Роль матриксных металлопротеиназ в лечении пульпотомии молочных зубов

Всего в это исследование было включено 63 молочных вторых моляра нижней челюсти 57 здоровых и общительных детей в возрасте от 5 до 10 лет. Этический комитет медицинского факультета Эгейского университета одобрил исследование (номер ссылки: 16-7/14). Детям и родителям был разъяснен подробный план лечения и получены письменные информированные согласия.

Перед операцией были получены периапикальные рентгенограммы. Пациенты с зубом, показывающим клинические или рентгенологические признаки глубокого кариозного поражения, распространяющегося близко или в пульповую камеру, рассматривались для потенциального включения.

Зубы были отнесены к разным группам в соответствии с клиническим диагнозом. Диагноз был основан на строгих клинических и рентгенологических критериях. При обнажении пульпы зуба при удалении кариеса применяли следующие клинико-рентгенологические диагностические критерии; Группа I (зубы с обратимым пульпитом): легкие клинические симптомы незначительной интенсивности, несколько преувеличенная реакция на холодные или сладкие раздражители, отсутствие боли в анамнезе, отсутствие чувствительности при жевании или перкуссии, время кровотечения из обнаженной ткани пульпы менее 5 минут и отсутствие расширения периодонтальной щели. В группе пульпотомии исключались зубы с обнажением пульпы размером менее булавки, зубы с гнойно-вязким экссудатом темного цвета, обнаруженным в месте обнажения, и некротические зубы.

II группа (зубы с необратимым пульпитом): спонтанная боль, чувствительность при жевании или перкуссии, время кровотечения из обнаженной ткани пульпы более 5 минут, расширение периодонтально-связочного пространства, периапикальное поражение.

По этическим соображениям не было контрольной группы с образцами крови здоровых зубов без кариеса. Все молочные моляры были распределены между двумя группами лечения: пульпотомия (группа I, n=42) и пульпэктомия (группа II, n=21).

Процедуры пульпотомии и все образцы были выполнены одним и тем же оператором (H.E.G.) в соответствии со следующей процедурой: проводилась местная анестезия (2% лидокаин (1:000,000)-Jetokain Simplex, Adeka, Турция) и зубы изолировались раббердамом. (Roeko Dental Dam, Coltane, Whaledent, Германия). Кариозный дентин удаляли из полости, работая от периферии к центру низкоскоростным круглым бором (№:4). Крыша пульповой камеры была удалена, а коронковая ткань пульпы извлечена с помощью острого экскаватора. Все образцы пульпы помещали в транспортную среду Tri Pure Reagent объемом 1 мл в предварительно взвешенные пробирки Эппендорфа. Образцы снова взвешивали и массу записывали перед хранением при -80°C до проведения лабораторных процедур. В группе пульпотомии (группа II) все процедуры отбора проб проводились так же, как и в группе пульпотомии.

В группе I после удаления коронковой пульпы полость промывали стерильным физиологическим раствором, а начальное кровотечение останавливали путем помещения стерильных ватных шариков, смоченных физиологическим раствором, на культю корневой пульпы с легким надавливанием и ожиданием в течение 5 мин. В эту группу были включены зубы, для которых удалось добиться гемостаза в устье канала за 5 мин. Рандомизация проводилась по двум группам в соотношении 1 : 1 с использованием бесплатного онлайн-программного обеспечения (http://www.random.org). После процедуры рандомизации пациентам были присвоены порядковые номера в порядке регистрации, а оператор был проинформирован о материале либо с МТА (n=21), либо с Biodentine (n=21).

Группа МТА: В соответствии с инструкциями производителя порошок МТА (Pro Root White MTA, Dentsply, Tulsa Dental Specialties, США) смешивали со стерильной водой в соотношении порошок/вода 3:1 до получения густой кремообразной пасты, затем наносили на дно пульповой камеры. Смесь МТА была покрыта смоченным ватным тампоном, а затем временно герметизирована стеклоиономерным цементом (GIC-Ketac Molar Easymix, 3M Espe, Зеефельд, Германия) до второго визита.

Группа Biodentine: капсулу Biodentine (Septodont, Saint-Maur-des-Fossés, Франция) осторожно постукивали по твердой поверхности для распыления порошка, пять капель жидкости из дозатора для разовой дозы наливали в капсулу, а затем перемешивали при 4200 об/мин. 30 секунд и помещают на культи пульпы с помощью соответствующего шпателя, рекомендованного производителем. После того, как Biodentine застыл в течение 12 минут, зубы были временно загерметизированы с помощью GIC, как и в группе MTA.

Через 24 часа зубы в обеих группах были восстановлены предварительно отформованными коронками из нержавеющей стали (3M Espe, коронки из нержавеющей стали, Зеефельд, Германия). Участники были отозваны через 6, 12 и 18 месяцев после лечения. При каждом последующем посещении клинические и рентгенологические исследования проводились двумя квалифицированными слепыми экспертами. Все зубы оценивались клинически и рентгенологически по критериям: (1) отсутствие спонтанной боли и/или чувствительности к давлению, (2) отсутствие синуса, свища, отека и/или аномальной подвижности, (3) отсутствие рентгенопрозрачности при межкорневая и/или периапикальная области, (4) отсутствие внутренней или внешней резорбции корня. Отсутствие спонтанной боли, патологической подвижности, болезненности при перкуссии, отека, свищей и воспаления десен расценивали как клинический успех, тогда как отсутствие внутренней/наружной резорбции корня и периапикальной/фуркальной рентгенопрозрачности расценивали как рентгенологический успех. Кальцифицирующий метаморфоз пульпы не расценивали как недостаточность.

Ткань пульпы промывали фосфатно-солевым буфером (Gibco, Invitrogen, Karlsruhe, Germany) в течение 1 мин, разрезали на мелкие кусочки, переносили на планшеты для культивирования клеток и инкубировали с модифицированной Дульбекко средой Игла, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (Gibco BRL, Life Technologies, Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США), пенициллин-G (100 ЕД⋅мл), стрептомицин (100 мкг⋅мл) и фунгизон (0,25 г⋅мл) (GeminiBio-Products Inc., Вудленд, Калифорния, США) по адресу 37 °C во влажной атмосфере с 5% CO2. Миграция клеток из ткани пульпы происходила через 1 неделю, и культуры устанавливали и поддерживали в стандартной культуральной среде. Среду обновляли три раза в неделю и после достижения слияния клетки разделяли. В этом исследовании использовали клетки пульпы между третьим и восьмым пассажами (ссылка).

РНК экстрагировали из обработанных клеток с использованием RNAiso Plus (TaKaRa Bio, Shiga, Japan). кДНК синтезировали из 400 нг общей РНК с использованием набора реагентов PrimeScript RT (TaKaRa Bio, Otsu, Japan) в соответствии с инструкциями производителя. Добавляли одну десятую полученной кДНК до конечного объема 20 мкл для каждой реакции, содержащей SYBR Green I (TaKaRa Bio, Shiga, Japan). Праймеры для MMP-2, -8 и -9 были следующими (смысл/антисмысл):

ММП-2: 5'-ATC CTG GCT TTC CCA AGC TC-3'/3'-CAC CCT TGA AGA AGT AGC TGT G-5'. MMP-8:5'-CTGTTGAAGGCCTAGAGCTGCTGCTCC3'/5'CATCTTCTCTTCAAACTCTACCC-3'. MMP-9: 5'-GGG CTT AGA TCA TTC CTC AGT G-3'/3'-GCC ATT CAC GTC GTC CTT AT-5'. (ссылка) Реакции проводили на системе ПЦР в реальном времени ABI Step One (Applied Biosystems, Фостер-Сити, Калифорния, США) по следующей программе: 45 циклов при 95°C в течение 10 с, 60°C в течение 15 с и 72 цикла. °С в течение 20 с. Для относительного сравнения каждого гена исследователи проанализировали значение порогового цикла (Ct) данных ПЦР в реальном времени с использованием метода 2-ΔΔCt.20 Продукты ПЦР анализировали на 1,5% агарозном геле, содержащем 1 мкг/мл бромида этидия, который связывается с нуклеиновыми кислотами, позволяя визуализировать продукты ПЦР в УФ-свете. Гель фотографировали для количественного определения продуктов, как описано ниже. После нахождения линейной части для каждого набора праймеров для количественного определения продуктов исследователи провели количественный анализ продуктов с помощью программы обработки и анализа изображений (ScionImage PC, Scion Corporation, Фредерик, штат Мэриленд, США) для анализа экспрессии MMP-2, -8 и -9.(ссылка) Статистический анализ Статистический анализ был выполнен с использованием SPSS для Windows версии 25.0 (SPSS, Чикаго, Иллинойс, США). Значение p <0,05 считалось статистически значимым.

Данные были проанализированы с использованием точного критерия Фишера в дополнение к критерию хи-квадрат для проведения межгрупповых и внутригрупповых сравнений соответственно.

Точный тест Фишера использовали для проверки уровней экспрессии MMP-2, -8, -9 между группами обратимого и необратимого пульпита.

Клиническая и рентгенологическая эффективность материалов MTA и Biodentine через 6, 12 и 18 месяцев оценивалась с помощью критерия хи-квадрат.

U-критерий Манна-Уитни использовали для сравнения экспрессии MMP-2, -8, -9 между группами с успешной и неудачной пульпотомией.