El papel de las metaloproteinasas de la matriz en los tratamientos de pulpotomía de los dientes primarios

En este estudio se incluyeron un total de 63 segundos molares temporales mandibulares de 57 niños sanos y cooperativos de entre 5 y 10 años. El Comité de Ética de la Facultad de Medicina de la Universidad de Ege aprobó el estudio (Referencia No: 16-7/14). Se explicó el plan de tratamiento detallado a los niños ya los padres y se obtuvieron los consentimientos informados por escrito.

Se obtuvieron radiografías periapicales antes de la operación. Los pacientes con un diente que mostraba evidencia clínica o radiográfica de una lesión cariosa profunda que se extendía cerca o dentro de la cámara pulpar fueron considerados para una posible inclusión.

Los dientes fueron asignados a diferentes grupos según el diagnóstico clínico. El diagnóstico se basó en estrictos criterios clínicos y radiográficos. Cuando se expuso la pulpa dental durante la remoción de caries, se aplicaron los siguientes criterios de diagnóstico clínico y radiográfico; Grupo I (dientes con pulpitis reversible): Síntomas clínicos leves de menor intensidad, reacción ligeramente exagerada a estímulos fríos o dulces, sin antecedentes de dolor, sin sensibilidad a la masticación ni a la percusión, tiempo de sangrado del tejido pulpar expuesto menor de 5 minutos, y sin ensanchamiento del espacio del ligamento periodontal. En el grupo de pulpotomía, se excluyeron los dientes con exposición pulpar más pequeña que una punta de alfiler, los dientes con exudado purulento/viscoso de color oscuro detectado en el sitio de exposición y los dientes necróticos.

Grupo II (dientes con pulpitis irreversible): Dolor espontáneo, sensibilidad a la masticación oa la percusión, tiempo de sangrado del tejido pulpar expuesto mayor de 5 minutos y ensanchamiento del espacio del ligamento periodontal, lesión periapical.

Por razones éticas, no hubo un grupo de control con muestras de sangre de dientes sanos y libres de caries. Todos los molares temporales se distribuyeron entre los dos grupos de tratamiento como pulpotomía (Grupo I, n=42) y pulpectomía (Grupo II, n=21).

Los procedimientos de pulpotomía y todos los muestreos fueron realizados por el mismo operador (H.E.G.) siguiendo el procedimiento de la siguiente manera: se administró anestesia local (lidocaína al 2% (1:000,000)-Jetokain Simplex, Adeka, Turquía) y se aislaron los dientes con un dique de goma. (Presa Roeko Dental, Coltane, Whaledent, Alemania). Se eliminó la dentina cariada de la cavidad, trabajando desde la periferia hacia el centro con una fresa redonda de baja velocidad (n.º 4). Se retiró el techo de la cámara pulpar y se extrajo tejido pulpar coronal con una excavadora afilada. Todas las muestras de pulpa se colocaron en 1 ml de medio de transporte Tri Pure Reagent en tubos Eppendorf previamente pesados. Las muestras se pesaron nuevamente y se anotaron los pesos antes de almacenarlas a -80°C hasta los procedimientos de laboratorio. En el grupo de pulpectomía (Grupo II), todos los procedimientos de muestreo se realizaron igual que en el grupo de pulpotomía.

En el Grupo I, después de la remoción de la pulpa coronal, la cavidad fue irrigada con solución salina estéril y el sangrado inicial fue controlado colocando bolitas de algodón estéril humedecidas con solución salina sobre el muñón de la pulpa radicular ejerciendo una ligera presión y esperando 5 min. Los dientes para los que se pudo lograr la hemostasia en los orificios del canal en 5 minutos se incluyeron en este grupo. La aleatorización se realizó en dos grupos en una proporción de 1:1 mediante el uso de un software gratuito en línea (http://www.random.org). Después del procedimiento de aleatorización, se asignaron números secuenciales a los pacientes en el orden de inscripción y se informó al operador sobre el material, ya sea con MTA (n=21) o con Biodentine (n=21).

Grupo MTA: De acuerdo con las instrucciones del fabricante, el polvo de MTA (Pro Root White MTA, Dentsply, Tulsa Dental Specialties, EE. UU.) se mezcló con agua estéril en una proporción de polvo/agua de 3:1 para obtener una pasta cremosa espesa, luego se colocó piso de la cámara pulpar. La mezcla de MTA se cubrió con una bolita de algodón humedecida y luego se selló temporalmente con cemento de ionómero de vidrio (GIC-Ketac Molar Easymix, 3M Espe, Seefeld, Alemania) hasta la segunda visita.

Grupo Biodentine: la cápsula de Biodentine (Septodont, Saint-Maur-des-Fossés, Francia) se golpeó suavemente sobre una superficie dura para difundir el polvo, se vertieron cinco gotas de líquido del dispensador de dosis única en la cápsula y luego se mezcló con 4200 rpm 30 segundos y se coloca sobre los muñones pulpares con una espátula adecuada aconsejada por el fabricante. Después de permitir que Biodentine se asentara durante 12 min, los dientes se sellaron temporalmente con GIC como en el grupo MTA.

Después de 24 horas, los dientes de ambos grupos fueron restaurados con coronas de acero inoxidable preformadas (3M Espe, Stainless Steel Crowns, Seefeld, Alemania). Los participantes fueron recordados a los 6, 12 y 18 meses después del tratamiento. En cada visita de seguimiento, dos examinadores ciegos calibrados realizaron exámenes clínicos y radiográficos. Todos los dientes fueron evaluados clínica y radiográficamente de acuerdo con los siguientes criterios: (1) ausencia de dolor espontáneo y/o sensibilidad a la presión, (2) ausencia de seno, fístula, edema y/o movilidad anormal, (3) ausencia de radiotransparencia en las regiones interradicular y/o periapical, (4) ausencia de reabsorción radicular interna o externa. La ausencia de dolor espontáneo, movilidad patológica, sensibilidad a la percusión, tumefacción, fístula e inflamación gingival se consideró un éxito clínico, mientras que la ausencia de reabsorción radicular interna/externa y radiolucencia periapical/furcal se consideró un éxito radiográfico. La metamorfosis calcificada de la pulpa no se consideró un fracaso.

El tejido pulpar se lavó en solución salina tamponada con fosfato (Gibco, Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) durante 1 min, se cortó en trozos pequeños, se transfirió a placas de cultivo celular y se incubó con medio de Eagle modificado por Dulbecco que contenía suero bovino fetal al 10 % (Gibco BRL, Life Technologies, Grand Island, NY, EE. UU.), penicilina-G (100 U⋅mL), estreptomicina (100 µg⋅mL) y Fungizone (0,25 g⋅mL) (GeminiBio-Products Inc., Woodland, CA, EE. UU.) en 37 °C en una atmósfera humidificada de 5% CO2. La migración de células del tejido pulpar se produjo 1 semana más tarde y los cultivos se establecieron y mantuvieron en medio de cultivo estándar. El medio se refrescó tres veces por semana y las células se dividieron después de alcanzar la confluencia. En este estudio se usaron células de pulpa entre el tercer y el octavo pasaje (ref).

El ARN se extrajo de las células tratadas utilizando RNAiso Plus (TaKaRa Bio, Shiga, Japón). El ADNc se sintetizó a partir de 400 ng de ARN total usando el kit de reactivos PrimeScript RT (TaKaRa Bio, Otsu, Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se añadió una décima parte del ADNc obtenido para un volumen final de 20 µL por cada reacción que contenía SYBR Green I (TaKaRa Bio, Shiga, Japón). Los cebadores para MMP-2, -8 y -9 fueron los siguientes (sentido/antisentido):

MMP-2: 5'-ATC CTG GCT TTC CCA AGC TC-3'/3'-CAC CCT TGA AGA AGT AGC TGT G-5'. MMP-8:5'-CTGTTGAAGGCCTAGAGCTGCTGCTCC3'/5'CATCTTCTCTTCAAACTCTACCC-3'. MMP-9: 5'-GGG CTT AGA TCA TTC CTC AGT G-3'/3'-GCC ATT CAC GTC GTC CTT AT-5'. (ref) Las reacciones se realizaron en un sistema de PCR en tiempo real ABI Step One (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.) con el siguiente programa: 45 ciclos de 95 °C durante 10 s, 60 °C durante 15 s y 72 °C durante 20 s. Para las comparaciones relativas de cada gen, los investigadores analizaron el valor del ciclo umbral (Ct) de los datos de PCR en tiempo real utilizando el método 2-ΔΔCt.20 Los productos de la PCR se analizaron en un gel de agarosa al 1,5 % que contenía 1 pg/ml de bromuro de etidio, que se une a los ácidos nucleicos, lo que permite visualizar los productos de la PCR bajo la luz ultravioleta. El gel se fotografió para permitir la cuantificación de los productos como se describe a continuación. Después de encontrar la porción lineal para cada conjunto de cebadores para la cuantificación de los productos, los investigadores cuantificaron los productos con un programa de procesamiento y análisis de imágenes (ScionImage PC, Scion Corporation, Frederick, MD, EE. UU.) para analizar la expresión de MMP-2, -8 y -9.(ref) Análisis estadístico El análisis estadístico se realizó utilizando SPSS para Windows versión 25.0 (SPSS, Chicago, IL, EE. UU.). Se consideró estadísticamente significativo un valor de p <0,05.

Los datos se analizaron utilizando una prueba exacta de Fisher además de pruebas de chi-cuadrado para realizar comparaciones inter e intragrupo, respectivamente.

Se usó la prueba exacta de Fisher para probar los niveles de expresión de MMP-2, -8, -9 entre los grupos de pulpitis reversible e irreversible.

El éxito clínico y radiográfico de los materiales MTA y Biodentine a los 6, 12 y 18 meses se probó mediante la prueba de chi-cuadrado.

Se usó la prueba U de Mann Whitney para comparar las expresiones de MMP-2, -8, -9 entre los grupos de pulpotomía exitosos y fallidos.