Matrix-metalloproteinasernes rolle på de primære tænders pulpotomibehandlinger

I alt 63 mandibular primære anden kindtænder fra 57 sunde og samarbejdsvillige børn i alderen 5-10 år blev inkluderet i denne undersøgelse. Den Etiske Komité ved Det Medicinske Fakultet ved Ege Universitet godkendte undersøgelsen (Referencenummer: 16-7/14). Detaljeret behandlingsplan blev forklaret for børnene og forældrene, og der blev indhentet skriftlige informerede samtykker.

Periapikale røntgenbilleder blev taget præoperativt. Patienter med en tand, der viser kliniske eller radiografiske tegn på en dyb karieslæsion, der strækker sig tæt på eller ind i pulpakammeret, blev overvejet for potentiel inklusion.

Tænderne blev tildelt forskellige grupper i henhold til den kliniske diagnose. Diagnosen var baseret på strenge kliniske og radiografiske kriterier. Når tandpulpa blev blotlagt under cariesfjernelse, blev følgende kliniske og radiografiske diagnostiske kriterier anvendt; Gruppe I (tænder med reversibel pulpitis): Lette kliniske symptomer af mindre intensitet, let overdrevet reaktion på kulde eller søde stimuli, ingen historie med smerte, ingen følsomhed over for tygning eller slag, blødningstid fra det blottede pulpavæv mindre end 5 minutter, og ingen udvidelse af det periodontale ledbåndsrum. I pulpotomigruppen blev tænder med pulpal eksponering mindre end en pinpoint, tænder med purulent/viskøst, mørkt farvet ekssudat påvist på eksponeringsstedet og nekrotiske tænder udelukket.

Gruppe II (tænder med irreversibel pulpitis): Spontan smerte, følsomhed over for tygning eller percussion, blødningstid fra det blottede pulpavæv mere end 5 minutter og udvidelse af det periodontale ledbåndsrum, periapikal læsion.

Af etiske årsager var der ingen kontrolgruppe med blodprøver fra sunde cariesfrie tænder. Alle primære kindtænder var fordelt mellem de to behandlingsgrupper som pulpotomi (Gruppe I, n=42) og pulpektomi (Gruppe II, n=21).

Pulpotomiprocedurerne og al prøvetagning blev udført af den samme operatør (H.E.G.) efter proceduren som følger: lokalbedøvelse (2 % lidokain (1:000.000)-Jetokain Simplex, Adeka, Tyrkiet) blev administreret, og tænderne blev isoleret med en gummidæmning (Roeko Dental Dam, Coltane, Whaledent, Tyskland). Det karieste dentin blev fjernet fra hulrummet ved at arbejde fra periferien mod midten ved hjælp af en lavhastigheds rund bor (nr.:4). Taget af pulpakammeret blev fjernet, og koronal pulpavæv blev taget ved hjælp af en skarp gravemaskine. Alle pulpprøver blev anbragt i 1 ml Tri Pure Reagent-transportmedium i forudvejede Eppendorf-rør. Prøverne blev vejet igen, og vægtene blev noteret før opbevaring ved -80°C indtil laboratorieprocedurerne. I pulpektomigruppen (Gruppe II) blev alle prøveudtagningsprocedurer udført som de samme i pulpotomigruppen.

I gruppe I, efter fjernelse af koronalpulpen, blev hulrummet skyllet med sterilt saltvand, og initial blødning blev kontrolleret ved at placere sterile bomuldspellets fugtet med saltvand over den radikulære pulpstump, der udøvede et let tryk og ventede i 5 min. De tænder, for hvilke hæmostase ved kanalåbningerne kunne opnås på 5 minutter, blev inkluderet i denne gruppe. Randomiseringen blev udført som to grupper i et 1:1-forhold ved at bruge gratis online software (http://www.random.org). Efter randomiseringsproceduren blev patienterne tildelt sekventielle numre i rækkefølgen af ​​tilmelding, og operatøren blev informeret om materialet, enten med MTA (n=21) eller med Biodentine (n=21).

MTA Group: I henhold til producentens instruktioner blev MTA (Pro Root White MTA, Dentsply, Tulsa Dental Specialties, USA) pulver blandet med sterilt vand i et 3:1 pulver/vand-forhold for at opnå en tyk cremet pasta, og derefter anbragt på gulv i papirmassekammeret. MTA-blandingen blev dækket med en fugtet bomuldspellet og derefter midlertidigt forseglet med glasionomercement (GIC-Ketac Molar Easymix, 3M Espe, Seefeld, Tyskland) indtil det andet besøg.

Biodentine Group: Biodentine (Septodont, Saint-Maur-des-Fossés, Frankrig) kapsel blev forsigtigt banket på en hård overflade for at sprede pulver, fem dråber væske fra enkeltdosisdispenseren blev hældt i kapslen og derefter blandet med 4200 rpm 30 sekunder og placeres over pulpstumpene ved hjælp af en passende spatel anbefalet af producenten. Efter at have ladet Biodentine hærde i 12 minutter, blev tænderne midlertidigt forseglet med GIC som samme i MTA-gruppen.

Efter 24 timer blev tænderne i begge grupper restaureret med præformede rustfri stålkroner (3M Espe, Stainless Steel Crowns, Seefeld, Tyskland). Deltagerne blev tilbagekaldt 6, 12 og 18 måneder efter behandlingen. Ved hvert opfølgningsbesøg blev der udført kliniske og røntgenundersøgelser af to kalibrerede blindede undersøgere. Alle tænder blev vurderet klinisk og radiografisk i henhold til kriterierne: (1) fravær af spontan smerte og/eller følsomhed over for tryk, (2) fravær af sinus, fistel, ødem og/eller unormal mobilitet, (3) fravær af radiolucens ved de interterradikulære og/eller periapikale regioner, (4) fravær af intern eller ekstern rodresorption. Fraværet af spontan smerte, patologisk mobilitet, ømhed over for percussion, hævelse, fistel og tandkødsbetændelse blev betragtet som en klinisk succes, hvorimod fraværet af intern/ekstern rodresorption og periapikal/furcal radiolucens blev betragtet som en radiografisk succes. Calcific metamorfose af pulpen blev ikke betragtet som en fiasko.

Pulpvæv blev vasket i phosphatbufret saltvand (Gibco, Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland) i 1 min, skåret i små stykker, overført til cellekulturplader og inkuberet med Dulbeccos modificerede Eagles medium indeholdende 10% føtalt bovint serum (Gibco BRL, Life Technologies, Grand Island, NY, USA), penicillin-G (100 U⋅mL), streptomycin (100 µg⋅mL) og Fungizone (0,25 g⋅mL) (GeminiBio-Products Inc., Woodland, CA, USA) kl. 37 °C i en befugtet atmosfære på 5 % CO2. Migration af celler fra pulpavævet fandt sted 1 uge senere, og kulturer blev etableret og opretholdt i standardkulturmedium. Mediet blev genopfrisket tre gange om ugen, og cellerne blev delt efter at have nået sammenløb. Pulpceller mellem den tredje og ottende passage blev anvendt i denne undersøgelse (ref).

RNA blev ekstraheret fra de behandlede celler under anvendelse af RNAiso Plus (TaKaRa Bio, Shiga, Japan). cDNA blev syntetiseret fra 400 ng totalt RNA ved anvendelse af PrimeScript RT-reagenskittet (TaKaRa Bio, Otsu, Japan) i henhold til producentens instruktioner. En tiendedel af det opnåede cDNA blev tilsat til et slutvolumen på 20 µL for hver reaktion indeholdende SYBR Green I (TaKaRa Bio, Shiga, Japan). Primerne for MMP-2, -8 og -9 var som følger (sense/antisense):

MMP-2: 5'-ATC CTG GCT TTC CCA AGC TC-3'/3'-CAC CCT TGA AGA AGT AGC TGT G-5'. MMP-8:5'-CTGTTGAAGGCCTAGAGCTGCTGCTCC3'/5'CATCTTCTCTTCAAACTCTACCC-3'. MMP-9: 5'-GGG CTT AGA TCA TTC CTC AGT G-3'/3'-GCC ATT CAC GTC GTC CTT AT-5'. (ref) Reaktioner blev kørt på et ABI Step One real-time PCR-system (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) med følgende program: 45 cyklusser af 95 °C i 10 s, 60 °C i 15 s og 72 °C i 20 s. For relative sammenligninger af hvert gen analyserede efterforskerne tærskelcyklusværdien (Ct) af realtids-PCR-dataene ved hjælp af 2-ΔΔCt-metoden.20 PCR-produkterne blev analyseret på en 1,5% agarosegel indeholdende 1 pg/ml ethidiumbromid, som binder til nukleinsyrer, hvilket tillader PCR-produkterne at blive visualiseret under UV-lys. Gelen blev fotograferet for at tillade produkterne at blive kvantificeret som beskrevet nedenfor. Efter at have fundet den lineære del for hvert sæt primere til kvantificering af produkterne, kvantificerede efterforskerne produkterne med et billedbehandlings- og analyseprogram (ScionImage PC, Scion Corporation, Frederick, MD, USA) for at analysere udtrykket af MMP-2, -8 og -9.(ref) Statistisk analyse Den statistiske analyse blev udført med SPSS til Windows version 25.0 (SPSS, Chicago, IL, USA). En p-værdi på <0,05 blev anset for at være statistisk signifikant.

Data blev analyseret ved hjælp af en Fisher Exact Test ud over chi-square tests for at udføre henholdsvis inter- og intra-gruppe sammenligninger.

Fisher's Exact Test blev brugt til at teste niveauerne af MMP-2, -8, -9-ekspression mellem de reversible og irreversible pulpitis-grupper.

De 6, 12 og 18 måneder klinisk og radiografisk succes af MTA og Biodentine materialer blev testet ved chi-square test.

Mann Whitney U-test blev brugt til at sammenligne MMP-2, -8, -9 udtryk mellem vellykkede og mislykkede pulpotomigrupper.