Organoides de células madre de glioma derivados de pacientes

Los pacientes con glioblastoma (GM) tienen una mediana de supervivencia general de aproximadamente 15 meses. La terapia estándar para GM abarca la resección quirúrgica máxima seguida de radiación y quimioterapia con temozolomida (TMZ) (1). Independientemente de la respuesta tumoral inicial, la recurrencia del tumor es inevitable, después de lo cual la supervivencia se reduce a menos de 6 meses. Los enfoques personalizados de GM dirigidos a oncogenes que podrían impulsar el crecimiento de la mayor parte de los tumores primarios no han tenido éxito hasta ahora en ensayos clínicos(2), creando una gran necesidad insatisfecha que justifica nuevos enfoques para superar la resistencia intrínseca y adquirida a los programas de tratamiento actuales. El objetivo de esta investigación es establecer cultivos de organoides derivados de pacientes primarios de GM para estudiar los mecanismos que contribuyen al crecimiento tumoral agresivo y la resistencia al tratamiento en GM primario y recurrente.

1. Heterogeneidad inter e intratumoral en glioblastoma. Los enfoques adaptados al tumor para GM se ven obstaculizados por la heterogeneidad inter e intratumoral del microambiente y las alteraciones genómicas en las células GM. Se ha demostrado que los tumores están compuestos por múltiples clones que albergan distintas alteraciones genéticas (3-7). El modelo de evolución clonal postula que la formación del tumor se inicia en una célula de origen y es seguida por la posterior acumulación de múltiples alteraciones genéticas y epigenéticas, lo que lleva a la supervivencia de la célula tumoral y a la ventaja del crecimiento (8). Las alteraciones genéticas divergentes en las células transformadas tempranas dan lugar a una variedad de clones bajo la presión selectiva del microambiente tumoral (3-7). Un estresor microambiental importante es la hipoxia intratumoral, que es frecuente en GM y un factor pronóstico y predictivo negativo asociado con una supervivencia reducida (9,10).

   La evidencia emergente implica a una subpoblación de células tumorales con características de células madre normales, las llamadas células madre de glioma (GSC, por sus siglas en inglés) en la resistencia intrínseca y adquirida al tratamiento. Las GSC están dotadas de propiedades específicas que incluyen una alta capacidad de iniciar tumores, un potencial de autorrenovación ilimitado y capacidad de diferenciación multipotente, generando una progenie diversa(11). Las GSC están marcadas por marcadores comunes de células madre, incluidos CD133+, SOX2, Olig1, y se ha demostrado que residen en la región perivascular, así como en áreas hipóxicas. Las GSC se expanden en condiciones de hipoxia12 y dependen de la glucólisis (13,14).

   En combinación con su baja proliferación, mayor reparación del ADN, alta actividad antioxidante y, entre otros, hacen que las GCS sean más resistentes a los tratamientos convencionales (radiación y temozolomida) que a las no GSC (15,16) {Jamal, 2012 #52}.

   Esto implica que las GSC forman un importante impulsor de la recurrencia de GM después de la quimiorradiación. Actualmente no existen tratamientos efectivos para eliminar las células madre del glioma. El bloqueo de la señalización de hipoxia en los tumores (inhibiendo la autorrenovación y la supervivencia de las células GSC)(12,17) y el bloqueo de la vía de las células madre NOTCH (haciendo que las GSC sean sensibles a la radiación(18) y TMZ(19-21)), parecen prometedores pero los fármacos que interfieren con estas vías aún no han superado los ensayos clínicos de fase inicial(22).

   El estándar actual de atención del glioblastoma recién diagnosticado es multimodal y consiste en cirugía, radioterapia y TMZ, un agente alquilante que modifica las bases de purina del ADN (O6-guanina, N7-guanina y N3-adenina). La adición de TMZ a la radioterapia ha aumentado significativamente la supervivencia global de los pacientes con GM, pero solo hasta 14,6 meses(1). Se ha demostrado que la hipoxia intratumoral disminuye la eficacia terapéutica de la RT y la quimioterapia(23). Las células GM hipóxicas son genéticamente inestables y muestran una mayor expresión de MGMT y, por lo tanto, resistencia a la quimioterapia alquilante TMZ (24).

   En las no GSC, la metilación del promotor de MGMT es un marcador predictivo de respuesta al tratamiento con TMZ(25,26). Sin embargo, la interpretación del ensayo de metilación de MGMT es compleja, ya que el grado de metilación del promotor de MGMT en GM es heterogéneo y el nivel de heterogeneidad se subestima, ya que solo se analizan biopsias de MG o tejido GM fragmentado (27,28). Es importante señalar que la MGMT también se expresa en las células endoteliales cerebrales normales y en las células inmunitarias, incluidas las células infiltrantes de tumores(29). Por lo tanto, dependiendo del grado de contaminación del tejido normal en las biopsias GM, el nivel de metilación de MGMT también puede diferir.

   Dado que la heterogeneidad intratumoral en la expresión de MGMT no se puede objetivar utilizando los diagnósticos disponibles en la actualidad y dado que se debe evitar en todo momento el tratamiento insuficiente de los pacientes, en la actualidad la mayoría de los pacientes diagnosticados con GM "de novo" reciben TMZ; aunque parece haber poco beneficio de TMZ en GM con células de glioma no metiladas MGMT.

   El diseño de nuevos protocolos de tratamiento para el glioblastoma recién diagnosticado es bastante complejo, ya que se carece de herramientas de diagnóstico que predigan la heterogeneidad inter e intra-GM del estado de metilación del promotor de MGMT (o nivel de expresión de MGMT). Además, se desconoce el nivel de expresión de MGMT, necesario para una respuesta significativa de TMZ y una mejora del resultado clínico. Por lo tanto, dado que la mayoría de los GM están definidos por clones tumorales MGMT metilados y MGMT no metilados, podría ser necesario combinar TMZ con medicamentos que se dirijan a células de glioma no metiladas/células madre de glioma y/o microambiente.

2. Recurrencia de glioblastoma Incluso si se puede lograr una resección macroscópicamente completa de un GM, las células tumorales permanecen en el sitio de resección. Se ha demostrado que las células GM tienen una alta capacidad de diseminación. Las células tumorales invasoras escapan por la periferia de la masa tumoral y se infiltran de forma difusa en el parénquima cerebral normal. Es más probable que las células tumorales profundamente infiltradas escapen a la cirugía y lo que no se sabe es si la infiltración es una propiedad de una población celular más resistente que inicia e impulsa la recurrencia del tumor. Incluso después de la quimioterapia posoperatoria y la radiación fuera del campo de la cirugía para reducir las células tumorales infiltrantes, casi todos los GM recurren, principalmente alrededor de la cavidad de resección. Si no se puede realizar una resección total bruta; la radioterapia primaria y la quimioterapia también pueden reducir la diversidad clonal, pero por lo tanto son insuficientes para prevenir la recurrencia.

Esto implica que las células tumorales resistentes a múltiples terapias persisten en el parénquima cerebral alrededor de la cavidad tumoral después de la resección total macroscópica o en el tumor remanente después de la quimiorradioterapia, que son responsables de la repoblación tumoral, lo que las convierte en un objetivo crítico para superar la recurrencia del tumor. El análisis genómico de GM ha demostrado que los clones dominantes en los tumores recurrentes están compuestos por clones representativos del tumor primario, así como por clones nuevos con poca semejanza con el tumor original (3,30,31,32,33). En consecuencia, los objetivos identificados con base en el análisis del tumor primario pueden no ser informativos para identificar los mejores objetivos moleculares para prevenir la recurrencia(5).

Después del fracaso del tratamiento de primera línea con GM (radiación, TMZ), la recurrencia parece ir acompañada de un cambio fenotípico de las GSC al subtipo mesenquimatoso (MES) (pérdida de CD133; ganancia de BMI1, SOX2 y CD44)(34-38). Estas células son más agresivas, invasivas y angiogénicas que las GSC derivadas de tumores primarios, principalmente del subtipo proneural (PN) (CD133+, CD15+)(39-41). MES GSC también muestra una mayor expresión de los genes del inflamasoma, como IL6, IL8, IL1B1C y CXCL2, lo que refuerza la noción de que interactúan con el microambiente y desempeñan un papel importante en la recurrencia y progresión(42,43). Se están desarrollando ensayos clínicos específicos de transgénicos, utilizando inmunomoduladores. Se ha demostrado que las mutaciones de MSH (homólogo de mutS) se correlacionan con la resistencia a TMZ, ya que no se encuentran en el GM previo al tratamiento ni en el GM posterior al tratamiento con radioterapia, pero se detectaron en aproximadamente la mitad de los pacientes con GM recurrente tratados con TMZ y radioterapia. Esto indica fuertemente que las alteraciones de MSH6 están asociadas con la resistencia a la terapia con agentes alquilantes. Por lo tanto, los pacientes GM que responden inicialmente a TMZ pueden adquirir un fenotipo hipermutador defectuoso de MMR (44-46). Está bien establecido que una reparación de desajuste intacta y una reparación por escisión de base (BER) contribuyen a la citotoxicidad efectiva de TMZ. La inhibición farmacológica de BER usando inhibidores de PARP solos o en combinación con TMZ se ha mostrado prometedora en ensayos clínicos. Sin embargo, la resistencia adquirida a los inhibidores de PARP se observa a través de la regulación al alza de la reparación por escisión de bases y la reparación por recombinación homóloga para compensar la disminución de la BER (47,48).

En conclusión, comprender las alteraciones genéticas y epigenéticas inducidas por la terapia de las células tumorales restantes y las GSC y también el impacto del estándar de atención en el microambiente/nicho, en el que se produce la recurrencia, guiará el desarrollo de nuevos tratamientos.

En este proyecto utilizaremos organoides de células madre de glioma derivadas de pacientes(49), imitando el GM de novo y su heterogeneidad intratumoral. Además, estos organoides derivados del paciente (PDO) se utilizarán para estudiar la resistencia adquirida a la temozolomida y, por lo tanto, se pueden utilizar para identificar nuevos agentes dirigidos.

La heterogeneidad de las células tumorales en la expresión de MGMT y su relevancia para la respuesta de TMZ también se abordará utilizando estos organoides, usando proteómica de células individuales e IHC para MGMT, marcadores GSC y secuenciación del exoma (para mutaciones impulsoras comunes) para identificar aquellas poblaciones que se expanden clonalmente bajo TMZ ( RT) selección y los que desaparecen.

Otra característica interesante que exploraremos usando PDO es la posibilidad de analizar los sobrenadantes en busca de ADN tumoral circulante (ctDNA) o exosomas (vesículas secretadas que contienen ARN, ARN pequeño no codificante, proteínas y ADN) antes y después de la resistencia adquirida a TMZ que podría conducir a la identificación de la respuesta farmacológica y biomarcadores predictivos. Dichos biomarcadores de 'biopsia líquida' pueden volverse útiles para medir la respuesta al tratamiento en sangre o líquido lumbar de pacientes GM y permitir la modificación de la dosis (escalada o desintensificación o terminación).

Se financiará el desarrollo de los PDO (costes de materiales) (607061 PI M. Vooijs, MAASTRO y KWF subvención Alpe D'Huzes PI M.Vooijs, MAASTRO. No hay costos adicionales asociados con la obtención del tejido tumoral.