Organoides de células-tronco de glioma derivados de pacientes

Pacientes com glioblastoma (GM) têm uma sobrevida global mediana de aproximadamente 15 meses. A terapia padrão para GM abrange ressecção cirúrgica máxima seguida de radiação e quimioterapia usando temozolomida (TMZ) (1). Independentemente da resposta inicial do tumor, a recorrência do tumor é inevitável, após o que a sobrevida cai para menos de 6 meses. Abordagens personalizadas de GM visando oncogenes que podem impulsionar o crescimento da maior parte dos tumores primários não tiveram sucesso até agora em ensaios clínicos (2), criando uma grande necessidade não atendida que justifica novas abordagens para superar a resistência intrínseca e adquirida aos esquemas de tratamento atuais. O objetivo desta pesquisa é estabelecer culturas organoides derivadas de pacientes primários de GM para estudar os mecanismos que contribuem para o crescimento tumoral agressivo e resistência ao tratamento em GM primário e recorrente.

1. Heterogeneidade inter e intratumoral no glioblastoma. Abordagens adaptadas ao tumor para GM estão sendo dificultadas pela heterogeneidade inter e intratumoral tanto do microambiente quanto das alterações genômicas nas células GM. Foi demonstrado que os tumores são compostos de múltiplos clones que abrigam alterações genéticas distintas (3-7). O modelo de evolução clonal postula que a formação do tumor é iniciada em uma célula de origem e é seguida pelo acúmulo subsequente de múltiplas alterações genéticas e epigenéticas, levando à sobrevivência da célula tumoral e vantagem de crescimento (8). Alterações genéticas divergentes em células transformadas precocemente dão origem a uma variedade de clones sob a pressão seletiva do microambiente tumoral (3-7). Um importante estressor microambiental é a hipóxia intratumoral, que é frequente na GM e um fator prognóstico e preditivo negativo associado à redução da sobrevida (9,10).

   Evidências emergentes implicam uma subpopulação de células tumorais com características de células-tronco normais, chamadas células-tronco de glioma (GSC), na resistência intrínseca e adquirida ao tratamento. As GSC são dotadas de propriedades específicas, incluindo alta capacidade de iniciação tumoral, potencial ilimitado de autorrenovação e capacidade de diferenciação multipotente, gerando uma progênie diversa(11). As GSC são marcadas por marcadores comuns de células-tronco, incluindo CD133+, SOX2, Olig1, e demonstraram residir na região perivascular, bem como em áreas hipóxicas. As GSC são expandidas sob hipóxia12, dependendo da glicólise (13,14).

   Combinado com sua baixa proliferação, aumento do reparo do DNA, alta atividade antioxidante e entre outros, tornam o GCS mais resistente aos tratamentos convencionais (radiação e temozolomida) do que não GSC (15,16) {Jamal, 2012 # 52}.

   Isso implica que as GSCs formam um importante fator de recorrência de GM após a quimiorradiação. Atualmente, não existem tratamentos eficazes para eliminar as células-tronco do glioma. Bloquear a sinalização de hipóxia em tumores (inibindo a auto-renovação e a sobrevivência das células GSC)(12,17) e bloqueando a via de células-tronco NOTCH (tornando GSCs sensíveis à radiação(18) e TMZ(19-21)), parecem promissores, mas as drogas que interferem com essas vias ainda não passaram dos ensaios clínicos em fase inicial(22).

   O padrão atual de tratamento do glioblastoma recém-diagnosticado é multimodal e consiste em cirurgia, radioterapia e TMZ, um agente alquilante que modifica as bases purinas do DNA (O6-guanina; N7-guanina e N3-adenina). A adição de TMZ à radioterapia aumentou significativamente a sobrevida global de pacientes com GM, mas apenas até 14,6 meses(1). Foi demonstrado que a hipóxia intratumoral diminui a eficácia terapêutica da RT e da quimioterapia(23). As células GM hipóxicas são geneticamente instáveis ​​e apresentam aumento da expressão de MGMT e, portanto, resistência à quimioterapia alquilante TMZ(24).

   Em não-GSCs, a metilação do promotor MGMT é um marcador preditivo para resposta ao tratamento com TMZ(25,26). No entanto, a interpretação do ensaio de metilação de MGMT é complexa, uma vez que a extensão da metilação do promotor de MGMT em GM é heterogênea e o nível de heterogeneidade é subestimado, uma vez que apenas biópsias de GM ou tecido GM fragmentado estão sendo analisados(27,28). É importante ressaltar que a MGMT também é expressa nas células endoteliais normais do cérebro e nas células imunes, incluindo células infiltrantes tumorais (29). Assim, dependendo da extensão da contaminação do tecido normal em biópsias de GM, o nível de metilação de MGMT também pode diferir.

   Uma vez que a heterogeneidade intratumoral na expressão de MGMT não pode ser objetivada usando os diagnósticos atualmente disponíveis e uma vez que o subtratamento de pacientes deve ser sempre evitado, atualmente a maioria dos pacientes diagnosticados com GM ´de novo´ recebe TMZ; embora pareça haver pouco benefício de TMZ em GMs com células de glioma não metiladas MGMT.

   A concepção de novos protocolos de tratamento para glioblastoma recém-diagnosticado é bastante complexa, uma vez que faltam ferramentas de diagnóstico, prevendo a heterogeneidade inter e intra-GM do estado de metilação do promotor MGMT (ou nível de expressão de MGMT). Além disso, o nível de expressão de MGMT, necessário para uma resposta significativa de TMZ e melhora do resultado clínico, não é conhecido. Assim, uma vez que a maioria dos GMs são definidos por clones de tumor MGMT metilados e MGMT não metilados, pode ser necessário combinar TMZ com drogas que visam células de glioma não metiladas/células-tronco de glioma e/ou microambiente.

2. Recorrência do glioblastoma Mesmo que uma ressecção macroscopicamente completa de um GM possa ser alcançada, as células tumorais permanecem no local da ressecção. Foi demonstrado que as células GM têm uma alta capacidade de disseminação. As células tumorais invasoras escapam na periferia da massa tumoral e infiltram-se difusamente no parênquima cerebral normal. Células tumorais profundamente infiltradas têm maior probabilidade de escapar da cirurgia e o que não se sabe é se a infiltração é uma propriedade de uma população de células mais resilientes que inicia e impulsiona a recorrência do tumor. Mesmo após quimioterapia pós-operatória e radiação fora do campo da cirurgia para reduzir células tumorais infiltrativas, quase todos os GM recorrem, principalmente ao redor da cavidade de ressecção. Se uma ressecção total bruta não puder ser realizada; radioterapia primária e quimioterapia também são capazes de reduzir a diversidade clonal, mas são insuficientes para prevenir a recorrência.

Isso implica que as células tumorais resistentes a múltiplas terapias persistem no parênquima cerebral ao redor da cavidade tumoral após a ressecção total macroscópica ou no tumor remanescente após a quimiorradiação, que são responsáveis ​​pelo repovoamento do tumor, tornando-as um alvo crítico para superar a recorrência do tumor. A análise genômica do GM mostrou que os clones dominantes em tumores recorrentes são compostos por clones representativos do tumor primário, bem como novos clones com pouca semelhança com o tumor original(3,30,31,32,33). Consequentemente, os alvos identificados com base na análise do tumor primário podem não ser informativos para identificar os melhores alvos moleculares para prevenir a recorrência(5).

Após a falha do tratamento GM de primeira linha (radiação, TMZ), a recorrência parece ser acompanhada de uma mudança fenotípica de GSCs para o subtipo mesenquimal (MES) (perda de CD133; ganho de IMC1, SOX2 e CD44)(34-38). Essas células são mais agressivas, invasivas e angiogênicas do que as GSCs derivadas de tumores primários, principalmente do subtipo PN (CD133+, CD15+)(39-41). MES GSC também apresentam maior expressão dos genes do inflamassoma, como IL6, IL8, IL1B1C e CXCL2, reforçando a noção de que interagem com o microambiente e desempenham um papel importante na recorrência e progressão(42,43). Ensaios clínicos específicos de GM estão sendo desenvolvidos, usando moduladores imunológicos. Foi demonstrado que as mutações MSH (homólogas do mutS) se correlacionam com a resistência ao TMZ, pois não são encontradas no GM pré-tratamento nem no GM pós-tratamento com radioterapia, mas foram detectadas em aproximadamente metade dos pacientes com GM recorrente tratados com TMZ e radioterapia. Isso indica fortemente que as alterações do MSH6 estão associadas à resistência à terapia com agentes alquilantes. Assim, pacientes GM que inicialmente respondem a TMZ podem adquirir fenótipo hipermutador defeituoso para MMR(44-46). Está bem estabelecido que um reparo incompatível intacto e um reparo por excisão de base (BER) contribuem para a citotoxicidade efetiva da TMZ. A inibição farmacológica de BER usando inibidores de PARP, isoladamente ou em combinação com TMZ, mostrou-se promissora em ensaios clínicos. No entanto, a resistência adquirida aos inibidores de PARP é observada através da regulação positiva do reparo de excisão de base e reparo de recombinação homóloga para compensar a BER diminuída (47,48).

Em conclusão, a compreensão das alterações genéticas e epigenéticas induzidas pela terapia das células tumorais remanescentes e GSCs e também o impacto do padrão de atendimento ao microambiente/nicho, em que ocorre a recorrência, orientará o desenvolvimento de novos tratamentos.

Neste projeto, usaremos organoides de células-tronco de glioma derivados de pacientes(49), mimetizando GM de novo e sua heterogeneidade intratumoral. Além disso, esses organoides derivados de pacientes (PDO) serão usados ​​para estudar a resistência adquirida à temozolomida e, portanto, podem ser usados ​​para identificar novos agentes direcionados.

A heterogeneidade das células tumorais na expressão de MGMT e sua relevância para a resposta de TMZ também serão abordadas usando esses organoides, usando proteômica de célula única e IHC para MGMT, marcadores GSC e sequenciamento de exoma (para mutações de driver comuns) para identificar as populações que se expandem clonalmente sob TMZ ( RT) seleção e aqueles que desaparecem.

Outra característica interessante que exploraremos usando PDO é a possibilidade de analisar os sobrenadantes para DNA tumoral circulante (ctDNA) ou exossomos (vesículas secretadas que contêm RNA, pequeno RNA não codificador, proteínas e também DNA) antes durante depois da resistência TMZ adquirida que pode levar à identificação de resposta farmacológica e biomarcadores preditivos. Esses biomarcadores 'biópsia líquida' podem se tornar úteis para medir a resposta ao tratamento no sangue ou fluido lombar de pacientes com GM e permitir a modificação da dose (escalonamento ou desintensificação ou término).

O desenvolvimento dos DOPs (custos de materiais) será financiado (607061 PI M. Vooijs, MAASTRO e KWF concedem Alpe D'Huzes PI M.Vooijs, MAASTRO. Não há custos adicionais associados à obtenção do tecido tumoral.