O Papel das Metaloproteinases de Matriz nos Tratamentos de Pulpotomia em Dentes Decíduos

Um total de 63 segundos molares decíduos inferiores de 57 crianças saudáveis ​​e cooperativas com idade entre 5-10 anos foram incluídos neste estudo. O Comitê de Ética da Faculdade de Medicina da Universidade de Ege aprovou o estudo (Nº de referência: 16-7/14). O plano de tratamento detalhado foi explicado às crianças e aos pais e os consentimentos informados por escrito foram obtidos.

Radiografias periapicais foram obtidas no pré-operatório. Pacientes com um dente mostrando evidências clínicas ou radiográficas de uma lesão cariosa profunda estendendo-se para perto ou dentro da câmara pulpar foram considerados para inclusão potencial.

Os dentes foram divididos em diferentes grupos de acordo com o diagnóstico clínico. O diagnóstico baseou-se em rigorosos critérios clínicos e radiográficos. Quando a polpa dentária foi exposta durante a remoção da cárie, os seguintes critérios diagnósticos clínicos e radiográficos foram aplicados; Grupo I (dentes com pulpite reversível): sintomas clínicos leves de menor intensidade, reação levemente exagerada a estímulos frios ou doces, sem história de dor, sem sensibilidade à mastigação ou percussão, tempo de sangramento do tecido pulpar exposto inferior a 5 minutos e sem alargamento do espaço do ligamento periodontal. No grupo pulpotomia foram excluídos dentes com exposição pulpar menor que um ponto, dentes com exsudato purulento/viscoso, de cor escura detectado no local da exposição e dentes necróticos.

Grupo II (dentes com pulpite irreversível): Dor espontânea, sensibilidade à mastigação ou percussão, tempo de sangramento do tecido pulpar exposto superior a 5 minutos e alargamento do espaço do ligamento periodontal, lesão periapical.

Por razões éticas, não houve grupo controle com amostras de sangue de dentes saudáveis ​​e livres de cárie. Todos os molares decíduos foram distribuídos entre os dois grupos de tratamento como pulpotomia (Grupo I, n=42) e pulpectomia (Grupo II, n=21).

Os procedimentos de pulpotomia e todas as coletas foram realizadas pelo mesmo operador (H.E.G.) seguindo o procedimento a seguir: foi administrada anestesia local (lidocaína a 2% (1:000.000)-Jetokain Simplex, Adeka, Turquia) e os dentes foram isolados por um dique de borracha (Roeko Dental Dam, Coltane, Whaledent, Alemanha). A dentina cariada foi removida da cavidade, trabalhando da periferia para o centro usando uma broca redonda de baixa rotação (nº:4). O teto da câmara pulpar foi removido e o tecido pulpar coronal foi retirado usando uma escavadeira afiada. Todas as amostras de polpa foram colocadas em 1 ml de meio de transporte Tri Pure Reagent em tubos Eppendorf pré-pesados. As amostras foram pesadas novamente e os pesos anotados antes de serem armazenadas a -80°C até os procedimentos laboratoriais. No grupo pulpectomia (Grupo II), todos os procedimentos de amostragem foram realizados como no grupo pulpotomia.

No Grupo I, após a remoção da polpa coronária, a cavidade foi irrigada com solução salina estéril e o sangramento inicial foi controlado pela colocação de algodão estéril umedecido com solução salina sobre o coto pulpar radicular, exercendo leve pressão e aguardando 5 min. Os dentes para os quais a hemostasia nos orifícios do canal pode ser alcançada em 5 min foram incluídos neste grupo. A randomização foi realizada em dois grupos na proporção de 1:1 por meio de software online gratuito (http://www.random.org). Após o procedimento de randomização, os pacientes receberam números sequenciais na ordem de inscrição e o operador foi informado sobre o material, seja com MTA (n=21) ou com Biodentine (n=21).

Grupo MTA: De acordo com as instruções do fabricante, o pó de MTA (Pro Root White MTA, Dentsply, Tulsa Dental Specialties, EUA) foi misturado com água estéril na proporção de 3:1 pó/água para obter uma pasta cremosa espessa e, em seguida, colocado no assoalho da câmara pulpar. A mistura de MTA foi coberta com uma bolinha de algodão umedecida e selada temporariamente com cimento de ionômero de vidro (GIC-Ketac Molar Easymix, 3M Espe, Seefeld, Alemanha) até a segunda visita.

Grupo Biodentine: A cápsula Biodentine (Septodont, Saint-Maur-des-Fossés, França) foi batida suavemente em uma superfície dura para espalhar o pó, cinco gotas de líquido do dispensador de dose única foram derramadas na cápsula e depois misturadas com 4200 rpm 30 segundos e colocados sobre os cotos pulpares utilizando uma espátula apropriada recomendada pelo fabricante. Depois de permitir que o Biodentine endurecesse por 12 min, os dentes foram selados temporariamente com GIC, assim como no grupo MTA.

Após 24 horas, os dentes de ambos os grupos foram restaurados com coroas de aço inoxidável pré-formadas (3M Espe, Coroas de aço inoxidável, Seefeld, Alemanha). Os participantes foram chamados de volta aos 6, 12 e 18 meses após o tratamento. Em cada visita de acompanhamento, exames clínicos e radiográficos foram realizados por dois examinadores cegos calibrados. Todos os dentes foram avaliados clínica e radiograficamente de acordo com os critérios: (1) ausência de dor espontânea e/ou sensibilidade à pressão, (2) ausência de seio, fístula, edema e/ou mobilidade anormal, (3) ausência de radioluscência em as regiões interrradiculares e/ou periapicais, (4) ausência de reabsorção radicular interna ou externa. A ausência de dor espontânea, mobilidade patológica, sensibilidade à percussão, edema, fístula e inflamação gengival foi considerada um sucesso clínico, enquanto a ausência de reabsorção radicular interna/externa e radiolucência periapical/furcal foi considerada um sucesso radiográfico. A metamorfose cálcica da polpa não foi considerada falha.

O tecido pulpar foi lavado em solução salina tamponada com fosfato (Gibco, Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha) por 1 min, cortado em pequenos pedaços, transferido para placas de cultura celular e incubado com meio de Eagle modificado por Dulbecco contendo 10% de soro bovino fetal (Gibco BRL, Life Technologies, Grand Island, NY, EUA), penicilina-G (100 U⋅mL), estreptomicina (100 µg⋅mL) e Fungizone (0,25 g⋅mL) (GeminiBio-Products Inc., Woodland, CA, EUA) em 37 °C em atmosfera umidificada com 5% de CO2. A migração das células do tecido pulpar ocorreu 1 semana depois, e as culturas foram estabelecidas e mantidas em meio de cultura padrão. O meio foi atualizado três vezes por semana e as células foram divididas, após atingirem a confluência. Células pulpares entre a terceira e oitava passagens foram usadas neste estudo (ref).

O RNA foi extraído das células tratadas usando RNAiso Plus (TaKaRa Bio, Shiga, Japão). O cDNA foi sintetizado a partir de 400 ng de RNA total usando o kit de reagentes PrimeScript RT (TaKaRa Bio, Otsu, Japão) de acordo com as instruções do fabricante. Um décimo do cDNA obtido foi adicionado para um volume final de 20 µL para cada reação contendo SYBR Green I (TaKaRa Bio, Shiga, Japão). Os primers para MMP-2, -8 e -9 foram os seguintes (sense/antisense):

MMP-2: 5'-ATC CTG GCT TTC CCA AGC TC-3'/3'-CAC CCT TGA AGA AGT AGC TGT G-5'. MMP-8:5'-CTGTTGAAGGCCTAGAGCTGCTGCTCC3'/5'CATCTTCTCTTCAAACTCTACCC-3'. MMP-9: 5'-GGG CTT AGA TCA TTC CTC AGT G-3'/3'-GCC ATT CAC GTC GTC CTT AT-5'. (ref) As reações foram executadas em um sistema de PCR em tempo real ABI Step One (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) com o seguinte programa: 45 ciclos de 95 °C por 10 s, 60 °C por 15 s e 72 ºC por 20 s. Para comparações relativas de cada gene, os investigadores analisaram o valor do ciclo limiar (Ct) dos dados de PCR em tempo real usando o método 2-ΔΔCt.20 Os produtos de PCR foram analisados ​​em um gel de agarose 1,5% contendo 1 pg/mL de brometo de etídio, que se liga aos ácidos nucléicos, permitindo a visualização dos produtos de PCR sob luz ultravioleta. O gel foi fotografado para permitir que os produtos fossem quantificados conforme descrito abaixo. Depois de encontrar a porção linear para cada conjunto de primers para quantificação dos produtos, os pesquisadores quantificaram os produtos com um programa de processamento e análise de imagens (ScionImage PC, Scion Corporation, Frederick, MD, EUA) para analisar a expressão de MMP-2, -8 e -9.(ref) Análise Estatística A análise estatística foi realizada usando SPSS para Windows versão 25.0 (SPSS, Chicago, IL, EUA). Um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Os dados foram analisados ​​usando um Teste Exato de Fisher, além de testes qui-quadrado para realizar comparações inter e intragrupos, respectivamente.

O Teste Exato de Fisher foi utilizado para testar os níveis de expressão de MMP-2, -8, -9 entre os grupos de pulpite reversível e irreversível.

O sucesso clínico e radiográfico de 6, 12 e 18 meses dos materiais MTA e Biodentine foi testado pelo teste qui-quadrado.

O teste U de Mann Whitney foi usado para comparar as expressões das MMP-2, -8, -9 entre os grupos de pulpotomia com sucesso e com falha.