基质金属蛋白酶在乳牙活髓切断术治疗中的作用

本研究共纳入 57 名 5-10 岁健康合作儿童的 63 颗下颌第二乳磨牙。 Ege 大学医学院伦理委员会批准了该研究（参考编号：16-7/14）。 向患儿和父母解释了详细的治疗方案，并获得了书面知情同意书。

术前获得了根尖 X 光片。 牙齿显示临床或影像学证据表明深部龋损延伸至牙髓腔附近或进入牙髓腔的患者被认为可能被纳入。

根据临床诊断将牙齿分配到不同的组。 诊断基于严格的临床和影像学标准。 当去除龋齿过程中牙髓暴露时，应用以下临床和放射学诊断标准； I 组（可复性牙髓炎）：轻微的临床症状，对冷或甜刺激的反应略微夸张，无疼痛史，对咀嚼或敲击不敏感，暴露的牙髓组织出血时间少于 5 分钟，并且牙周韧带间隙无增宽。 在活髓切断术组中，牙髓暴露小于针尖的牙齿、在暴露部位检测到有脓性/粘性、深色渗出物的牙齿和坏死牙齿被排除在外。

II组（不可逆性牙髓炎）：自发性疼痛，对咀嚼或叩击敏感，暴露的牙髓组织出血时间超过5分钟，牙周韧带间隙增宽，根尖周病变。

出于伦理原因，没有健康无龋齿血样的对照组。 所有乳磨牙都分布在两个治疗组之间，分别为活髓切断术（I 组，n=42）和牙髓切除术（II 组，n=21）。

牙髓切开术和所有取样均由同一操作员 (H.E.G.) 按照以下程序进行：局部麻醉（2% 利多卡因 (1:000,000)-Jetokain Simplex, Adeka, Turkey），并用橡皮障隔离牙齿（Roeko Dental Dam，Coltane，Whaledent，德国）。 使用低速圆钻（编号：4）从周边向中心去除龋齿牙本质。 移除髓腔顶部，并使用锋利的挖掘机取出冠状髓组织。 将所有纸浆样品置于预先称重的 Eppendorf 管中的 1 ml Tri Pure Reagent 转运培养基中。 再次称重样品并记录重量，然后在 -80°C 下储存直至实验室程序。 牙髓切除组（Ⅱ组），所有取样步骤同牙髓切断术组。

在第 I 组中，去除冠状髓后，用无菌盐水冲洗腔，通过将用盐水润湿的无菌棉球放在根髓残端上施加轻微压力并等待 5 分钟来控制初始出血。 可在5分钟内实现根管口止血的牙齿被纳入该组。 通过使用免费在线软件 (http://www.random.org) 以 1:1 的比例分为两组进行随机化。 在随机化程序之后，按照入组顺序为患者分配序列号，并告知操作员有关材料的信息，无论是使用 MTA (n=21) 还是使用 Biodentine (n=21)。

MTA Group：根据制造商的说明，将 MTA（Pro Root White MTA，Dentsply，Tulsa Dental Specialties，美国）粉末与无菌水以 3:1 的粉末/水比例混合，得到浓稠的奶油状糊状物，然后放在髓腔的底部。 MTA 混合物用湿棉球覆盖，然后使用玻璃离聚物水门汀（GIC-Ketac Molar Easymix，3M Espe，Seefeld，德国）暂时密封，直到第二次访问。

Biodentine Group：Biodentine (Septodont, Saint-Maur-des-Fossés, France) 胶囊在硬表面上轻轻拍打以扩散粉末，将单剂量分配器中的五滴液体倒入胶囊中，然后以 4200 rpm 30秒，然后使用制造商建议的适当抹刀将其放在果肉残桩上。 在让 Biodentine 凝固 12 分钟后，与 MTA 组一样，用 GIC 临时封闭牙齿。

24 小时后，两组的牙齿均使用预制不锈钢牙冠（3M Espe，Stainless Steel Crowns，Seefeld，Germany）修复。 参与者在治疗后 6、12 和 18 个月被召回。 在每次随访时，由两名经过校准的盲法检查员进行临床和放射学检查。 根据以下标准对所有牙齿进行临床和放射学评估：(1) 没有自发性疼痛和/或对压力敏感，(2) 没有窦、瘘管、水肿和/或异常活动，(3) 没有射线可透性根间和/或根尖周区域，(4) 没有内部或外部根吸收。 没有自发性疼痛、病理活动、叩击痛、肿胀、瘘管和牙龈炎症被认为是临床成功，而没有内部/外部牙根吸收和根尖周/分叉射线可透性被认为是放射学成功。 牙髓钙化变质不视为失败。

将牙髓组织在磷酸盐缓冲盐水（Gibco，Invitrogen，Karlsruhe，Germany）中洗涤 1 分钟，切成小块，转移至细胞培养板并与含有 10% 胎牛血清（Gibco BRL， Life Technologies, Grand Island, NY, USA)，青霉素-G (100 U·mL)，链霉素 (100 µg·mL) 和 Fungizone (0.25 g·mL) (GeminiBio-Products Inc., Woodland, CA, USA) 37 °C，在 5% CO2 的潮湿环境中。 1 周后发生细胞从牙髓组织的迁移，并在标准培养基中建立和维持培养物。 培养基每周更新 3 次，细胞在达到汇合后分裂。 在本研究中使用了第三代和第八代之间的牙髓细胞（参考）。

使用 RNAiso Plus (TaKaRa Bio, Shiga, Japan) 从处理过的细胞中提取 RNA。 根据制造商的说明，使用 PrimeScript RT 试剂盒（TaKaRa Bio，Otsu，Japan）从 400 ng 总 RNA 合成 cDNA。 对于含有 SYBR Green I (TaKaRa Bio, Shiga, Japan) 的每个反应，添加所得 cDNA 的十分之一，最终体积为 20 µL。 MMP-2、-8 和 -9 的引物如下（有义/反义）：

MMP-2：5'-ATC CTG GCT TTC CCA AGC TC-3'/3'-CAC CCT TGA AGA AGT AGC TGT G-5'。 MMP-8:5'-CTGTTGAAGGCCTAGAGCTGCTGCTCC3'/5'CATCTTCTCTTCAAACTCTACCC-3'。 MMP-9：5'-GGG CTT AGA TCA TTC CTC AGT G-3'/3'-GCC ATT CAC GTC GTC CTT AT-5'。 （参考）反应在 ABI Step One 实时 PCR 系统（Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）上运行，程序如下：45 个循环，95°C 10 秒，60°C 15 秒和 72 °C 20 秒。 为了对每个基因进行相对比较，研究人员使用 2-ΔΔCt 方法分析了实时 PCR 数据的阈值循环 (Ct) 值。 20 PCR 产物在含有 1 pg/mL 溴化乙锭的 1.5% 琼脂糖凝胶上进行分析，溴化乙锭附着在核酸上，使 PCR 产物在紫外光下可见。 对凝胶拍照以允许如下所述对产物进行定量。 在找到每组引物的线性部分用于产品定量后，研究人员使用图像处理和分析程序（ScionImage PC，Scion Corporation，Frederick，MD，USA）对产品进行定量，以分析 MMP-2 的表达， -8 和 -9.(ref) 统计分析 使用 SPSS for Windows version 25.0 (SPSS, Chicago, IL, USA) 进行统计分析。 p值<0.05被认为具有统计学意义。

除了卡方检验外，还使用 ​​Fisher 精确检验分析数据，以分别进行组间和组内比较。

Fisher精确检验用于检测可逆性牙髓炎组和不可逆性牙髓炎组之间MMP-2、-8、-9的表达水平。

MTA 和 Biodentine 材料在 6、12 和 18 个月的临床和放射学成功通过卡方检验进行了测试。

采用Mann Whitney U检验比较活髓切断术成功组和失败组MMP-2、-8、-9的表达。