유치 전절개술 치료에서 Matrix Metalloproteinases의 역할

5세에서 10세 사이의 건강하고 협조적인 어린이 57명의 총 63개의 하악 유차 제2대구치가 이 연구에 포함되었습니다. Ege 대학 의학부의 윤리 위원회는 연구를 승인했습니다(참조 번호: 16-7/14). 자세한 치료 계획을 아동과 부모에게 설명하고 서면 동의서를 얻었습니다.

수술 전 치근단 방사선 사진을 얻었다. 치수강 가까이 또는 내부로 확장되는 깊은 우식 병변의 임상적 또는 방사선학적 증거를 보이는 치아를 가진 환자가 잠재적인 포함 대상으로 고려되었습니다.

치아는 임상 진단에 따라 다른 그룹으로 지정되었습니다. 진단은 엄격한 임상 및 방사선 기준을 기반으로 합니다. 충치제거 중 치수가 노출된 경우 다음과 같은 임상적 및 방사선적 진단 기준을 적용하였다. 1군(가역성 치수염이 있는 치아): 경미한 임상 증상, 차갑거나 달콤한 자극에 약간 과장된 반응, 통증의 병력 없음, 씹거나 타악기에 민감하지 않음, 노출된 치수 조직에서 출혈 시간이 5분 미만, 치주 인대 공간이 넓어지지 않습니다. 치수절개술군에서 치수 노출이 핀포인트보다 작은 치아, 화농성/점성이 있는 치아, 노출 부위에 어두운 색의 삼출물이 검출된 치아 및 괴사 치아는 제외되었습니다.

Ⅱ군(돌이킬 수 없는 치수염이 있는 치아): 자발통, 저작이나 타진에 대한 민감성, 노출된 치수 조직에서 5분 이상의 출혈 시간, 치주 인대 공간의 확장, 치근단 병변.

윤리적 이유로 우식이 없는 건강한 치아의 혈액 샘플을 채취한 대조군은 없었습니다. 모든 유구치는 치수절단술(Group I, n=42)과 치수절제술(Group II, n=21)로 두 치료군 사이에 분포되었다.

치수 절단 절차 및 모든 샘플링은 다음과 같은 절차에 따라 동일한 작업자(H.E.G.)에 의해 수행되었습니다: 국소 마취(2% 리도카인(1:000,000)-Jetokain Simplex, Adeka, 터키)를 시행하고 치아를 러버댐으로 분리했습니다. (Roeko Dental Dam, Coltane, Whaledent, 독일). 저속 라운드 버(no:4)를 사용하여 주변부에서 중앙으로 작업하면서 충치 상아질을 와동에서 제거했습니다. 치수강의 지붕을 제거하고 날카로운 굴삭기를 사용하여 치관 치수 조직을 채취했습니다. 모든 펄프 샘플을 미리 계량한 Eppendorf 튜브에 들어 있는 1ml Tri Pure Reagent 수송 배지에 넣었습니다. 실험실 절차까지 -80°C에 보관하기 전에 샘플을 다시 칭량하고 중량을 기록했습니다. 치수절제술군(II군)에서는 모든 검체 채취 절차를 치수절단술군과 동일하게 시행하였다.

I군은 치관 치수를 제거한 후 멸균 생리 식염수로 공동을 세척하고 생리 식염수를 적신 멸균 면 펠릿을 신경근 치수 그루터기에 대고 약간의 압력을 가한 후 5분 동안 대기하여 초기 출혈을 조절했습니다. 근관 구멍에서 지혈이 5분 안에 달성될 수 있는 치아가 이 그룹에 포함되었습니다. 무작위화는 무료 온라인 소프트웨어(http://www.random.org)를 사용하여 1:1 비율로 두 그룹으로 수행되었습니다. 무작위화 절차에 따라 환자는 등록 순서대로 일련 번호를 할당받았고 조작자는 MTA(n=21) 또는 Biodentine(n=21)을 사용한 재료에 대한 정보를 받았습니다.

MTA 그룹: 제조업체의 지침에 따라 MTA(Pro Root White MTA, Dentsply, Tulsa Dental Specialties, USA) 분말을 멸균수와 분말/물 비율 3:1로 혼합하여 걸쭉한 크림 페이스트를 얻은 다음 펄프 챔버 바닥. MTA 혼합물을 축축한 면 펠릿으로 덮은 다음 두 번째 방문 때까지 유리 이오노머 시멘트(GIC-Ketac Molar Easymix, 3M Espe, Seefeld, Germany)를 사용하여 임시로 밀봉했습니다.

Biodentine Group: Biodentine(Septodont, Saint-Maur-des-Fossés, France) 캡슐을 딱딱한 표면에 가볍게 두드려 분말을 분산시키고 단일 용량 디스펜서에서 액체 5방울을 캡슐에 부은 다음 4200rpm으로 혼합했습니다. 제조업체가 권장하는 적절한 주걱을 사용하여 펄프 그루터기 위에 놓습니다. Biodentine을 12분 동안 고정시킨 후 치아를 MTA 그룹과 동일하게 GIC로 일시적으로 봉합했습니다.

24시간 후, 두 그룹의 치아는 사전 성형된 스테인레스 스틸 크라운(3M Espe, 스테인레스 스틸 크라운, 독일 Seefeld)으로 수복되었습니다. 참가자들은 치료 후 6, 12 및 18개월에 소환되었습니다. 각 후속 방문에서 임상 및 방사선 검사는 보정된 맹검 검사관 2명에 의해 수행되었습니다. 모든 치아는 다음 기준에 따라 임상 및 방사선학적으로 평가되었습니다. 뿌리간 및/또는 치근단 부위, (4) 내부 또는 외부 뿌리 재흡수 부재. 자발통, 병리학적 동요, 타진에 대한 압통, 종창, 누공, 치은 염증의 부재는 임상적 성공으로 간주되는 반면, 내부/외부 치근 흡수 및 치근단/이부 방사선 투과성의 부재는 방사선학적 성공으로 간주됩니다. 치수의 석회화 변태는 실패로 간주되지 않았습니다.

치수 조직을 인산염 완충 식염수(Gibco, Invitrogen, Karlsruhe, Germany)에서 1분 동안 세척하고, 작은 조각으로 자르고, 세포 배양 플레이트로 옮기고, 10% 태아 소 혈청(Gibco BRL, Life Technologies, Grand Island, NY, USA), 페니실린-G(100U⋅mL), 스트렙토마이신(100µg⋅mL) 및 Fungizone(0.25g⋅mL)(GeminiBio-Products Inc., Woodland, CA, USA) 5% CO2의 가습 대기에서 37 °C. 치수 조직으로부터의 세포 이동은 1주 후에 발생하였고, 배양을 확립하고 표준 배양 배지에서 유지하였다. 배지는 일주일에 세 번 새로 고쳤고 합류에 도달한 후 세포를 분할했습니다. 세 번째와 여덟 번째 계대 사이의 치수 세포가 이 연구에서 사용되었습니다(참조).

RNAiso Plus(TaKaRa Bio, Shiga, Japan)를 사용하여 처리된 세포로부터 RNA를 추출하였다. 제조사의 지침에 따라 PrimeScript RT 시약 키트(TaKaRa Bio, Otsu, Japan)를 사용하여 총 RNA 400ng에서 cDNA를 합성했습니다. 얻은 cDNA의 1/10을 SYBR Green I(TaKaRa Bio, Shiga, Japan)을 포함하는 각 반응에 대해 최종 부피 20 μL로 추가했습니다. MMP-2, -8 및 -9에 대한 프라이머는 다음과 같다(센스/안티센스):

MMP-2: 5'-ATC CTG GCT TTC CCA AGC TC-3'/3'-CAC CCT TGA AGA AGT AGC TGT G-5'. MMP-8:5'-CTGTTGAAGGCCTAGAGCTGCTGCTCC3'/5'CATCTTCTCTTCAAACTCTACCC-3'. MMP-9: 5'-GGG CTT AGA TCA TTC CTC AGT G-3'/3'-GCC ATT CAC GTC GTC CTT AT-5'. (참조) 반응은 다음 프로그램으로 ABI Step One 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)에서 실행되었습니다: 95°C에서 10초, 60°C에서 15초 및 72 20초 동안 °C. 각 유전자의 상대적 비교를 위해 연구자들은 2-ΔΔCt 방법을 사용하여 real-time PCR 데이터의 임계 주기(Ct) 값을 분석했습니다.20 PCR 산물은 1pg/mL ethidium bromide가 포함된 1.5% 아가로스 겔에서 분석되었으며, 이는 핵산에 부착되어 UV 광선 아래에서 PCR 산물을 시각화할 수 있습니다. 젤은 아래에 설명된 대로 제품을 정량화할 수 있도록 사진을 찍었습니다. 산물 정량을 위한 각 프라이머 세트에 대한 선형 부분을 찾은 후, 연구자들은 이미지 처리 및 분석 프로그램(ScionImage PC, Scion Corporation, Frederick, MD, USA)으로 산물을 정량하여 MMP-2의 발현을 분석하였고, -8 및 -9.(ref) 통계 분석 통계 분석은 SPSS for Windows 버전 25.0(SPSS, Chicago, IL, USA)을 사용하여 수행하였다. <0.05의 p-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.

데이터는 각각 그룹 간 및 그룹 내 비교를 수행하기 위해 카이 제곱 테스트 외에 Fisher Exact Test를 사용하여 분석되었습니다.

Fisher's Exact Test는 가역성 및 비가역성 치수염 그룹 사이의 MMP-2, -8, -9 발현 수준을 테스트하기 위해 사용되었습니다.

MTA 및 Biodentine 재료의 6, 12 및 18개월 임상 및 방사선학적 성공은 카이제곱 테스트로 테스트되었습니다.

Mann Whitney U test는 치수절개 성공군과 실패한 군 사이의 MMP-2, -8, -9 발현을 비교하는 데 사용되었습니다.