丹麦冠状动脉脱钙 (DANCODE) 试验 (DANCODE)

2. 简介 缺血性心脏病分别占男性和女性所有死亡人数的 19% 和 20%，因此预防至关重要。 缺血性心脏病通常是沉默的，直到出现心肌梗塞的症状。 然而，亚临床冠状动脉疾病很容易通过非对比心脏 CT 扫描检测为冠状动脉钙化 (CAC)。 CAC 随着年龄的增长而增加，男性的 CAC 分数高于女性。 在没有 CAC 的人群中，未来发生 CVD 的风险非常低，但随着 CAC 评分的增加，缺血性心脏病的风险也会增加。 因此，为了预防 CVD，识别和治疗患有严重 CAC 的个体非常重要。

维生素 K 和钙化过程 血管钙化是一个缓慢进行的过程，由促进和抑制钙在血管壁沉积的机制之间的不平衡引起，而维生素 K 依赖性蛋白在这种抑制中起着重要作用。 最熟悉的维生素 K 是叶绿醌（维生素 K1），因为它对激活多种凝血因子至关重要。 甲萘醌（维生素 K2）是另一种非常重要的维生素 K。 维生素 K2 被认为是与抑制动脉钙化相关的蛋白质（即基质-Gla 蛋白 (MGP)）的 γ-羧化所必需的。 没有这些活化的蛋白质，细胞钙吸收的平衡以及骨骼和血管中的矿化过程就会受损。 维生素 K 依赖性蛋白的抑制过程最初由 Luo 等人展示。 1997年。 在小鼠模型中，他们将活化的（羧化的）MGP 描述为血管钙化的重要抑制剂。 同样，观察性人体研究表明，长期使用维生素 K 拮抗剂（抑制 MGP 的羧化）与冠状动脉和冠状动脉外血管钙化增加有关。 此外，与充足的维生素 K 和 D 状态相比，低维生素 K 和 D 状态与全因死亡风险增加有关。

没有补充维生素 K2 的建议；然而，正如一项随机对照试验所证明的那样，通过补充维生素 K2（180 微克/天、360 微克/天或安慰剂）可以剂量依赖性地降低未羧化的 MGP 浓度。 因此，我们知道西方世界的每日摄入量不足以满足完全激活 MGP 的要求。 此外，维生素 K1 或维生素 K2 没有毒性记录，世界卫生组织也没有设定维生素 K 摄入量的上限。

在最近的 AVADEC 试验中检查了高剂量维生素 K2 补充剂（720 微克/天）和维生素 D（25 微克/天）对主动脉瓣进展的影响。 主动脉瓣钙化进展没有显着降低，但似乎减缓了严重 CAC（评分 > 400）患者的 CAC 进展。 此外，心脏事件和全因死亡的数量显着降低（未发表的结果）。 由于这是次要结果，因此要求进行验证性试验。

2.1. 假设 在随机设置中，我们检验了这样的假设，即与安慰剂相比，补充维生素 K2（720 微克/天）和维生素 D（25 微克/天）会减少严重 CAC 患者的 CAC 进展。

3.方法 3.1。 试验设计 该研究是一项双盲、随机、安慰剂对照研究。 3.2. 参与者 CAC 评分高于 400 的患者是符合 DANCODE 条件的患者。

排除标准是：

• 心肌梗塞或冠状动脉血运重建史

• 静脉血栓病史，包括肺栓塞

• 凝血障碍

• 维生素 K 拮抗剂的使用

• 钙磷代谢紊乱（如原发性甲状旁腺功能亢进症）
• 育龄妇女（由于辐射问题）
• 预期寿命 < 5 年 该研究将于 2023 年至 2026 年在丹麦医院进行。 3.3. 干预 患者以 1:1 的比例随机分配到每日口服补充 MK-7（720 μg/天，K2VITAL®Delta）和 D（25 μg/天）或安慰剂组，持续 24 个月。 两组的治疗都将持续至少 24 个月。 在此期间，参与者将每隔 6 个月访问我们的研究单位五次（图 1）。 为了评估 CAC 评分，我们将在基线时以及 12 个月和 24 个月的随访后进行非对比 CT 扫描。

月 0 3 6 9 12 15 18 21 24 知情同意 X 医学访谈 X X X X X 基于网络的调查 X X X X 生化测量 X X X X X Biobank X X X 非造影 CT X X X 造影 CT X X 超声心动图 X X 图 1：试验期间的时间表和应用测试 3.4. 结果 主要终点是 CAC 评分从基线到 24 个月随访的变化。

次要终点是：

• 男性和女性 CAC 评分从基线到 24 个月的变化
• 两个预先指定的亚组（基线 CAC 评分 <1000 和 ≥ 1000）中 CAC 评分从基线到 24 个月的变化
• 对比 CT 从基线到 24 个月冠状动脉斑块成分的变化
• 随访期间的心脏事件（非致死性心肌梗死、冠状动脉血运重建和心源性死亡）
• 随访期间的卒中
• 随访期间的全因死亡率
• 随访期间低能量骨折
• 非造影 CT 从基线到 24 个月的主动脉瓣钙化变化
• 生活质量从基线到 24 个月的变化。

探索性终点是：

• 具有不同磷酸化（p 和dp）和羧化形式（c 和uc）的MGP 的变化。

安全终点是：

• 死亡
• 心血管事件（心肌梗死、冠状动脉血运重建、心脏瓣膜手术、中风、重大主动脉疾病（夹层、破裂和手术）和重大外周动脉疾病（血栓栓塞和手术）
• 静脉血栓栓塞包括肺栓塞
• 出血（包括颅内出血和与血红蛋白下降 ≥ 2mmol/l 相关的出血）
• 癌症，包括实体癌和血液癌
• 实验室测量值（血红蛋白、肌酐 (eGFR)、钠、钾、钙、镁、白蛋白、磷酸盐、碱性磷酸酶、甲状旁腺激素或凝血酶原时间-国际标准化比值 (PT-INR)）显着恶化。

3.5 样本量 我们计划研究独立控制和实验对象的连续响应变量，每个实验对象有 1 个控制。 在 AVADEC 试验中，182 名 CAC 评分≥ 400 的男性的平均（标准差）两年 CAC 进展在安慰剂组为 380 AU（330 AU），在干预组为 288 AU（280 AU）。 联合标准偏差为 311 AU。 如果这在男性和女性群体中是正确的，则需要包含 180 名实验对象和 180 名控制对象才能拒绝原假设，即实验组和对照组的总体均值在概率（功效）0.8 下相等。 与此原假设检验相关的 I 类错误概率为 0.05（双侧）。 因此，需要 360 个科目。 然而，为了符合不确定性和占 10% 的退出率，将包括 400 名患者。 样本量基于两年的治疗。

3.6 分层随机化 随机化由欧登塞大学医院的药房进行。 根据计算机生成的分配方案，药片将根据顺序获得随机编号。

3.7 盲法 片剂具有相同的外观，包括味道、颜色和大小。 随机列表可供数据和安全监测委员会使用，但患者、护士、医生和其他数据收集者在研究期间对分配不知情。

3.8 统计方法 我们将使用意向治疗原则进行所有分析。 主要终点（CAC 分数的变化）将作为连续变量呈现。 此外，分别在男性和女性以及两个预先指定的患者亚组（CAC 评分分别为 400-999 AU 和 ≥ 1000 AU）中分析变化。 主要假设检验将按层次进行以保持封闭的检验程序：只有当整体治疗效果具有统计学显着性时，CAC 层中的检验才会以确认意图进行，否则仅出于探索性原因。 次要终点包括 1) 通过对比 CT 改变冠状动脉斑块成分； 2) 心血管事件和死亡率； 3）平扫CT主动脉瓣钙化改变； 4) 生活质量的改变（另见第 3.4 节）。

我们对主要终点和次要终点以及潜在危害使用一般线性模型（雇用组、时间点和组 x 时间点交互）。 丢失的数据将被如此处理；如果超过 5% 的预期数据点缺失，将对主要分析使用随机缺失假设下的估算值进行补充敏感性分析。

3.9. 患者和公众参与 患者和公众未参与研究设计。

4. 组织指导委员会将由 Axel Diederichsen 教授（OUH 心脏病学系 PI）、Kristian Øvrehus 博士（OUH 心脏病学系）、MD Selma Hasific（OUH 心脏病学系）、Lars Melholt Rasmussen 教授（LMR）组成，临床生物化学和药理学系，OUH），每个筛查点有两个。 有关处理和数据采样的所有实际问题将由指导委员会处理。

数据和安全监测委员会 (DSMB) 由以下专家组成：心脏病学教授 Hans Mickley 和诊断研究临床生物统计学教授 Oke Gerke。 在研究期间，只有独立的数据和安全监测委员会才能访问包括随机列表在内的完整数据库。

数据注册通过 REDCap（研究电子数据捕获）执行，并直接在丹麦南部地区欧登塞患者数据探索网络 (OPEN) 下的服务器上进行日志记录和安全存储。

5. 发表报告主要终点的项目结果将发表在同行评审的国际期刊上。 将报告阳性和阴性结果。

6. 可行性 每年，大约。 在丹麦西部，13,000 名疑似心绞痛患者接受了心脏 CT 检查。 所有数据，包括基线心血管危险因素、缺血性心脏病史和症状、扫描特征和结果，包括 CAC 评分的测量，均前瞻性地收集在丹麦心脏登记处。 约 9% 的心脏 CT 转诊患者的 CAC 评分≥ 400 AU，大约 其中 1/3 将在心脏 CT 后 3 个月内接受冠状动脉血运重建术。 因此，约。 每年有 800 名患者符合参与 DANCODE 的纳入标准。 OUH 的 DANCODE 秘书处将在丹麦心脏登记处确定符合条件的患者，并通过邮件向这些患者发送邀请。 如果患者感兴趣，他/她将被邀请到当地站点与研究护士讨论试验。 如果他/她愿意参加研究，获得知情同意，他/她将被随机分配到维生素 K2 或安慰剂组。 因此，我们能够确定足够的参与者。

7. 安全和伦理 我们将在 DANCODE 中使用与在 AVADEC 试验中使用的完全相同的药片。 因此，积极的治疗是每天 720 微克纯天然维生素 K2 和 25 微克维生素 D。 该剂量耐受性良好，生活质量无差异。 此外，我们观察到放弃研究的参与人数没有差异。

根据 AVADEC 试验，比利时的一项剂量探索研究使用 360、720 或 1080 微克维生素 K2，每周三次，持续 8 周，对慢性血液透析患者没有发现严重的不良反应。 维生素 K2 耐受性良好，不会引起高凝状态。 因此，没有报告与使用维生素 K2 相关的副作用。

在 DANCODE 研究期间，每位患者都将接受 3 次 CT 扫描。 流行病学研究确实表明，辐射暴露与患癌症的风险略有增加有关。 目前尚无涉及接受医疗暴露的成人队列的大型研究，但已考虑线性无阈值模型。 一次非对比心脏 CT 扫描的平均剂量为 1 mSv。 进行了两次额外的对比心脏 CT 扫描（基线和 24 个月），每次平均剂量为 3 mSv，因此 DANCODE 的参与者平均将接受 9 mSv（基线：4 mSv，12 个月：1 mSv 和 24 个月：4毫希）。 相比之下，丹麦每年的本底辐射剂量为 3 毫希沃特，辐射工作者的年平均限值为 20 毫希沃特。

将建立一个独立的 DSMB 来执行持续的安全监督。 DSMB 成员均未直接或间接参与研究的协调、执行或分析。 评估以下内容：1) 严重不良事件（死亡、心肌梗死、冠状动脉血运重建、中风、心脏瓣膜手术和静脉血栓栓塞），以及 2) 实验室测量（肌酐 (eGFR)、钠、钾、钙、镁、白蛋白、磷酸盐、碱性磷酸酶、甲状旁腺激素和凝血酶原时间-国际标准化比值 (PT-INR)）。 如果有理由担心，DSMB 可以建议中断研究以进行进一步分析，如果治疗组的严重不良事件数量明显高于安慰剂组，则可以提前终止研究。 这将在与调查人员和 DSMB 的会议上进行讨论。 如果研究中断或终止，研究者将通知受试者。

如果受试者愿意，他们可以随时出于任何原因离开研究，而不会产生任何后果。 出于紧急医疗原因或在可证明对研究药物的依从性不佳的情况下，研究者可以决定从研究中退出受试者。 这是通过访谈和药片计数来评估的。 如果受试者在研究过程中需要服用维生素 K 拮抗剂，他们将从 DANCODE 中退出。

该协议将得到南丹麦地区科学伦理委员会和数据保护局的批准，并将根据赫尔辛基宣言进行。 根据丹麦药品管理局的说法，维生素 K 是一种膳食补充剂，因此 DANCODE 不是医学试验。 每个参与者都获得了书面知情同意书。 该研究将在 clinicaltrials.gov 上注册。

8. 资金 寻求私人基金会和公司的资金。 我们希望研究药片（包括安慰剂）由挪威的 Kappa Bioscience 和丹麦的 Orkla Care 免费提供。 这些公司不参与研究的设计、执行、数据分析或结果报告。

9. 讨论 CAC，尤其是 CAC 的进展是急性心肌梗死和心血管死亡率的强预测因子。 本研究将在一项随机、安慰剂对照研究中检查补充维生素 K2 对 CAC 进展的影响。 我们假设补充维生素 K2 会减缓 CAC 的进展。 如果显示出积极的效果，则可能会出现一种新的治疗选择，不仅可以预防 CAC 的进展，还可以预防缺血性心脏病。 这项研究的结果预计在 2026 年得出。

10. 研究期间的应用测试 10.1。 医疗访谈 基线数据将在第一次就诊时获得。 在随后的访问中，进行面谈并评估以下内容：心血管疾病事件、胸痛、呼吸困难和生活质量 (EurQol 5D)。 每次访问后 3 个月进行基于网络的调查，以支持依从性并评估可能的副作用。

10.2. 实验室评估 每次就诊时获取血样。 常规参数包括：血红蛋白、肌酐 (eGFR)、尿素、钠、钾、钙、镁、白蛋白、磷酸盐、碱性磷酸酶、甲状旁腺激素和凝血酶原时间国际标准化比值 (PT-INR)。 此外，在第一次和最后一次就诊时测量白细胞、血小板、脂质谱、血红蛋白 A1c、丙氨酸转氨酶、乳酸脱氢酶、胆红素、肌酸激酶、肌钙蛋白 T 和 c-反应蛋白。

作为研究的一部分，将在基线、12 个月和 24 个月的访问时收集每位参与者的 40 mL 血液，然后离心、标记并在 -80°C 下储存在生物库中，直到进行系列测试。 维生素 D 和去磷酸化-羧基化基质 Gla-蛋白 (dp-ucMGP) 在最后一次患者就诊后测量生物样本库样本。

10.3. 多层计算机断层扫描心脏 CT 扫描将使用专用的心脏 CT 扫描仪进行。 根据通常的临床护理进行标准的非造影扫描和造影扫描。 为了评估 CAC 分数，使用了以下 CT 设置：120 kV 管电压，以及 QRS 复合波后 300 毫秒的前瞻性扫描。 对比扫描期间的扫描协议取决于本地 CT 扫描仪和患者心率。 对于心率稳定在每分钟 60 次以上的患者，口服或静脉注射 β 受体阻滞剂直至心率合适（如果可能低于 60 次），并使用前瞻性门控方案。 对于经 β 受体阻滞剂预处理后心率 > 70 bpm 的患者或心律不齐的患者，在执行 QRS 复合波后 200-400 毫秒进行前瞻性扫描。 此外，在扫描前给予舌下含服硝酸盐。 将 50-80 mL 造影剂以 6.0 mL/s 的速度注入肘前静脉，然后使用双头电动注射器将 60 mL 静脉注射生理盐水 (6.0 mL/s)。 数据采集​​参数取决于局部 CT 扫描仪，但切片准直将低于 0.6mm，机架旋转时间尽可能快，管电压为 70 或 120 kV，具体取决于患者的体重。

所有扫描都发送到欧登塞大学医院的核心实验室并在其中进行分析。 CAC 分数是通过使用 Agatston 方法通过总结冠状动脉中所有钙化点来测量的。 根据美国心脏协会 16 段模型的分类，将分析冠状动脉树是否存在 CAD 及其严重程度。 冠状动脉斑块被定义为冠状动脉管腔内或附近的可见结构，可以清楚地将其与血管管腔和周围的心包组织区分开来。 将使用半自动软件分析所有直径≥2 毫米且有斑块的冠状动脉节段。 扫描结果由经验丰富的心脏病专家进行分析。

10.4 超声心动图测量标准的经胸超声心动图在基线和最后一次访问时对比心脏 CT 扫描之前进行，以根据标准实践评估心肌功能和心脏瓣膜。

11.丹麦附录：

12. 参考资料 http://www.ehnheart.org/images/CVD-statistics-report-August-2017.pdf （访问 29 Marts 2022）。

Gerke O 等人。 中老年人群冠状动脉钙化的患病率和程度。 Eur J Prev Cardiol。 2022 年 2 月 9 日；28(18)：2048-2055。

Erbel R 等人。 基于亚临床冠状动脉粥样硬化量化的冠状动脉风险分层、歧视和重新分类改进：Heinz Nixdorf Recall 研究。 J Am Coll Cardiol 2010;56(17):1397-1406。 内政部：10.1016/j.jacc.2010.06.030。

Polonsky TS 等。 冠心病预测的冠状动脉钙化评分和风险分类。 美国医学会杂志 2010；303(16)：1610-1616。 doi：10.1001/jama.2010.461。

Rennenberg RJ 等人。 动脉钙化。 细胞分子医学杂志 2010；14：2203-2210。

Danziger J 等人。 维生素 K 依赖性蛋白质活性和缺血性心血管疾病事件：动脉粥样硬化的多种族研究。 Arterioscler Thromb Vasc Biol 2016;36:1037-1042。

Viegas CS 等人。 富含 Gla 的蛋白质在人体心血管系统中充当钙化抑制剂。 Arterioscler Thromb Vasc Biol 2015;35:399-408。

舒格斯 LJ 等。 基质 Gla 蛋白的维生素 K 依赖性羧化：控制异位矿化的关键开关。 趋势分子医学 2013；19：217-226。

罗克等。 缺乏基质 GLA 蛋白的小鼠动脉和软骨自发钙化。 自然 1997；386：78-81。

Rennenberg RJ 等人。 慢性香豆素治疗与人类冠状动脉外动脉钙化增加有关。 血液 2010；115：5121-5123。

Weijs B 等人。 使用维生素 K 拮抗剂的患者冠状动脉钙化水平升高：一项针对低风险心房颤动患者的观察性研究。 欧洲心脏杂志 2011；32：2555-2562。

舒格斯 LJ 等。 维生素 K 拮抗剂加速动脉粥样硬化钙化并诱导易损斑块表型。 公共科学图书馆一号 2012；7：e43229。

Chaikriangkrai K 等人。 房颤患者亚临床冠状动脉疾病的患病率和意义。 Am J Cardiol 2015;116:1219-1223。

van Ballegooijen AJ 等人。 低维生素 D 和 K 状态会增加死亡风险：一项前瞻性研究。 Eur J Nutr。 2021；60：1645-1654。 doi: 10.1007/s00394-020-02352-8 Dalmeijer GW 等。 甲基萘醌 7 补充剂对基质 Gla 蛋白循环种类的影响。 动脉粥样硬化 2012；225：397-402。

Pucaj K 等人。 合成维生素 K2，甲萘醌 7 的安全性和毒理学评价。 Toxicol Mech Methods 2011;21:520-532。

林德霍尔特 JS 等。 甲萘醌 7 补充剂对主动脉瓣钙化患者的影响：随机对照试验的研究方案。BMJ Open。 2018 年 8 月 23 日；8(8)：e022019。

Diederichsen A 等人。 主动脉瓣钙化 (AVADEC) 患者的维生素 K2 和 D：一项随机双盲临床试验。 循环。 2022. 在新闻。 Caluwe R 等人。 血液透析患者补充维生素 K2：一项随机剂量发现研究。 Nephrol Dial Transplant 2014;29:1385-1390。

Theuwissen E、Cranenburg EC、Knapen MH 等人。 低剂量甲萘醌 7 补充剂可改善肝外维生素 K 状态，但对健康受试者的凝血酶生成没有影响。 Br J Nutr 2012；108：1652-1657。

Pucaj K、Rasmussen H、Moller M、Preston T. 合成维生素 K2、甲基萘醌 7 的安全性和毒理学评价。 Toxicol Mech Methods 2011;21:520-532。

Preston DL、Ron E、Tokuoka S 等人。 原子弹爆炸幸存者的实体癌发病率：1958-1998。 辐射研究 2007；168：1-64。

Einstein AJ, Knuuti J. 心脏成像：辐射重要吗？ 欧洲心脏杂志 2012；33：573-578。

Budoff M 等人。 冠状动脉钙化进展和冠心病事件：MESA（动脉粥样硬化的多种族研究）。 J Am Coll Cardiol。 2013 年 3 月 26 日；61(12)：1231-9。