The DANish COronary DEcalcification (DANCODE) Trial (DANCODE)

2. Introdução A doença isquêmica do coração causa 19% e 20% de todas as mortes entre homens e mulheres, respectivamente, portanto a prevenção é de extrema importância. A cardiopatia isquêmica costuma ser silenciosa até os sintomas do infarto do miocárdio. No entanto, a doença arterial coronariana subclínica é facilmente detectada por tomografias cardíacas sem contraste como calcificações da artéria coronária (CAC). O CAC aumenta com a idade e os homens têm pontuações de CAC mais altas do que as mulheres. Em uma população na qual o CAC está ausente, há um risco muito baixo de DCV futura, mas à medida que o escore do CAC aumenta, também aumenta o risco de doença isquêmica do coração. Assim, para prevenir DCV, é importante identificar e tratar indivíduos com CAC grave.

A vitamina K e o processo de calcificação A calcificação vascular é um processo lentamente progressivo e causado por um desequilíbrio entre os mecanismos que promovem e inibem a deposição de cálcio na parede do vaso, e as proteínas dependentes da vitamina K desempenham um papel essencial nessa inibição. A vitamina K mais conhecida é a filoquinona (vitamina K1), pois é essencial na ativação de vários fatores de coagulação. Menaquinona (vitamina K2) é outra espécie muito importante de vitamina K. A vitamina K2 é considerada necessária para a γ-carboxilação de proteínas relacionadas à inibição da calcificação arterial, ou seja, proteínas Matrix-Gla (MGP). Sem essas proteínas ativadas, o equilíbrio da captação celular de cálcio e o processo de mineralização nos ossos e vasos sanguíneos ficam prejudicados. O processo de inibição das proteínas dependentes da vitamina K foi originalmente demonstrado por Luo et al. em 1997. Em um modelo de camundongos, eles descreveram o MGP ativado (carboxilado) como um importante inibidor da calcificação vascular. Da mesma forma, estudos observacionais em humanos sugerem que o uso prolongado de antagonista da vitamina K (que inibe a carboxilação do MGP) está associado ao aumento da calcificação vascular coronariana e extracoronária. Além disso, o baixo status combinado de vitaminas K e D foi associado ao aumento do risco de mortalidade por todas as causas em comparação com o status adequado de vitaminas K e D.

Nenhuma recomendação de suplementação de vitamina K2 está disponível; no entanto, conforme demonstrado em um estudo controlado randomizado, há uma diminuição dose-dependente das concentrações de MGP não carboxiladas pela suplementação de vitamina K2 (180 µg/dia, 360 µg/dia ou placebo). Assim, sabemos que a ingestão diária no mundo ocidental não é suficiente para atender ao pedido de ativação completa do MGP. Além disso, não há toxicidade documentada para a vitamina K1 ou vitamina K2, e a OMS não estabeleceu nenhum nível de tolerância superior para a ingestão de vitamina K.

O efeito da suplementação de vitamina K2 em altas doses (720 µg/dia) e vitamina D (25 µg/dia) na progressão da válvula aórtica foi examinado no recente estudo AVADEC. A progressão da calcificação da valva aórtica diminuiu de forma não significativa, porém pareceu retardar a progressão da CAC em pacientes com CAC grave (escore > 400). Além disso, o número de eventos cardíacos e morte por todas as causas foi significativamente menor (resultados não publicados). Como este foi um resultado secundário, um ensaio confirmatório é solicitado.

2.1. Hipótese Em uma configuração randomizada, testamos a hipótese de que a suplementação com vitamina K2 (720 µg/dia) e vitamina D (25 µg/dia) em comparação ao placebo reduzirá a progressão da CAC em pacientes com CAC grave.

3. Métodos 3.1. Desenho do estudo O estudo é um estudo duplo-cego, randomizado, controlado por placebo. 3.2. Participantes Pacientes com pontuação CAC acima de 400 são elegíveis no DANCODE.

Os critérios de exclusão são:

• História de infarto do miocárdio ou revascularização coronária

• História de trombose venosa, incluindo embolia pulmonar

• Distúrbios da coagulação

• Uso de antagonista da vitamina K

• Distúrbios do metabolismo do cálcio e do fosfato (como hiperparatireoidismo primário)
• Mulheres em idade fértil (devido a problemas de radiação)
• Expectativa de vida < 5 anos O estudo será realizado em hospitais dinamarqueses, de 2023 a 2026. 3.3. Intervenção Os pacientes são distribuídos aleatoriamente em uma proporção de 1:1 para suplementação oral diária com MK-7 (720 μg/dia, K2VITAL®Delta) e D (25 μg/dia) ou placebo por 24 meses. O tratamento de ambos os grupos durará pelo menos 24 meses. Durante esse período, os participantes visitarão nossa unidade de pesquisa cinco vezes, com intervalos de 6 meses (Figura 1). Para avaliar o escore CAC, faremos uma tomografia computadorizada sem contraste no início e após 12 e 24 meses de acompanhamento.

Mês 0 3 6 9 12 15 18 21 24 Consentimento informado X Entrevista médica X X X X X Pesquisa na Internet X X X X Medições bioquímicas X X X X X Biobanco X X X TC sem contraste X X X TC com contraste X X Ecocardiografia X X Figura 1: Linha do tempo e exames aplicados durante o estudo 3.4. Resultado O endpoint primário é a mudança na pontuação CAC desde a linha de base até 24 meses de acompanhamento.

Os endpoints secundários são:

• Alteração no escore CAC desde o início até 24 meses em homens e mulheres, respectivamente
• Alteração no escore CAC desde o início até 24 meses em dois subgrupos pré-especificados (escore CAC basal <1.000 e ≥ 1.000)
• Alteração na composição da placa coronária por TC de contraste desde o início até 24 meses
• Eventos cardíacos (infarto do miocárdio não fatal, revascularização coronariana e morte cardíaca) durante o período de acompanhamento
• AVCs durante o período de acompanhamento
• Mortalidade por todas as causas durante o período de acompanhamento
• Fratura de baixa energia durante o período de acompanhamento
• Alteração nas calcificações na valva aórtica por TC sem contraste desde o início até 24 meses
• Mudança na qualidade de vida desde o início até 24 meses.

O ponto final exploratório é:

• Alteração do MGP com diferentes formas de fosforilação (p e dp) e carboxilação (c e uc).

Os pontos finais de segurança são:

• Morte
• Eventos cardiovasculares (infarto do miocárdio, revascularização coronariana, cirurgia de válvula cardíaca, acidente vascular cerebral, doença aórtica significativa (dissecção, ruptura e cirurgia) e doença arterial periférica significativa (tromboembolismo e cirurgia)
• Tromboembolismo venoso incluindo embolia pulmonar
• Sangramento (incluindo sangramento intracraniano e hemorragia associada a uma queda na hemoglobina de ≥ 2mmol/l)
• Câncer, incluindo sólidos e hematológicos
• Deterioração significativa nas medições laboratoriais (hemoglobina, creatinina (eGFR), sódio, potássio, cálcio, magnésio, albumina, fosfato, fosfatase alcalina, hormônio da paratireoide ou relação normalizada internacional de tempo de protrombina (PT-INR)).

3.5 Tamanho da amostra Estamos planejando um estudo de uma variável de resposta contínua de controles independentes e sujeitos experimentais com 1 controle por sujeito experimental. No estudo AVADEC, a média (desvio padrão) de dois anos de progressão CAC entre 182 homens com pontuação CAC ≥ 400 foi de 380 UA (330 UA) no grupo placebo e 288 UA (280 UA) no grupo de intervenção. O desvio padrão conjunto foi de 311 UA. Se isso for verdade em uma população de homens e mulheres, a inclusão de 180 sujeitos experimentais e 180 sujeitos de controle são necessários para poder rejeitar a hipótese nula de que as médias populacionais dos grupos experimental e de controle são iguais com probabilidade (poder) 0,8. A probabilidade de erro Tipo I associada a este teste desta hipótese nula é de 0,05 (bilateral). Assim, são necessários 360 sujeitos. No entanto, para atender à incerteza e contabilizar o abandono de 10%, 400 pacientes serão incluídos. O tamanho da amostra é baseado em dois anos de tratamento.

3.6 Randomização estratificada A randomização é realizada pela farmácia do Odense University Hospital. Com base em um esquema de atribuição gerado por computador, os comprimidos terão um número aleatório de acordo com a ordem sequencial.

3.7 Cegueira Os comprimidos têm aparência idêntica, incluindo sabor, cor e tamanho. A lista de randomização está disponível para o conselho de monitoramento de dados e segurança, mas os pacientes, enfermeiros, médicos e outros coletores de dados são cegos para a alocação durante o estudo.

3.8 Métodos estatísticos Usaremos o princípio de intenção de tratar para todas as análises. O endpoint primário (mudança na pontuação CAC) será apresentado como variável contínua. Além disso, as alterações são analisadas em homens e mulheres, respectivamente, e em dois subgrupos de pacientes pré-especificados (escore CAC 400-999 AU e ≥ 1000 AU, respectivamente). O teste de hipótese primária será feito hierarquicamente para manter um procedimento de teste fechado: somente se o efeito geral do tratamento for estatisticamente significativo, o teste em estratos CAC será realizado com intenção confirmatória, caso contrário, apenas por razões exploratórias. Os objetivos secundários incluem 1) mudança na composição da placa coronária por TC de contraste; 2) eventos cardiovasculares e mortalidade; 3) alteração das calcificações na valva aórtica pela TC sem contraste; e 4) mudança na qualidade de vida (ver também Seção 3.4).

Usamos modelos lineares gerais (empregando grupo, ponto de tempo e interação grupo x ponto de tempo) para os endpoints primários e secundários, bem como danos potenciais. Os dados em falta serão tratados como tal; análises de sensibilidade suplementares usando valores imputados sob a hipótese de falta aleatória serão conduzidas para a análise primária se mais de 5% dos pontos de dados esperados estiverem faltando.

3.9. Envolvimento do paciente e do público Os pacientes e o público não foram envolvidos no projeto do estudo.

4. Organização O Comitê Diretivo será composto pelo Professor Axel Diederichsen (PI, Departamento de Cardiologia, OUH), PhD Kristian Øvrehus (Departamento de Cardiologia, OUH), MD Selma Hasific (Departamento de Cardiologia, OUH), Professor Lars Melholt Rasmussen (LMR , Departamento de Bioquímica Clínica e Farmacologia, OUH) e dois de cada local de triagem. Todas as questões práticas relativas ao tratamento e amostragem de dados serão tratadas pelo comitê gestor.

O conselho de monitoramento de dados e segurança (DSMB) é composto pelos seguintes especialistas: Professor de Cardiologia Hans Mickley e Professor de Bioestatística Clínica em Pesquisa Diagnóstica Oke Gerke. Durante o estudo, apenas os dados independentes e o conselho de monitoramento de segurança terão acesso ao banco de dados completo, incluindo a lista de randomização.

O registro de dados é realizado via REDCap (Research Electronic Data Capture) com registro e armazenamento seguro diretamente em um servidor em Odense Patient data Explorative Network (OPEN), região do sul da Dinamarca.

5. Publicação Os resultados do projeto relatando o endpoint primário serão publicados em revistas internacionais revisadas por pares. Achados positivos e negativos serão relatados.

6. Viabilidade Todos os anos, aprox. 13.000 pacientes com suspeita de angina pectoris são examinados por tomografia computadorizada no oeste da Dinamarca. Todos os dados, incluindo fatores de risco cardiovascular basal, histórico de doença isquêmica do coração e sintomas, características do exame e resultados, incluindo medições do escore CAC, são coletados prospectivamente no Registro Cardíaco Dinamarquês. Aproximadamente. 9% dos pacientes encaminhados para TC Cardíaca apresentam escore CAC ≥ 400 UA, e aprox. 1/3 destes serão submetidos a revascularização coronária dentro de 3 meses após a TC Cardíaca. Assim, aprox. 800 pacientes por ano preenchem os critérios de inclusão para participar do DANCODE. A secretaria da DANCODE na OUH identificará os pacientes elegíveis no Registro de Cardiologia Dinamarquês, e um convite será enviado por correio a esses pacientes. Se um paciente estiver interessado, ele/ela é convidado ao local para discutir o estudo com uma enfermeira do estudo. Se ele/ela estiver disposto a participar do estudo, o consentimento informado é obtido e ele/ela é designado aleatoriamente para o grupo de vitamina K2 ou placebo. Assim, somos capazes de identificar participantes suficientes.

7. Segurança e ética Usaremos exatamente os mesmos comprimidos no DANCODE que usamos no estudo AVADEC. Assim, o tratamento ativo é pura vitamina K2 natural 720 µg e vitamina D 25 µg por dia. Esta dose foi bem tolerada sem diferença na qualidade de vida. Além disso, não observamos diferença no número de participantes que abandonaram o estudo.

De acordo com o estudo AVADEC, um estudo belga de determinação de dose usando 360, 720 ou 1080 µg de vitamina K2 três vezes por semana durante 8 semanas em pacientes crônicos em hemodiálise não encontrou efeitos adversos graves. A vitamina K2 foi bem tolerada e não causou estado de hipercoagulabilidade. Assim, não há relatos de efeitos adversos associados ao uso da vitamina K2.

Cada paciente será submetido a três tomografias computadorizadas durante o estudo DANCODE. Estudos epidemiológicos sugerem que a exposição à radiação está associada a um risco ligeiramente aumentado de câncer. Nenhum grande estudo envolvendo coortes de adultos medicamente expostos está disponível, mas um modelo linear sem limiar foi considerado. A dose média de uma tomografia computadorizada cardíaca sem contraste é de 1 mSv. Duas tomografias cardíacas contrastadas adicionais são realizadas (basal e 24 meses) com uma dose média de 3 mSv cada, portanto, em média, os participantes do DANCODE receberão 9 mSv (basal: 4 mSv, 12 meses: 1 mSv e 24 meses: 4 mSv). Para comparação, a dose anual de radiação de fundo na Dinamarca é de 3 mSv, e o limite médio anual para trabalhadores que trabalham com radiação é de 20 mSv.

Um DSMB independente será estabelecido para realizar vigilância de segurança contínua. Nenhum dos membros do DSMB está direta ou indiretamente envolvido na coordenação, execução ou análise do estudo. O seguinte é avaliado: 1) eventos adversos graves (morte, infarto do miocárdio, revascularização coronária, acidente vascular cerebral, cirurgia de válvula cardíaca e tromboembolismo venoso) e 2) medições laboratoriais (creatinina (eGFR), sódio, potássio, cálcio, magnésio, albumina, fosfato, fosfatase alcalina, hormônio da paratireoide e relação normalizada internacional de tempo de protrombina (PT-INR)). Se houver motivo para preocupação, o DSMB pode aconselhar a interrupção do estudo para análise posterior, e o estudo pode ser encerrado prematuramente se o número de eventos adversos graves for significativamente maior no grupo de tratamento em comparação ao grupo placebo. Isso será discutido em uma reunião com os investigadores e o DSMB. O investigador informará os sujeitos em caso de interrupção ou término do estudo.

Os sujeitos podem deixar o estudo a qualquer momento por qualquer motivo, se assim o desejarem, sem quaisquer consequências. O investigador pode decidir retirar um sujeito do estudo por razões médicas urgentes ou em caso de má adesão demonstrável à medicação do estudo. Isso é avaliado por entrevista e contagem de comprimidos. Se os indivíduos forem obrigados a tomar antagonista da vitamina K durante o estudo, eles serão retirados do DANCODE.

O protocolo será aprovado pelo Comitê Regional de Ética Científica do Sul da Dinamarca e pela Agência de Proteção de Dados, e será conduzido de acordo com a Declaração de Helsinque. De acordo com a Agência Dinamarquesa de Medicamentos, a vitamina K é um suplemento dietético e, portanto, o DANCODE não é um ensaio médico. O consentimento informado por escrito é obtido de cada participante. O estudo será registrado em Clinicaltrials.gov.

8. Financiamento Procuram-se financiamentos de fundações e empresas privadas. Esperamos que os comprimidos do estudo, incluindo placebo, sejam fornecidos gratuitamente pela Kappa Bioscience, Noruega e Orkla Care, Dinamarca. As empresas não estão envolvidas no desenho, execução do estudo, análise dos dados ou relato dos resultados.

9. Discussão A CAC e especialmente a progressão na CAC é um forte preditor de infarto agudo do miocárdio e mortalidade cardiovascular. Este estudo examinará o efeito da suplementação de vitamina K2 na progressão da CAC em um estudo randomizado, controlado por placebo. Nossa hipótese é que a suplementação de vitamina K2 retardará a progressão da CAC. Se forem demonstrados efeitos positivos, uma nova opção de tratamento pode estar disponível para prevenir não apenas a progressão da CAC, mas também a doença isquêmica do coração. O resultado deste estudo é esperado em 2026.

10. Testes aplicados durante o estudo 10.1. Entrevista médica Os dados da linha de base serão obtidos na primeira visita. Nas visitas subsequentes é realizada uma entrevista e são avaliados: doença cardiovascular incidente, dor torácica, dispneia e qualidade de vida (EurQol 5D). Uma pesquisa baseada na web é realizada 3 meses após cada visita para apoiar a adesão e avaliar possíveis efeitos colaterais.

10.2. Avaliação laboratorial Amostras de sangue são obtidas a cada consulta. Os parâmetros de rotina incluem: hemoglobina, creatinina (eGFR), uréia, sódio, potássio, cálcio, magnésio, albumina, fosfato, fosfatase alcalina, hormônio da paratireoide e relação normalizada internacional de tempo de protrombina (PT-INR). Além disso, leucócitos, trombócitos, perfil lipídico, hemoglobina A1c, alanina transaminase, lactato desidrogenase, bilirrubina, creatina quinase, troponina T e proteína c-reativa são medidos na primeira e última visita.

Como parte do estudo, 40 mL de sangue de cada um dos participantes serão coletados na linha de base, visita de 12 e 24 meses e centrifugados, rotulados e armazenados a -80°C em um biobanco até testes em série. A vitamina D e a Matrix Gla-Protein desfosforilada-subcarboxilada (dp-ucMGP) são medidas nas amostras do biobanco após a última visita do paciente.

10.3. Varreduras de Tomografia Computadorizada Multi-Slice As varreduras de TC cardíaca serão realizadas usando um scanner de TC cardíaco dedicado. Uma varredura padrão sem contraste e com contraste é realizada de acordo com os cuidados clínicos usuais. Para avaliar os escores de CAC, são usadas as seguintes configurações de TC: voltagem de tubo de 120 kV e uma varredura prospectiva 300 ms após o complexo QRS. O protocolo de varredura durante a varredura de contraste depende do tomógrafo local e da frequência cardíaca do paciente. Em pacientes com frequência cardíaca estável acima de 60 batimentos por minuto, β-bloqueadores por via oral ou intravenosa são administrados até que a frequência cardíaca seja adequada (se possível abaixo de 60), e um protocolo prospectivo fechado é usado. Em pacientes com frequência cardíaca > 70 bpm apesar do pré-tratamento com β-bloqueador ou em caso de ritmo cardíaco irregular, uma varredura prospectiva 200-400 ms após o complexo QRS é realizada. Além disso, nitratos sublinguais são administrados antes do exame. 50-80 mL de agente de contraste são injetados em uma veia antecubital a uma taxa de 6,0 mL/s, seguidos de 60 mL de solução salina intravenosa (6,0 mL/s) usando um injetor de potência de cabeça dupla. Os parâmetros de aquisição de dados dependem do tomógrafo local, mas a colimação do corte será inferior a 0,6 mm, o tempo de rotação do gantry será o mais rápido possível e a voltagem do tubo será de 70 ou 120 kV, dependendo do peso do paciente.

Todas as varreduras são enviadas e analisadas no laboratório principal, Odense University Hospital. A pontuação CAC é medida usando o método Agatston, somando todos os pontos de calcificações nas coronárias. A árvore coronária será analisada quanto à presença e gravidade de DAC, de acordo com a classificação do modelo de 16 segmentos da American Heart Association. As placas coronárias são definidas como estruturas visíveis dentro ou adjacentes ao lúmen da artéria coronária, que podem ser claramente distinguidas do lúmen do vaso e do tecido pericárdico circundante. Todos os segmentos coronários ≥2 mm de diâmetro com placa serão analisados ​​usando um software semi-automatizado. Os exames são analisados ​​por um cardiologista experiente.

10.4 Medições ecocardiográficas Uma ecocardiografia transtorácica padrão é realizada antes da tomografia computadorizada cardíaca contrastada na linha de base e na última visita para avaliar a função miocárdica e as válvulas cardíacas de acordo com a prática padrão.

11. Apêndice dinamarquês:

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