieuwe behandelingsprotocollen voor nieuw gediagnosticeerd glioblastoom is behoorlijk complex, aangezien diagnostische hulpmiddelen, die inter- en intra-GM-heterogeniteit van de MGMT-promotermethyleringsstatus (of het niveau van MGMT-expressie) voorspellen, ontbreken. Bovendien is het niveau van MGMT-expressie, dat nodig is voor een significante TMZ-respons en verbetering van de klinische uitkomst, niet bekend. Aangezien de meeste GM's dus worden gedefinieerd door zowel MGMT-gemethyleerde als MGMT-niet-gemethyleerde tumorklonen, kan het nodig zijn om TMZ te combineren met geneesmiddelen die zich richten op niet-gemethyleerde glioomcellen/glioomstamcellen en/of micro-omgeving.

2. Glioblastoma-recidief Zelfs als een macroscopisch volledige resectie van een GM kan worden bereikt, blijven tumorcellen op de resectieplaats. Het is aangetoond dat GM-cellen een hoge verspreidingscapaciteit hebben. Binnendringende tumorcellen ontsnappen aan de periferie van de tumormassa en infiltreren diffuus in het normale hersenparenchym. Diep geïnfiltreerde tumorcellen zullen eerder aan een operatie ontsnappen en wat niet bekend is, is of infiltratie een eigenschap is van een meer veerkrachtige celpopulatie die tumorherhaling initieert en stimuleert. Zelfs na postoperatieve chemotherapie en bestraling buiten het operatiegebied om infiltratieve tumorcellen te verminderen, komen bijna alle GM terug, meestal rond de resectieholte. Als een bruto totale resectie niet kan worden uitgevoerd; primaire radiotherapie en chemotherapie kunnen ook de klonale diversiteit verminderen, maar zijn dus onvoldoende om herhaling te voorkomen.

Dit houdt in dat tumorcellen die resistent zijn tegen meerdere therapieën blijven bestaan ​​in het hersenparenchym rond de tumorholte na totale resectie of in de resterende tumor na chemoradiatie, die verantwoordelijk zijn voor herpopulatie van de tumor, waardoor ze een cruciaal doelwit zijn om tumorrecidief te overwinnen. Genomische analyse van GM heeft aangetoond dat dominante klonen in recidiverende tumoren zijn samengesteld uit klonen die representatief zijn voor de primaire tumor en uit nieuwe klonen die weinig lijken op de oorspronkelijke tumor(3,30,31,32,33). Bijgevolg kunnen doelen die zijn geïdentificeerd op basis van de analyse van de primaire tumor niet informatief zijn om de beste moleculaire doelen te identificeren om herhaling te voorkomen(5).

Na het mislukken van eerstelijns GM-behandeling (bestraling, TMZ), lijkt recidief gepaard te gaan met een fenotypische verschuiving van GSC's naar het mesenchymale (MES) subtype (verlies van CD133; winst van BMI1, SOX2 en CD44)(34-38). Dergelijke cellen zijn agressiever, invasiever en angiogener dan GSC's afkomstig van primaire tumoren, meestal het Proneurale (PN) subtype (CD133+, CD15+)(39-41). MES GSC vertoont ook een hogere expressie van de ontstekingsgenen, zoals IL6, IL8, IL1B1C en CXCL2, wat het idee versterkt dat er een wisselwerking is met de micro-omgeving en dat het een belangrijke rol speelt bij recidief en progressie (42,43). GGO-specifieke klinische proeven worden ontwikkeld, waarbij gebruik wordt gemaakt van immuunmodulatoren. Het is aangetoond dat MSH-mutaties (mutS homoloog) correleren met TMZ-resistentie, aangezien ze niet worden gevonden in GM vóór de behandeling of in radiotherapie na de behandeling, maar werden gedetecteerd bij ongeveer de helft van de recidiverende GM-patiënten die werden behandeld met TMZ en radiotherapie. Dit geeft sterk aan dat MSH6-veranderingen verband houden met resistentie tegen therapie met alkylerende middelen. GM-patiënten die in eerste instantie op TMZ reageren, kunnen dus een MMR-defect hypermutator-fenotype krijgen(44-46). Het is algemeen bekend dat een intacte mismatch-reparatie en base-excisie-reparatie (BER) bijdragen aan effectieve TMZ-cytotoxiciteit. Farmacologische remming van BER met behulp van PARP-remmers, alleen of in combinatie met TMZ, is veelbelovend gebleken in klinische onderzoeken. Verworven resistentie tegen PARP-remmers wordt echter waargenomen door opwaartse regulatie van base-excisieherstel en homoloog recombinatieherstel om verminderde BER te compenseren (47,48).

Concluderend zal het begrijpen van de door therapie veroorzaakte genetische en epigenetische veranderingen van de resterende tumorcellen en GSC's en ook de impact van standaardzorg op de micro-omgeving / niche, waarin recidief optreedt, leidend zijn bij de ontwikkeling van nieuwe behandelingen.

In dit project zullen we organoïden van glioomstamcellen van patiënten gebruiken(49), waarmee we de novo GM en zijn intratumorale heterogeniteit nabootsen. Ook deze van patiënten afgeleide organoïden (PDO's) zullen worden gebruikt om verworven temozolomideresistentie te bestuderen en kunnen dus worden gebruikt voor het identificeren van nieuwe doelgerichte middelen.

Tumorcelheterogeniteit in MGMT-expressie en de relevantie ervan voor TMZ-respons zullen ook worden aangepakt met behulp van deze organoïden, met behulp van eencellige proteomics en IHC voor MGMT, GSC-markers en exome-sequencing (voor algemene driver-mutaties) om die populaties te identificeren die klonaal uitbreiden onder TMZ ( RT) selectie en degenen die verdwijnen.

Een ander interessant kenmerk dat we zullen onderzoeken met behulp van PDO, is de mogelijkheid om de supernatanten te analyseren op circulerend tumor-DNA (ctDNA) of exosomen (uitgescheiden blaasjes die RNA, klein niet-coderend RNA, eiwitten en DNA bevatten) voor tijdens na verworven TMZ-resistentie die kan leiden tot de identificatie van farmacologische respons en voorspellende biomarkers. Dergelijke biomarkers 'vloeibare biopsie' kunnen nuttig worden om de behandelingsrespons in bloed of lumbale vloeistof van GM-patiënten te meten en dosisaanpassing mogelijk te maken (escalatie of de-intensificatie of beëindiging).

De ontwikkeling van de BOB's (materiaalkosten) wordt gefinancierd (607061 PI M. Vooijs, MAASTRO en KWF subsidie ​​Alpe D'Huzes PI M. Vooijs, MAASTRO. Er zijn geen extra kosten verbonden aan het verkrijgen van het tumorweefsel.