Rola metaloproteinaz macierzy w zabiegach pulpotomii zębów mlecznych

Do badania włączono łącznie 63 mleczne drugie zęby trzonowe żuchwy pochodzące od 57 zdrowych i współpracujących dzieci w wieku od 5 do 10 lat. Komisja Etyczna Wydziału Lekarskiego Uniwersytetu w Ege zatwierdziła badanie (nr referencyjny: 16-7/14). Dzieciom i rodzicom wyjaśniono szczegółowy plan leczenia i uzyskano pisemną świadomą zgodę.

Zdjęcia RTG okolicy wierzchołkowej wykonano przed operacją. Pacjenci z zębem wykazującym kliniczne lub radiologiczne dowody głębokiej zmiany próchnicowej rozciągającej się blisko lub do komory miazgi byli brani pod uwagę do potencjalnego włączenia.

Zęby przydzielono do różnych grup w zależności od rozpoznania klinicznego. Diagnozę oparto na ścisłych kryteriach klinicznych i radiologicznych. W przypadku odsłonięcia miazgi zębowej podczas usuwania próchnicy zastosowano następujące kliniczne i radiologiczne kryteria diagnostyczne; Grupa I (zęby z odwracalnym zapaleniem miazgi): niewielkie objawy kliniczne o niewielkim nasileniu, nieco przesadzona reakcja na bodźce zimne lub słodkie, brak historii bólu, brak wrażliwości na żucie lub opukiwanie, czas krwawienia z odsłoniętej tkanki miazgi poniżej 5 minut oraz brak poszerzenia przestrzeni więzadłowej przyzębia. W grupie pulpotomii wykluczono zęby z obnażeniem miazgi poniżej punktu, zęby z ropnym/lepkim, ciemnym wysiękiem wykrytym w miejscu odsłonięcia oraz zęby martwicze.

Grupa II (zęby z nieodwracalnym zapaleniem miazgi): Ból samoistny, nadwrażliwość na żucie lub opukiwanie, czas krwawienia z odsłoniętej miazgi powyżej 5 minut, poszerzenie przestrzeni więzadłowej, zmiana okołowierzchołkowa.

Ze względów etycznych nie było grupy kontrolnej z próbkami krwi ze zdrowych, wolnych od próchnicy zębów. Wszystkie mleczne zęby trzonowe rozdzielono między dwie grupy leczone jako pulpotomia (grupa I, n=42) i pulpektomia (grupa II, n=21).

Procedury pulpotomii i wszystkie pobieranie próbek zostały przeprowadzone przez tego samego operatora (H.E.G.) zgodnie z następującą procedurą: podano znieczulenie miejscowe (2% lidokaina (1: 000 000)-Jetokain Simplex, Adeka, Turcja) i zęby odizolowano koferdamem (Roeko Dental Dam, Coltane, Whaledent, Niemcy). Próchnicową zębinę usunięto z ubytku, pracując od obwodu w kierunku środka za pomocą okrągłego wiertła wolnoobrotowego (nr:4). Usunięto strop komory miazgi i za pomocą ostrej koparki pobrano miazgę koronową. Wszystkie próbki miazgi umieszczono w 1 ml podłoża transportowego Tri Pure Reagent w uprzednio zważonych probówkach Eppendorfa. Próbki ponownie zważono i zanotowano masy przed przechowywaniem w temperaturze -80°C do czasu wykonania procedur laboratoryjnych. W grupie po pulpektomii (Grupa II) wszystkie procedury pobierania próbek przeprowadzono tak samo jak w grupie po pulpektomii.

W grupie I, po usunięciu miazgi koronowej, ubytek płukano sterylną solą fizjologiczną, a początkowe krwawienie zatamowano poprzez umieszczenie sterylnych płatków bawełnianych zwilżonych solą fizjologiczną na kikucie miazgi korzeniowej, lekko uciskając i odczekując 5 min. Do tej grupy zaliczono zęby, dla których hemostaza w ujściach kanałów mogła zostać osiągnięta w ciągu 5 min. Randomizację przeprowadzono jako dwie grupy w stosunku 1: 1 za pomocą bezpłatnego oprogramowania online (http://www.random.org). Po procedurze randomizacji pacjentom przypisywano kolejne numery zgodnie z kolejnością rejestracji, a operator był informowany o materiale za pomocą MTA (n=21) lub Biodentine (n=21).

Grupa MTA: Zgodnie z zaleceniami producenta proszek MTA (Pro Root White MTA, Dentsply, Tulsa Dental Specialties, USA) zmieszano ze sterylną wodą w stosunku proszek/woda w stosunku 3:1 do uzyskania gęstej kremowej pasty, a następnie nałożono na podłoga komory miazgi. Mieszankę MTA pokryto zwilżonym wacikiem, a następnie czasowo uszczelniono cementem glasjonomerowym (GIC-Ketac Molar Easymix, 3M Espe, Seefeld, Niemcy) do drugiej wizyty.

Grupa Biodentine: Kapsułkę Biodentine (Septodont, Saint-Maur-des-Fossés, Francja) delikatnie postukano o twardą powierzchnię w celu rozproszenia proszku, wlano do kapsułki pięć kropli płynu z dozownika jednodawkowego, a następnie zmieszano z prędkością 4200 obr./min 30 sekund i umieścić na kikutach miazgi za pomocą odpowiedniej szpatułki zalecanej przez producenta. Po pozostawieniu Biodentine do związania na 12 minut, zęby tymczasowo uszczelniono GIC, tak samo jak w grupie MTA.

Po 24 godzinach zęby w obu grupach zostały odbudowane za pomocą wstępnie uformowanych koron ze stali nierdzewnej (3M Espe, Stainless Steel Crowns, Seefeld, Niemcy). Uczestników wezwano ponownie po 6, 12 i 18 miesiącach od zabiegu. Podczas każdej wizyty kontrolnej badania kliniczne i radiograficzne przeprowadzało dwóch skalibrowanych, zaślepionych egzaminatorów. Wszystkie zęby oceniono klinicznie i radiologicznie według następujących kryteriów: (1) brak samoistnego bólu i/lub wrażliwości na nacisk, (2) brak zatoki, przetoki, obrzęku i/lub nieprawidłowej ruchomości, (3) brak przezierności promieniowej w okolice międzykorzeniowe i/lub okołowierzchołkowe, (4) brak resorpcji wewnętrznej lub zewnętrznej korzenia. Brak samoistnego bólu, patologicznej ruchomości, tkliwości przy opukiwaniu, obrzęku, przetoki i zapalenia dziąseł uznano za sukces kliniczny, podczas gdy brak wewnętrznej/zewnętrznej resorpcji korzenia i przezierności okołowierzchołkowej/furkalnej uznano za sukces radiograficzny. Metamorfoza wapniejąca miazgi nie została uznana za niepowodzenie.

Tkankę miazgi przemyto solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (Gibco, Invitrogen, Karlsruhe, Niemcy) przez 1 minutę, pocięto na małe kawałki, przeniesiono na płytki do hodowli komórkowej i inkubowano z pożywką Eagle'a zmodyfikowaną przez Dulbecco zawierającą 10% płodową surowicę bydlęcą (Gibco BRL, Life Technologies, Grand Island, NY, USA), penicylina-G (100 U⋅mL), streptomycyna (100 µg⋅mL) i Fungizone (0,25 g⋅mL) (GeminiBio-Products Inc., Woodland, CA, USA) w 37°C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2. Migracja komórek z tkanki miazgi nastąpiła 1 tydzień później, a hodowle założono i utrzymywano w standardowej pożywce hodowlanej. Pożywkę odświeżano trzy razy w tygodniu, a komórki rozdzielano po osiągnięciu konfluencji. W tym badaniu wykorzystano komórki miazgi między trzecim a ósmym pasażem (ref.).

RNA ekstrahowano z traktowanych komórek przy użyciu RNAiso Plus (TaKaRa Bio, Shiga, Japonia). cDNA zsyntetyzowano z 400 ng całkowitego RNA przy użyciu zestawu odczynników PrimeScript RT (TaKaRa Bio, Otsu, Japonia) zgodnie z instrukcjami producenta. Dodano jedną dziesiątą otrzymanego cDNA do końcowej objętości 20 µl dla każdej reakcji zawierającej SYBR Green I (TaKaRa Bio, Shiga, Japonia). Startery dla MMP-2, -8 i -9 były następujące (sensowny/antysensowny):

MMP-2: 5'-ATC CTG GCT TTC CCA AGC TC-3'/3'-CAC CCT TGA AGA AGT AGC TGT G-5'. MMP-8:5'-CTGTTGAAGGCCTAGAGCTGCTGCTCC3'/5'CATCTTCTCTTCAAACTCTACCC-3'. MMP-9: 5'-GGG CTT AGA TCA TTC CTC AGT G-3'/3'-GCC ATT CAC GTC GTC CTT AT-5'. (ref) Reakcje przeprowadzono w systemie PCR w czasie rzeczywistym ABI Step One (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) z następującym programem: 45 cykli 95 ° C przez 10 s, 60 ° C przez 15 s i 72 °C przez 20 sekund. W celu porównań względnych każdego genu badacze przeanalizowali wartość cyklu progowego (Ct) danych PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu metody 2-ΔΔCt.20 Produkty PCR analizowano na 1,5% żelu agarozowym zawierającym 1 pg/ml bromku etydyny, który przyłącza się do kwasów nukleinowych, umożliwiając wizualizację produktów PCR w świetle UV. Żel sfotografowano, aby umożliwić ilościowe oznaczenie produktów, jak opisano poniżej. Po znalezieniu części liniowej dla każdego zestawu starterów do ilościowego oznaczenia produktów, badacze ocenili ilościowo produkty za pomocą programu do przetwarzania i analizy obrazu (ScionImage PC, Scion Corporation, Frederick, MD, USA) w celu analizy ekspresji MMP-2, -8 i -9.(ref.) Analiza statystyczna Analiza statystyczna została przeprowadzona przy użyciu SPSS dla Windows w wersji 25.0 (SPSS, Chicago, IL, USA). Wartość p <0,05 uznano za istotną statystycznie.

Dane analizowano za pomocą dokładnego testu Fishera oprócz testów chi-kwadrat w celu przeprowadzenia odpowiednio porównań międzygrupowych i wewnątrzgrupowych.

Dokładny test Fishera zastosowano do zbadania poziomów ekspresji MMP-2, -8, -9 pomiędzy grupami z odwracalnym i nieodwracalnym zapaleniem miazgi.

Kliniczny i radiograficzny sukces materiałów MTA i Biodentine po 6, 12 i 18 miesiącach oceniono za pomocą testu chi-kwadrat.

Test U Manna Whitneya zastosowano do porównania wyrażeń MMP-2, -8, -9 między grupami pulpotomii, które zakończyły się sukcesem i niepowodzeniem.