Role matrixových metaloproteináz při primární léčbě pulpotomie zubů

Do této studie bylo zahrnuto celkem 63 primárních druhých molárních zubů dolní čelisti 57 zdravých a spolupracujících dětí ve věku 5-10 let. Etická komise Lékařské fakulty Univerzity Ege studii schválila (Referenční č.: 16-7/14). Dětem a rodičům byl vysvětlen podrobný plán léčby a byl získán písemný informovaný souhlas.

Periapické rentgenové snímky byly získány před operací. Pacienti se zubem vykazujícím klinický nebo rentgenový průkaz hluboké kariézní léze zasahující blízko nebo do dřeňové komory byli zvažováni pro potenciální zařazení.

Zuby byly zařazeny do různých skupin podle klinické diagnózy. Diagnóza byla založena na přísných klinických a radiografických kritériích. Když byla zubní dřeň obnažena během odstraňování kazu, byla aplikována následující klinická a rentgenová diagnostická kritéria; Skupina I (zuby s reverzibilní pulpitidou): Mírné klinické příznaky mírné intenzity, mírně přehnaná reakce na studené nebo sladké podněty, žádná anamnéza bolesti, žádná citlivost na žvýkání nebo poklep, doba krvácení z exponované dřeňové tkáně méně než 5 minut a žádné rozšíření prostoru periodontálních vazů. Ve skupině s pulpotomií byly vyloučeny zuby s expozicí dřeně menší než špička, zuby s hnisavým/viskózním, tmavě zbarveným exsudátem detekovaným v místě expozice a nekrotické zuby.

Skupina II (zuby s ireverzibilní pulpitidou): Spontánní bolest, citlivost na žvýkání nebo poklep, doba krvácení z exponované dřeňové tkáně více než 5 minut a rozšíření prostoru periodontálních vazů, periapikální léze.

Z etických důvodů neexistovala žádná kontrolní skupina se vzorky krve ze zdravých zubů bez kazu. Všechny primární stoličky byly rozděleny mezi dvě léčebné skupiny jako pulpotomie (skupina I, n=42) a pulpektomie (skupina II, n=21).

Pulpotomické procedury a všechny odběry byly provedeny stejným operátorem (H.E.G.) podle následujícího postupu: byla podána lokální anestezie (2% lidokain (1:000 000)-Jetokain Simplex, Adeka, Turecko) a zuby byly izolovány gumovou hrází. (Roeko Dental Dam, Coltane, Whaledent, Německo). Kaziózní dentin byl odstraněn z kavity, přičemž se pracovalo od periferie směrem ke středu pomocí nízkorychlostního kulatého frézu (č. 4). Střecha dřeňové komory byla odstraněna a tkáň koronální pulpy byla odebrána pomocí ostrého rypadla. Všechny vzorky buničiny byly umístěny do 1 ml transportního média Tri Pure Reagent v předem zvážených Eppendorfových zkumavkách. Vzorky byly znovu zváženy a hmotnosti byly zaznamenány před uložením při -80 °C až do laboratorních postupů. Ve skupině s pulpektomií (skupina II) byly všechny odběry vzorků provedeny stejně jako ve skupině s pulpotomií.

Ve skupině I byla po odstranění koronální pulpy dutina propláchnuta sterilním fyziologickým roztokem a počáteční krvácení bylo kontrolováno umístěním sterilních bavlněných pelet navlhčených fyziologickým roztokem přes pahýl kořenové dřeně za mírného tlaku a vyčkáváním 5 minut. Do této skupiny byly zařazeny zuby, u kterých bylo možné dosáhnout hemostázy v kanálkových otvorech za 5 minut. Randomizace byla provedena ve dvou skupinách v poměru 1:1 pomocí bezplatného online softwaru (http://www.random.org). Po randomizační proceduře byla pacientům přidělena pořadová čísla v pořadí zařazení a operátor byl informován o materiálu, buď s MTA (n=21), nebo s Biodentinem (n=21).

MTA Group: Podle pokynů výrobce byl prášek MTA (Pro Root White MTA, Dentsply, Tulsa Dental Specialties, USA) smíchán se sterilní vodou v poměru prášek/voda 3:1, aby se získala hustá krémová pasta, a poté umístěn na podlaha dřeňové komory. Směs MTA byla pokryta navlhčenou bavlněnou peletou a poté dočasně uzavřena pomocí skloionomerního cementu (GIC-Ketac Molar Easymix, 3M Espe, Seefeld, Německo) až do druhé návštěvy.

Biodentine Group: Biodentinová (Septodont, Saint-Maur-des-Fossés, Francie) kapsle byla jemně poklepána na tvrdý povrch, aby se prášek rozptýlil, pět kapek tekutiny z dávkovače jedné dávky bylo nalito do kapsle a poté smícháno s 4200 otáčkami za minutu 30 sekund a umístí se přes pahýly buničiny pomocí vhodné špachtle doporučené výrobcem. Po ponechání Biodentinu po dobu 12 minut byly zuby dočasně utěsněny pomocí GIC stejně jako ve skupině MTA.

Po 24 hodinách byly zuby v obou skupinách obnoveny předtvarovanými korunkami z nerezové oceli (3M Espe, korunky z nerezové oceli, Seefeld, Německo). Účastníci byli odvoláni 6, 12 a 18 měsíců po léčbě. Při každé následné návštěvě bylo provedeno klinické a radiografické vyšetření dvěma kalibrovanými zaslepenými vyšetřujícími. Všechny zuby byly hodnoceny klinicky a rentgenově podle kritérií: (1) absence spontánní bolesti a/nebo citlivosti na tlak, (2) absence sinusu, píštěle, edému a/nebo abnormální pohyblivosti, (3) absence radiolucence při interradikulární a/nebo periapikální oblasti, (4) nepřítomnost vnitřní nebo vnější resorpce kořenů. Absence spontánní bolesti, patologické pohyblivosti, citlivosti na poklep, otoku, píštěle a zánětu dásní byla považována za klinický úspěch, zatímco nepřítomnost vnitřní/externí resorpce kořene a periapikální/furkální radiolucence byla považována za rentgenový úspěch. Vápnitá metamorfóza buničiny nebyla považována za poruchu.

Tkáň dřeně byla promývána ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem (Gibco, Invitrogen, Karlsruhe, Německo) po dobu 1 minuty, nařezána na malé kousky, přenesena na misky pro buněčnou kulturu a inkubována s Dulbeccem modifikovaným Eaglovým médiem obsahujícím 10 % fetálního hovězího séra (Gibco BRL, Life Technologies, Grand Island, NY, USA), penicilin-G (100 U⋅ml), streptomycin (100 µg⋅mL) a Fungizone (0,25 g⋅mL) (GeminiBio-Products Inc., Woodland, CA, USA) na 37 °C ve vlhké atmosféře 5% CO2. Migrace buněk z dřeňové tkáně nastala o 1 týden později a kultury byly založeny a udržovány ve standardním kultivačním médiu. Médium bylo obnovováno třikrát týdně a buňky byly rozděleny po dosažení konfluence. V této studii byly použity pulpní buňky mezi třetí a osmou pasáží (odkaz).

RNA byla extrahována z ošetřených buněk pomocí RNAiso Plus (TaKaRa Bio, Shiga, Japonsko). cDNA byla syntetizována ze 400 ng celkové RNA s použitím reagenční soupravy PrimeScript RT (TaKaRa Bio, Otsu, Japonsko) podle pokynů výrobce. Jedna desetina získané cDNA byla přidána na konečný objem 20 ul pro každou reakci obsahující SYBR Green I (TaKaRa Bio, Shiga, Japonsko). Primery pro MMP-2, -8 a -9 byly následující (sense/antisense):

MMP-2: 5'-ATC CTG GCT TTC CCA AGC TC-3'/3'-CAC CCT TGA AGA AGT AGC TGT G-5'. MMP-8:5'-CTGTTGAAGGCCTAGAGCTGCTGCTCC3'/5'CATCTTCTCTTCAAACTCTACCC-3'. MMP-9: 5'-GGG CTT AGA TCA TTC CTC AGT G-3'/3'-GCC ATT CAC GTC GTC CTT AT-5'. (ref) Reakce byly prováděny na systému ABI Step One PCR v reálném čase (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) s následujícím programem: 45 cyklů 95 °C po dobu 10 s, 60 °C po dobu 15 s a 72 °C po dobu 20 s. Pro relativní srovnání každého genu vyšetřovatelé analyzovali hodnotu prahového cyklu (Ct) dat PCR v reálném čase pomocí metody 2-ΔACt.20 Produkty PCR byly analyzovány na 1,5% agarózovém gelu obsahujícím 1 pg/ml ethidium bromidu, který se váže na nukleové kyseliny, což umožňuje vizualizaci produktů PCR pod UV světlem. Gel byl vyfotografován, aby bylo možné produkty kvantifikovat, jak je popsáno níže. Po nalezení lineární části pro každou sadu primerů pro kvantifikaci produktů vyšetřovatelé kvantifikovali produkty pomocí programu pro zpracování obrazu a analýzy (ScionImage PC, Scion Corporation, Frederick, MD, USA), aby analyzovali expresi MMP-2, -8 a -9.(ref) Statistická analýza Statistická analýza byla provedena pomocí SPSS pro Windows verze 25.0 (SPSS, Chicago, IL, USA). P-hodnota <0,05 byla považována za statisticky významnou.

Data byla analyzována pomocí Fisherova exaktního testu navíc k chí-kvadrátovým testům pro provedení meziskupinových a vnitroskupinových srovnání, v daném pořadí.

Fisherův exaktní test byl použit pro testování úrovní exprese MMP-2, -8, -9 mezi skupinami reverzibilní a ireverzibilní pulpitidy.

Klinická a radiografická úspěšnost materiálů MTA a Biodentine po 6, 12 a 18 měsících byla testována chí-kvadrát testem.

Mann Whitney U test byl použit pro srovnání exprese MMP-2, -8, -9 mezi skupinami s úspěšnou a neúspěšnou pulpotomií.