Organoïdes de cellules souches de gliome dérivés de patients

Les patients atteints de glioblastome (GM) ont une survie globale médiane d'environ 15 mois. Le traitement standard du GM comprend une résection chirurgicale maximale suivie d'une radiothérapie et d'une chimiothérapie utilisant le témozolomide (TMZ) (1). Indépendamment de la réponse tumorale initiale, la récidive tumorale est inévitable, après quoi la survie chute à moins de 6 mois. Les approches adaptées aux OGM ciblant les oncogènes susceptibles de stimuler la croissance de la majeure partie des tumeurs primaires ont jusqu'à présent échoué dans les essais cliniques(2), créant un important besoin non satisfait justifiant de nouvelles approches pour surmonter la résistance intrinsèque et acquise aux schémas thérapeutiques actuels. L'objectif de cette recherche est d'établir des cultures organoïdes dérivées de patients primaires à partir de GM pour étudier les mécanismes qui contribuent à la croissance tumorale agressive et à la résistance au traitement chez les GM primaires et récurrents.

1. Hétérogénéité inter et intratumorale dans le glioblastome. Les approches adaptées aux tumeurs pour GM sont entravées par l'hétérogénéité inter et intratumorale du microenvironnement et des altérations génomiques dans les cellules GM. Il a été démontré que les tumeurs sont composées de multiples clones portant des altérations génétiques distinctes (3-7). Le modèle d'évolution clonale postule que la formation tumorale est initiée dans une cellule d'origine et est suivie par l'accumulation ultérieure de multiples altérations génétiques et épigénétiques, conduisant à la survie des cellules tumorales et à l'avantage de la croissance (8). Des altérations génétiques divergentes dans les premières cellules transformées donnent lieu à une variété de clones sous la pression sélective du microenvironnement tumoral (3-7). Un facteur de stress microenvironnemental important est l'hypoxie intratumorale, qui est fréquente chez les GM et un facteur pronostique et prédictif négatif associé à une survie réduite (9,10).

   De nouvelles preuves impliquent une sous-population de cellules tumorales présentant des caractéristiques de cellules souches normales, appelées cellules souches de gliome (GSC), dans la résistance intrinsèque et acquise au traitement. Les GSC sont dotées de propriétés spécifiques, notamment une capacité élevée d'initiation de tumeurs, un potentiel d'auto-renouvellement illimité et une capacité de différenciation multipotente, générant une descendance diversifiée (11). Les GSC sont marquées par des marqueurs de cellules souches communs, notamment CD133 +, SOX2, Olig1, et il a été démontré qu'elles résident dans la région périvasculaire ainsi que dans les zones hypoxiques. Les CGC sont élargies sous hypoxie12 dépendent de la glycolyse (13,14).

   Combinés à leur faible prolifération, leur réparation accrue de l'ADN, leur activité anti-oxydante élevée et entre autres, ils rendent les GCS plus résistants aux traitements conventionnels (radiothérapie et témozolomide) que les non-GSC (15,16) {Jamal, 2012 #52}.

   Cela implique que les GSC constituent un facteur important de récidive de GM après la chimioradiothérapie. Il n'existe actuellement aucun traitement efficace pour éliminer les cellules souches du gliome. Le blocage de la signalisation de l'hypoxie dans les tumeurs (inhibant l'auto-renouvellement et la survie des cellules GSC)(12,17) et le blocage de la voie des cellules souches NOTCH (rendant les GSC sensibles aux radiations(18) et TMZ(19-21)), semblent prometteurs mais les médicaments interférant avec ces voies n'ont pas encore dépassé les stades précoces des essais cliniques(22).

   La norme actuelle de soins du glioblastome nouvellement diagnostiqué est multimodale et comprend la chirurgie, la radiothérapie et le TMZ, un agent alkylant modifiant les bases puriques de l'ADN (O6-guanine ; N7-guanine et N3-adénine). L'ajout du TMZ à la radiothérapie a augmenté de manière significative la survie globale des patients GM, mais seulement jusqu'à 14,6 mois(1). Il a été démontré que l'hypoxie intratumorale diminue l'efficacité thérapeutique de la radiothérapie et de la chimiothérapie(23). Les cellules GM hypoxiques sont génétiquement instables et présentent une expression accrue de MGMT et, par conséquent, une résistance à la chimiothérapie alkylante TMZ (24).

   Dans les non-GSC, la méthylation du promoteur MGMT est un marqueur prédictif de la réponse au traitement au TMZ(25,26). Cependant, l'interprétation du test de méthylation MGMT est complexe, car l'étendue de la méthylation du promoteur MGMT dans le GM est hétérogène et le niveau d'hétérogénéité est sous-estimé, puisque seules les biopsies GM ou le tissu GM fragmenté sont analysés (27,28). Il est important de noter que la MGMT est également exprimée dans les cellules endothéliales cérébrales normales et dans les cellules immunitaires, y compris les cellules infiltrant les tumeurs(29). Ainsi, selon l'étendue de la contamination des tissus normaux dans les biopsies GM, le niveau de méthylation MGMT peut également différer.

   Étant donné que l'hétérogénéité intra-tumorale de l'expression de MGMT ne peut être objectivée à l'aide des diagnostics actuellement disponibles et qu'il convient d'éviter à tout moment le sous-traitement des patients, la plupart des patients actuellement diagnostiqués avec un GM "de novo" reçoivent du TMZ ; bien qu'il semble y avoir peu d'avantages du TMZ chez les GM avec des cellules de gliome non méthylées MGMT.

   La conception de nouveaux protocoles de traitement pour le glioblastome nouvellement diagnostiqué est assez complexe, car les outils de diagnostic, prédisant l'hétérogénéité inter et intra-GM du statut de méthylation du promoteur MGMT (ou niveau d'expression de MGMT), font défaut. De plus, le niveau d'expression de MGMT, nécessaire pour une réponse TMZ significative et une amélioration des résultats cliniques, n'est pas connu. Ainsi, étant donné que la plupart des GM sont définis à la fois par des clones tumoraux MGMT méthylés et MGMT non méthylés, il pourrait être nécessaire de combiner TMZ avec des médicaments qui ciblent les cellules de gliome non méthylées/cellules souches de gliome et/ou le microenvironnement.

2. Récidive de glioblastome Même si une résection macroscopiquement complète d'un GM peut être réalisée, les cellules tumorales restent au site de résection. Il a été démontré que les cellules GM ont une grande capacité de dissémination. Les cellules tumorales envahissantes s'échappent à la périphérie de la masse tumorale et infiltrent de manière diffuse le parenchyme cérébral normal. Les cellules tumorales profondément infiltrées sont plus susceptibles d'échapper à la chirurgie et ce qui n'est pas connu, c'est si l'infiltration est une propriété d'une population cellulaire plus résistante qui initie et entraîne la récurrence de la tumeur. Même après une chimiothérapie postopératoire et une radiothérapie en dehors du champ opératoire pour réduire les cellules tumorales infiltrantes, presque tous les GM réapparaissent, principalement autour de la cavité de résection. Si une résection totale brute ne peut pas être effectuée ; la radiothérapie primaire et la chimiothérapie sont également capables de réduire la diversité clonale, mais sont donc insuffisantes pour prévenir les récidives.

Cela implique que les cellules tumorales résistantes aux thérapies multiples persistent dans le parenchyme cérébral autour de la cavité tumorale après résection totale brute ou dans la tumeur restante après chimioradiothérapie qui sont responsables du repeuplement tumoral, ce qui en fait une cible critique pour surmonter la récidive tumorale. L'analyse génomique de GM a montré que les clones dominants dans les tumeurs récurrentes sont composés de clones représentatifs de la tumeur primaire ainsi que de nouveaux clones présentant peu de ressemblance avec la tumeur d'origine(3,30,31,32,33). Par conséquent, les cibles identifiées sur la base de l'analyse de la tumeur primaire peuvent ne pas être informatives pour identifier les meilleures cibles moléculaires pour prévenir la récidive (5).

Après échec d'un traitement GM de première intention (radiothérapie, TMZ), la récidive semble s'accompagner d'un basculement phénotypique des GSC vers le sous-type mésenchymateux (MES) (perte de CD133 ; gain d'IMC1, SOX2 et CD44)(34-38). Ces cellules sont plus agressives, invasives et angiogéniques que les GSC dérivées de tumeurs primaires, principalement le sous-type proneural (PN) (CD133+, CD15+)(39-41). MES GSC montrent également une expression plus élevée des gènes de l'inflammasome, tels que IL6, IL8, IL1B1C et CXCL2, renforçant la notion que l'interaction avec le microenvironnement et joue un rôle important dans la récurrence et la progression (42,43). Des essais cliniques spécifiques aux OGM sont en cours de développement, utilisant des modulateurs immunitaires. Il a été démontré que les mutations MSH (homologue mutS) sont corrélées à la résistance au TMZ, car elles ne se trouvent ni dans le GM avant traitement ni dans le GM post-traitement par radiothérapie, mais ont été détectées chez environ la moitié des patients GM récurrents traités par TMZ et radiothérapie. Cela indique fortement que les altérations de MSH6 sont associées à une résistance au traitement par agent alkylant. Ainsi, les patients GM qui répondent initialement au TMZ peuvent acquérir un phénotype hypermutateur déficient en MMR (44-46). Il est bien établi qu'une réparation de mésappariement intacte et une réparation par excision de base (BER) contribuent à une cytotoxicité efficace du TMZ. L'inhibition pharmacologique du BER à l'aide d'inhibiteurs de PARP seuls ou en association avec le TMZ s'est révélée prometteuse dans les essais cliniques. Cependant, une résistance acquise aux inhibiteurs de PARP est observée par une régulation à la hausse de la réparation par excision de base et de la réparation par recombinaison homologue pour compenser la diminution du BER (47,48).

En conclusion, la compréhension des altérations génétiques et épigénétiques induites par la thérapie des cellules tumorales restantes et des GSC ainsi que l'impact de la norme de soins sur le microenvironnement/niche, dans lequel la récidive se produit, guidera le développement de nouveaux traitements.

Dans ce projet, nous utiliserons des organoïdes de cellules souches de gliome dérivées de patients(49), imitant le GM de novo et son hétérogénéité intratumorale. De plus, ces organoïdes dérivés de patients (PDO) seront utilisés pour étudier la résistance acquise au témozolomide et pourront donc être utilisés pour identifier de nouveaux agents ciblés.

L'hétérogénéité des cellules tumorales dans l'expression de MGMT et sa pertinence pour la réponse TMZ seront également abordées à l'aide de ces organoïdes, en utilisant la protéomique unicellulaire et l'IHC pour MGMT, les marqueurs GSC et le séquençage de l'exome (pour les mutations conductrices courantes) pour identifier les populations qui se développent par clonage sous TMZ ( RT) sélection et celles qui disparaissent.

Une autre caractéristique intéressante que nous explorerons à l'aide de PDO est la possibilité d'analyser les surnageants pour l'ADN tumoral circulant (ctDNA) ou les exosomes (vésicules sécrétées qui contiennent de l'ARN, du petit ARN non codant, des protéines ainsi que de l'ADN) avant pendant après la résistance acquise au TMZ qui pourrait conduire à l'identification d'une réponse pharmacologique et de biomarqueurs prédictifs. Ces biomarqueurs « biopsie liquide » peuvent devenir utiles pour mesurer la réponse au traitement dans le sang ou le liquide lombaire des patients GM et permettre une modification de la dose (augmentation ou désintensification ou arrêt).

Le développement des PDO (coûts des matériaux) sera financé (607061 PI M. Vooijs, MAASTRO et subvention KWF Alpe D'Huzes PI M.Vooijs, MAASTRO. Il n'y a pas de coûts supplémentaires associés à l'obtention du tissu tumoral.