Il ruolo delle metalloproteinasi della matrice sui trattamenti di pulpotomia dei denti decidui

In questo studio sono stati inclusi un totale di 63 secondi molari primari mandibolari di 57 bambini sani e collaborativi di età compresa tra 5 e 10 anni. Il Comitato Etico della Facoltà di Medicina dell'Università Ege ha approvato lo studio (Riferimento n.: 16-7/14). Il piano di trattamento dettagliato è stato spiegato ai bambini e ai genitori e sono stati ottenuti consensi informati scritti.

Le radiografie periapicali sono state ottenute prima dell'intervento. I pazienti con un dente che mostrava evidenza clinica o radiografica di una lesione cariosa profonda che si estendeva vicino o all'interno della camera pulpare sono stati presi in considerazione per la potenziale inclusione.

I denti sono stati assegnati a diversi gruppi in base alla diagnosi clinica. La diagnosi si basava su rigidi criteri clinici e radiografici. Quando la polpa dentale è stata esposta durante la rimozione della carie, sono stati applicati i seguenti criteri diagnostici clinici e radiografici; Gruppo I (denti con pulpite reversibile): lievi sintomi clinici di minore intensità, reazione leggermente esagerata a stimoli freddi o dolci, nessuna storia di dolore, nessuna sensibilità alla masticazione o alla percussione, tempo di sanguinamento dal tessuto pulpare esposto inferiore a 5 minuti e nessun allargamento dello spazio del legamento parodontale. Nel gruppo pulpotomia sono stati esclusi i denti con esposizione pulpare inferiore a un puntino, i denti con essudato purulento/viscoso di colore scuro rilevato nel sito di esposizione ei denti necrotici.

Gruppo II (denti con pulpite irreversibile): dolore spontaneo, sensibilità alla masticazione o alla percussione, tempo di sanguinamento dal tessuto pulpare esposto superiore a 5 minuti e allargamento dello spazio del legamento parodontale, lesione periapicale.

Per ragioni etiche, non esisteva un gruppo di controllo con campioni di sangue prelevati da denti sani privi di carie. Tutti i molari primari sono stati distribuiti tra i due gruppi di trattamento come pulpotomia (Gruppo I, n=42) e pulpectomia (Gruppo II, n=21).

Le procedure di pulpotomia e tutti i campionamenti sono stati eseguiti dallo stesso operatore (H.E.G.) seguendo la procedura come segue: è stata somministrata anestesia locale (lidocaina al 2% (1:000.000)-Jetokain Simplex, Adeka, Turchia) e i denti sono stati isolati con una diga di gomma (Roeko Dental Dam, Coltane, Whaledent, Germania). La dentina cariata è stata rimossa dalla cavità, lavorando dalla periferia verso il centro utilizzando una fresa arrotondata a bassa velocità (n. 4). Il tetto della camera pulpare è stato rimosso e il tessuto pulpare coronale è stato prelevato utilizzando un escavatore affilato. Tutti i campioni di polpa sono stati collocati in 1 ml di terreno di trasporto Tri Pure Reagent in provette Eppendorf prepesate. I campioni sono stati nuovamente pesati e annotati i pesi prima della conservazione a -80°C fino alle procedure di laboratorio. Nel gruppo pulpotomia (gruppo II), tutte le procedure di campionamento sono state eseguite allo stesso modo nel gruppo pulpotomia.

Nel gruppo I, dopo la rimozione della polpa coronale, la cavità è stata irrigata con soluzione fisiologica sterile e il sanguinamento iniziale è stato controllato posizionando palline di cotone sterile inumidite con soluzione fisiologica sul moncone di polpa radicolare esercitando una leggera pressione e attendendo 5 minuti. I denti per i quali l'emostasi agli orifizi del canale poteva essere raggiunta in 5 minuti sono stati inclusi in questo gruppo. La randomizzazione è stata eseguita come due gruppi in un rapporto 1:1 utilizzando un software online gratuito (http://www.random.org). Dopo la procedura di randomizzazione, ai pazienti sono stati assegnati numeri sequenziali nell'ordine di arruolamento e l'operatore è stato informato del materiale, o con MTA (n=21) o con Biodentine (n=21).

Gruppo MTA: secondo le istruzioni del produttore, la polvere MTA (Pro Root White MTA, Dentsply, Tulsa Dental Specialties, USA) è stata miscelata con acqua sterile in un rapporto polvere/acqua 3:1 per ottenere una pasta densa e cremosa, quindi posta sul pavimento della camera pulpare. La miscela MTA è stata ricoperta con un pellet di cotone inumidito e quindi sigillata temporaneamente utilizzando cemento vetroionomerico (GIC-Ketac Molar Easymix, 3M Espe, Seefeld, Germania) fino alla seconda visita.

Gruppo Biodentine: la capsula di Biodentine (Septodont, Saint-Maur-des-Fossés, Francia) è stata picchiettata delicatamente su una superficie dura per diffondere la polvere, cinque gocce di liquido dal dosatore monodose sono state versate nella capsula e poi miscelate a 4200 giri al minuto 30 secondi e posizionati sopra i monconi di polpa utilizzando un'apposita spatola consigliata dal produttore. Dopo aver lasciato indurire Biodentine per 12 minuti, i denti sono stati temporaneamente sigillati con GIC come nel gruppo MTA.

Dopo 24 ore, i denti di entrambi i gruppi sono stati restaurati con corone preformate in acciaio inossidabile (3M Espe, corone in acciaio inossidabile, Seefeld, Germania). I partecipanti sono stati richiamati a 6, 12 e 18 mesi dopo il trattamento. Ad ogni visita di follow-up, gli esami clinici e radiografici sono stati eseguiti da due esaminatori calibrati in cieco. Tutti i denti sono stati valutati clinicamente e radiograficamente secondo i criteri: (1) assenza di dolore spontaneo e/o sensibilità alla pressione, (2) assenza di seno, fistola, edema e/o mobilità anormale, (3) assenza di radiotrasparenza a le regioni interradicolari e/o periapicali, (4) assenza di riassorbimento radicolare interno o esterno. L'assenza di dolore spontaneo, mobilità patologica, dolorabilità alla percussione, gonfiore, fistola e infiammazione gengivale è stata considerata un successo clinico, mentre l'assenza di riassorbimento radicolare interno/esterno e radiotrasparenza periapicale/forcale è stata considerata un successo radiografico. La metamorfosi calcifica della polpa non è stata considerata un fallimento.

Il tessuto pulpare è stato lavato in soluzione salina tamponata con fosfato (Gibco, Invitrogen, Karlsruhe, Germania) per 1 minuto, tagliato in piccoli pezzi, trasferito in piastre di coltura cellulare e incubato con mezzo di Eagle modificato di Dulbecco contenente il 10% di siero bovino fetale (Gibco BRL, Life Technologies, Grand Island, NY, USA), penicillina-G (100 U⋅mL), streptomicina (100 µg⋅mL) e Fungizone (0,25 g⋅mL) (GeminiBio-Products Inc., Woodland, CA, USA) presso 37 °C in atmosfera umidificata al 5% di CO2. La migrazione delle cellule dal tessuto pulpare si è verificata 1 settimana dopo e le colture sono state stabilite e mantenute in terreno di coltura standard. Il mezzo è stato aggiornato tre volte alla settimana e le cellule sono state divise dopo aver raggiunto la confluenza. In questo studio sono state utilizzate cellule di polpa tra il terzo e l'ottavo passaggio (rif).

L'RNA è stato estratto dalle cellule trattate utilizzando RNAiso Plus (TaKaRa Bio, Shiga, Giappone). Il cDNA è stato sintetizzato da 400 ng di RNA totale utilizzando il kit di reagenti PrimeScript RT (TaKaRa Bio, Otsu, Giappone) secondo le istruzioni del produttore. Un decimo del cDNA ottenuto è stato aggiunto per un volume finale di 20 µL per ciascuna reazione contenente SYBR Green I (TaKaRa Bio, Shiga, Giappone). I primer per MMP-2, -8 e -9 erano i seguenti (senso/antisenso):

MMP-2: 5'-ATC CTG GCT TTC CCA AGC TC-3'/3'-CAC CCT TGA AGA AGT AGC TGT G-5'. MMP-8:5'-CTGTTGAAGGCCTAGAGCTGCTGCTCC3'/5'CATCTTCTCTTCAAACTCTACCC-3'. MMP-9: 5'-GGG CTT AGA TCA TTC CTC AGT G-3'/3'-GCC ATT CAC GTC GTC CTT AT-5'. (rif) Le reazioni sono state eseguite su un sistema PCR in tempo reale ABI Step One (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) con il seguente programma: 45 cicli di 95 ° C per 10 s, 60 ° C per 15 s e 72 °C per 20 secondi. Per i confronti relativi di ciascun gene, i ricercatori hanno analizzato il valore del ciclo di soglia (Ct) dei dati PCR in tempo reale utilizzando il metodo 2-ΔΔCt.20 I prodotti della PCR sono stati analizzati su un gel di agarosio all'1,5% contenente 1 pg/mL di bromuro di etidio, che si lega agli acidi nucleici, consentendo la visualizzazione dei prodotti della PCR alla luce UV. Il gel è stato fotografato per consentire la quantificazione dei prodotti come descritto di seguito. Dopo aver trovato la porzione lineare per ciascun set di primer per la quantificazione dei prodotti, i ricercatori hanno quantificato i prodotti con un programma di elaborazione e analisi delle immagini (ScionImage PC, Scion Corporation, Frederick, MD, USA) per analizzare l'espressione di MMP-2, -8 e -9.(ref) Analisi statistica L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando SPSS per Windows versione 25.0 (SPSS, Chicago, IL, USA). Un p-value <0,05 è stato considerato statisticamente significativo.

I dati sono stati analizzati utilizzando un test esatto di Fisher in aggiunta ai test chi-quadrato per eseguire rispettivamente confronti tra e intragruppo.

Il test esatto di Fisher è stato utilizzato per testare i livelli di espressione di MMP-2, -8, -9 tra i gruppi di pulpite reversibile e irreversibile.

Il successo clinico e radiografico a 6, 12 e 18 mesi dei materiali MTA e Biodentine è stato testato mediante il test chi-quadrato.

Il test U di Mann Whitney è stato utilizzato per confrontare le espressioni MMP-2, -8, -9 tra gruppi pulpotomici riusciti e falliti.