Matriisin metalloproteinaasien rooli ensisijaisten hampaiden pulpotomiahoidoissa

Tähän tutkimukseen osallistui yhteensä 63 alaleuan primaarista toista poskihammasta 57 terveeltä ja yhteistyökykyiseltä 5-10-vuotiaalta lapselta. Egen yliopiston lääketieteellisen tiedekunnan eettinen toimikunta hyväksyi tutkimuksen (viitenumero: 16-7/14). Yksityiskohtainen hoitosuunnitelma selitettiin lapsille ja vanhemmille ja hankittiin kirjallinen tietoinen suostumus.

Periapikaaliset röntgenkuvat otettiin ennen leikkausta. Potilaiden, joiden hammas osoitti kliinisiä tai radiologisia todisteita syvästä kariesvauriosta, joka ulottui lähelle tai massakammioon, harkittiin mahdollista sisällyttämistä.

Hampaat jaettiin eri ryhmiin kliinisen diagnoosin mukaan. Diagnoosi perustui tiukoihin kliinisiin ja radiologisiin kriteereihin. Kun hammasmassa paljastettiin karieksen poiston aikana, sovellettiin seuraavia kliinisiä ja radiografisia diagnostisia kriteerejä; Ryhmä I (hampaat, joissa on palautuva pulpitis): Lievät kliiniset oireet, joiden voimakkuus on lievä, hieman liioiteltu reaktio kylmiin tai makeisiin ärsykkeisiin, ei kipua, ei herkkyyttä pureskelulle tai lyömäsoittimille, verenvuotoaika paljastuneesta sellukudoksesta alle 5 minuuttia ja ei parodontaalisen nivelsiteen tila laajenemista. Pulpotomiaryhmässä hampaat, joiden pulpaalisuus oli pienempi kuin pinpiste, hampaat, joissa oli märkivä/viskoosinen, tummavärinen erite havaittu altistuskohdassa, ja nekroottiset hampaat jätettiin pois.

Ryhmä II (hampaat, joissa on irreversiibeli pulpitis): Spontaani kipu, herkkyys pureskelulle tai lyömäsoittimelle, vuotoaika paljastuneesta pulppukudoksesta yli 5 minuuttia ja parodontaalisen ligamenttitilan laajeneminen, periapikaalinen vaurio.

Eettisistä syistä ei ollut kontrolliryhmää, jolla olisi verinäytteitä terveistä kariesvapaista hampaista. Kaikki primaariset poskihampaat jaettiin kahden hoitoryhmän kesken pulpotomiana (ryhmä I, n=42) ja pulpectomiana (ryhmä II, n=21).

Pulpotomiatoimenpiteet ja kaikki näytteenotot suoritti sama operaattori (H.E.G.) seuraavasti: annettiin paikallispuudutus (2 % lidokaiinia (1:000 000)-Jetokain Simplex, Adeka, Turkki) ja hampaat eristettiin kumipadalla. (Roeko Dental Dam, Coltane, Whaledent, Saksa). Karioottinen dentiini poistettiin ontelosta ja työskenteli reunoista kohti keskustaa käyttämällä hidasnopeuksista pyöreää poranterää (nro 4). Sellukammion katto poistettiin ja koronaalusta kudosta otettiin terävällä kaivinkoneella. Kaikki massanäytteet laitettiin 1 ml:aan Tri Pure Reagent -kuljetusalustaa esipunnittuihin Eppendorf-putkiin. Näytteet punnittiin uudelleen ja painot merkittiin muistiin ennen varastointia -80 °C:ssa laboratoriotoimenpiteisiin asti. Pulpectomy-ryhmässä (ryhmä II) kaikki näytteenottotoimenpiteet suoritettiin samoin kuin pulpotomiaryhmässä.

Ryhmässä I, koronaalisen massan poistamisen jälkeen, ontelo kasteltiin steriilillä suolaliuoksella ja alkuvuotoa kontrolloitiin asettamalla suolaliuoksella kostutettuja steriilejä puuvillapellettejä radikulaarisen massan kannan päälle kohdistaen lievää painetta ja odottamalla 5 minuuttia. Tähän ryhmään sisällytettiin hampaat, joiden hemostaasi kanavan aukoista voitiin saavuttaa 5 minuutissa. Satunnaistaminen suoritettiin kahdessa ryhmässä suhteessa 1:1 käyttämällä ilmaista online-ohjelmistoa (http://www.random.org). Satunnaistamisen jälkeen potilaille annettiin järjestysnumerot ilmoittautumisjärjestyksessä ja operaattorille tiedotettiin materiaalista joko MTA:lla (n=21) tai Biodentinellä (n=21).

MTA Group: Valmistajan ohjeiden mukaan MTA (Pro Root White MTA, Dentsply, Tulsa Dental Specialties, USA) jauhe sekoitettiin steriiliin veteen jauhe/vesi-suhteessa 3:1 paksun kermaisen tahnan saamiseksi ja asetettiin sitten massakammion lattia. MTA-seos peitettiin kostutetulla puuvillapelletillä ja suljettiin sitten väliaikaisesti käyttämällä lasi-ionomeerisementtiä (GIC-Ketac Molar Easymix, 3M Espe, Seefeld, Saksa) toiseen käyntiin asti.

Biodentine Group: Biodentine (Septodont, Saint-Maur-des-Fossés, Ranska) kapselia koputettiin varovasti kovalle pinnalle jauheen levittämiseksi, viisi tippaa nestettä kerta-annostelijasta kaadettiin kapseliin ja sekoitettiin sitten nopeudella 4200 rpm 30 sekuntia ja asetetaan massan kantojen päälle käyttämällä valmistajan suosittelemaa sopivaa lasta. Kun Biodentinen oli annettu kovettua 12 minuuttia, hampaat tiivistettiin väliaikaisesti GIC:llä, kuten sama MTA-ryhmässä.

24 tunnin kuluttua kummankin ryhmän hampaat palautettiin esimuotoilluilla ruostumattomasta teräksestä valmistettujen kruunujen avulla (3M Espe, Stainless Steel Crowns, Seefeld, Saksa). Osallistujat kutsuttiin takaisin 6, 12 ja 18 kuukautta hoidon jälkeen. Jokaisella seurantakäynnillä kaksi kalibroitua sokeutunutta tutkijaa suoritti kliiniset ja röntgentutkimukset. Kaikki hampaat arvioitiin kliinisesti ja radiografisesti seuraavien kriteerien mukaisesti: (1) spontaanin kivun ja/tai paineherkkyyden puuttuminen, (2) poskionteloiden, fistelin, turvotuksen ja/tai epänormaalin liikkuvuuden puuttuminen, (3) radioluenssin puuttuminen interradikulaariset ja/tai periapikaaliset alueet, (4) juuren sisäisen tai ulkoisen resorption puuttuminen. Spontaanien kivun, patologisen liikkuvuuden, lyömäsoittimen arkuuden, turvotuksen, fistelin ja ientulehduksen puuttumista pidettiin kliinisenä menestyksenä, kun taas sisäisen/ulkoisen juuren resorption ja periapikaalisen/furcal-radiolusenssin puuttumista pidettiin radiologisena menestyksenä. Massan kalkkimuotoista muodonmuutosta ei pidetty epäonnistumisena.

Massakudosta pestiin fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (Gibco, Invitrogen, Karlsruhe, Saksa) 1 minuutin ajan, leikattiin pieniksi paloiksi, siirrettiin soluviljelylevyille ja inkuboitiin Dulbeccon modifioidun Eagle's -alustan kanssa, joka sisälsi 10 % naudan sikiön seerumia (Gibco BRL, Life Technologies, Grand Island, NY, USA), penisilliini-G (100 U⋅mL), streptomysiini (100 µg⋅mL) ja Fungizone (0,25 g⋅mL) (GeminiBio-Products Inc., Woodland, CA, USA) klo. 37 °C kosteassa ilmakehässä, jossa on 5 % CO2. Solujen migraatio pulpalikudoksesta tapahtui 1 viikkoa myöhemmin, ja viljelmät perustettiin ja niitä ylläpidettiin standardissa elatusaineessa. Elatusaine päivitettiin kolme kertaa viikossa, ja solut jaettiin yhtymäkohdan saavuttamisen jälkeen. Tässä tutkimuksessa käytettiin massasoluja kolmannen ja kahdeksannen siirrostuksen välillä (viite).

RNA uutettiin käsitellyistä soluista käyttämällä RNAiso Plus:a (TaKaRa Bio, Shiga, Japani). cDNA syntetisoitiin 400 ng:sta kokonais-RNA:ta käyttäen PrimeScript RT -reagenssipakkausta (TaKaRa Bio, Otsu, Japani) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Yksi kymmenesosa saadusta cDNA:sta lisättiin 20 ui:n lopulliseen tilavuuteen kutakin SYBR Green I:tä sisältävää reaktiota (TaKaRa Bio, Shiga, Japani) kohti. MMP-2:n, -8:n ja -9:n alukkeet olivat seuraavat (sense/antisense):

MMP-2: 5'-ATC CTG GCT TTC CCA AGC TC-3'/3'-CAC CCT TGA AGA AGT AGC TGT G-5'. MMP-8:5'-CTGTTGAAGGCCTAGAGCTGCTGCTCC3'/5'CATCTTCTCTTCAAACTCTACCC-3'. MMP-9: 5'-GGG CTT AGA TCA TTC CTC AGT G-3'/3'-GCC ATT CAC GTC GTC CTT AT-5'. (ref) Reaktiot ajettiin ABI Step One -reaaliaikaisella PCR-järjestelmällä (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) seuraavalla ohjelmalla: 45 sykliä 95 °C:ssa 10 s, 60 °C:ssa 15 s ja 72 °C 20 s. Kunkin geenin suhteellista vertailua varten tutkijat analysoivat reaaliaikaisten PCR-tietojen kynnyssyklin (Ct) arvon käyttämällä 2-ΔΔCt-menetelmää. PCR-tuotteet analysoitiin 1,5-prosenttisella agaroosigeelillä, joka sisälsi 1 pg/ml etidiumbromidia, joka kiinnittyy nukleiinihappoihin mahdollistaen PCR-tuotteiden visualisoinnin UV-valossa. Geeli valokuvattiin, jotta tuotteiden määrä voidaan määrittää alla kuvatulla tavalla. Löytettyään lineaarisen osuuden jokaiselle alukesarjalle tuotteiden kvantitointia varten, tutkijat määrittelivät tuotteet kuvankäsittely- ja analysointiohjelmalla (ScionImage PC, Scion Corporation, Frederick, MD, USA) analysoidakseen MMP-2:n ilmentymistä, -8 ja -9. (viite) Tilastollinen analyysi Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttämällä SPSS for Windows -versiota 25.0 (SPSS, Chicago, IL, USA). P-arvon <0,05 katsottiin olevan tilastollisesti merkitsevä.

Tiedot analysoitiin käyttämällä Fisher Exact -testiä khin-neliötestien lisäksi ryhmien välisten ja sisäisten vertailujen suorittamiseksi, vastaavasti.

Fisher's Exact Testiä käytettiin MMP-2-, -8-, -9-ekspression tasojen testaamiseen reversiibelin ja irreversiibelin pulpitis-ryhmien välillä.

MTA- ja Biodentine-materiaalien 6, 12 ja 18 kuukauden kliininen ja radiografinen menestys testattiin khin neliötestillä.

Mann Whitney U -testiä käytettiin MMP-2, -8, -9 -lausekkeiden vertailussa onnistuneiden ja epäonnistuneiden pulpotomiaryhmien välillä.