基于细针活检 (FNB) 和手术样本的分子分类一致性

背景信息 甲状腺癌是发病率第 8 位的最常见癌症，自 1992 年以来发病率每年增加 6% 以上。 甲状腺乳头状癌 (PTC) 占甲状腺癌的大多数，甲状腺癌发病率的上升几乎完全归因于小 PTC 检出率的增加 (1)。 PTC 通常预后良好，治愈率高。 然而，大约 10-15% 的 PTC 表现出更具攻击性的行为，并且通常对放射性碘等传统辅助疗法具有抵抗力 (2,3)。 鉴于 PTC 病例数量不断增加（以及医疗保健费用的潜在负担），准确的预测变得越来越重要。 准确估计预后和复发风险将避免对预后良好的个体进行不必要的广泛手术、检查和随访，并将指导对有需要的患者进行更广泛的手术、辅助治疗和长期随访。

美国甲状腺协会 (ATA) 风险分层系统 治疗决策以美国甲状腺协会 (ATA) 风险分层系统为依据，该系统根据临床和病理因素估计疾病复发的风险。 尽管该系统已被多项研究回顾性验证，但所解释的方差比例并非最优，范围为 19%-34% (4, 5)。 ATA 系统无法完全预测复发可能与该系统未能充分整合与肿瘤分子特征相关的风险有关。 目前只有一种分子标记 BRAFV600E 被纳入 ATA 风险分层系统。 ATA 风险分层系统的另一个限制是，它只能在手术后、当评估风险所需的所有临床和病理数据都可用时才能完全实施。 那时，重大的治疗决定已经做出，患者也已经意识到手术的影响。

治疗前评估风险：当前的护理标准 2015 年，ATA 报告了可用于选择患者进行更保守手术（例如甲状腺叶切除术）的标准。 根据2015年ATA指南，术前满足以下标准的患者被认为是低风险：肿瘤大小1-4厘米、临床淋巴结阴性、无甲状腺外扩散、无甲状腺癌家族史、无颈部放射治疗史（ 6). 这些患者最初可以接受甲状腺叶切除术（而不是甲状腺全切除术）。 然而，40 - 60% 的患者需要完成甲状腺切除术，因为术后风险分层（使用术后可用的所有临床和病理信息）将其分类为比最初估计的风险更高的风险 (7-11)。 在最近的一项研究中，51% 的患者需要转为完成甲状腺切除术，因为在手术过程中或在获得最终病理结果后发现了其他危险因素 (12)。 这证明了临床术前风险估计的局限性，以及需要改进的术前风险估计方法。 因此，甲状腺癌外科医生和患者将受益于更多信息，这些信息将改进对适当患者进行肺叶切除术的决定，同时最大限度地减少完成甲状腺切除术的需要。

Thyroid GuidePx®：新的分子风险分层系统 ATA 风险分层系统在可靠地确定预后方面的缺点已通过使用包含 Thyroid GuidePx® 基因特征的新分子风险分层系统得到解决。 使用计算机软件算法，在 335 名 PTC 患者的训练集中鉴定出与复发相关的转录本 (mRNA) 和与无复发相关的转录本，然后在 167 名患者的验证集中进行验证。 数据集中包含的肿瘤是新鲜冷冻的。

根据预后基因的表达模式鉴定了三种分子亚型。 这些被称为 1 型、2 型和 3 型。3 型 PTC 具有最具侵袭性的生物学特性和最高的复发率。 随后在来自韩国的 124 名 PTC 患者以及来自埃德蒙顿的 167 名患者中进行了验证。

分子亚型是在肿瘤分期的背景下考虑的。 具体而言，将不存在淋巴结疾病的直径为 1 - 4 厘米的肿瘤（包括可能接受甲状腺叶切除术的患者）与患有更晚期疾病的患者分开分析。 有趣的是，无论肿瘤分期如何，3 型 PTC 的复发率都很高。 具有 1 型和 2 型 PTC 的肺叶切除候选者的复发率 <3%（图 1A、B，请参阅 Protocol_Calgary_July 11, 2023.docx 随附的）。

测试性能 识别 PTC 分子亚型的基于 NGS 的测试称为 Thyroid GuidePx®。 将使用 Thyroid GuidePx® 对 PTC 进行的分子和临床综合亚分类与 ATA 风险分层系统进行比较。 ATA 风险分层组由两名执业临床医生针对每个病例​​确定。 为了计算受试者工作特征曲线 (AUROC) 下的时间相关面积，应用了二元分类：低风险与中/高风险。 AUROC 是根据 TCGA 发现队列和埃德蒙顿队列的复发结果计算的。 Thyroid GuidePx® 测试结合临床特征（即肿瘤大小和淋巴结受累）实现了最佳风险分层性能。 使用smoothROCtime软件包，考虑肿瘤大小和淋巴结状态时，甲状腺GuidePx®的5年AUROC为0.80，ATA风险分层系统为0.51（图2，请参阅Protocol_Calgary_July 11, 2023.docx 随附的）。

Thyroid GuidePx®：检测描述 Thyroid GuidePx® 测试是一种基于靶向杂交捕获富集 RNA 测序 (RNA-Seq) 的检测方法。 测试输入是从福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 组织或细针活检 (FNB) 甲状腺乳头状癌标本中分离的 RNA。 文库制备涉及特异性扩增 Thyroid GuidePx® panel 中每个基因的目标区域。 该面板由 82 个基因组成。 生成的样品文库被转移到 MiSeq/MiSeqDx 试剂盒中，其中包含用于测序的所有试剂。 实时分析 (RTA) 软件是 MiSeq/MiSeqDx 测序仪的一个组件，可在测序运行期间提供碱基检出和相关质量评分。 生成的 FASTQ 文件包含测序和质量信息。 FASTQ 文件是一种广泛使用的基于文本的文件格式，用于存储每个扩增子的核苷酸序列及其相应的质量得分。 FASTQ 文件用作序列比对算法的输入。 对齐的读数以 BAM 格式写入文件，随后转换为读数计数和表达值。 然后将基因表达水平提交给算法以对风险类别进行分类。

该软件根据 82 个基因 Thyroid GuidePx® 面板中基因组的表达模式对风险进行分类。 根据一项对 502 名患者样本进行的研究，将基因表达模式与 5 年无复发生存率联系起来，定义了三个分子类别。 富含 BRAFV600E 突变的高危人群；并确定了两个风险较低的分子亚组。

临床实用性

Thyroid GuidePx® 提供的更准确的预测可能会影响临床医生的治疗决策。 以下是临床医生如何应用从 Thyroid GuidePx® 获得的新信息的示例：

1. 低风险 PTC 可以通过部分甲状腺切除术（例如，肺叶切除术）甚至主动监测来治疗，而不是进行甲状腺全切除术。 除了节省时间和成本之外，这还有两个主要好处。 首先，肺叶切除术后终生替代甲状腺激素的潜在需求减少。 其次，甲状腺全切除术几乎不存在潜在的破坏性并发症的风险，例如双侧喉返神经损伤或永久性甲状旁腺功能减退症。
2. 准确识别低风险 PTC 也将提高辅助放射性碘 (RAI) 的适用性。 RAI 治疗可能会导致短暂和长期的副作用，例如唾液腺功能障碍、卵巢和睾丸功能障碍以及骨髓抑制。 RAI 治疗理论上也存在继发性恶性肿瘤的风险：据估计，100mCi 131I 每 10,000 名接受治疗的患者会诱发 56 例恶性肿瘤 (15)。 将 RAI 治疗限制于那些能够改善总体生存率或无病生存率的患者也是具有成本效益的。
3. PTC 的监测可能会给患者和医疗机构带来压力，原因有两个：PTC 最常见于中年诊断，患者在诊断后通常可以存活很长一段时间。 这意味着早期发现复发的定期检查和调查可以持续很多年。 随访通常包括年度体检、促甲状腺激素和甲状腺球蛋白的血清测量以及定期颈部超声检查。 低风险患者的随访检查和调查之间的间隔可能会增加，并且可能会退出监测。
4. 准确识别复发风险高的患者也很重要。 众所周知，ATA 风险分层系统在预测复发方面并不准确。 在使用 2015 年 ATA 风险分层系统分类为“低风险”的患者中，16% 的患者最终出现复发性疾病 (16)。 由于这种风险分类，这些患者可能得不到充分治疗。 对于能够更准确地分配高风险的患者，可以考虑更积极的治疗（即甲状腺全切除术和 RAI）或参加临床试验。

细针活检的甲状腺 GuidePx® 迄今为止，我们的研究都是使用手术标本进行的，并且已经以这种形式生产了市售的检测方法。 然而，健康经济研究所最近的一项研究确定，通过在手术前进行测试可以提高 Thyroid GuidePx® 的成本效益。 术前实施测试需要使用来自细针活检 (FNB) 的样本进行良好的测试。

甲状腺 FNB 通常在 CytoLyt（一种基于甲醇的缓冲液体防腐剂）中保存长达 7 天，然后将细胞转移至 ThinPrep 进行细胞学评估。 我们和其他人 (17-21) 之前已经确定可以从 CytoLyt 的细胞中提取优质 DNA 和 RNA。 我们最近对 12 名 PTC 患者进行的可行性研究表明，对 FNB 进行 Thyroid GuidePx® 检测是可行的。 截至目前，技术成功率已达100%，与手术样本的基因水平一致性超过0.9。 然而，依赖有限的 FNB 进行分子疾病表征意味着样本代表了整个肿瘤。 原发性肿瘤和转移瘤中存在基因组和转录组异质性 (23)。 因此，记录 FNB 采集的样本与手术样本之间的一致性非常重要。

试验目的和目的本研究的总体目的是确定细针活检中更有限的样本是否足以代表较大的肿瘤，以便使用 Thyroid GuidePx® 测试确定有效的分子分类。

主要目标 1。 确定从 FNA 获取的甲状腺 GuidePx® 分子分类与匹配的手术样本之间的一致性。

次要目标

1. 比较使用 FNA 和手术样本完成有效 Thyroid GuidePx® 的技术成功率。
2. 比较使用 ATA 风险分层系统的复发结果与使用手术样本通过 Thyroid GuidePx® 分类的患者。
3. 比较使用 ATA 风险分层系统的复发结果与使用 FNA 样本通过 Thyroid GuidePx® 分类的患者。

试验设计试验示意图（请参阅Protocol_Calgary_July 11, 2023.docx 随附的）

样本采集和分析 如果患者术前组织诊断为 PTC (Bethesda VI) 或可疑 PTC (Bethesda V)，并且符合纳入和排除标准中所述的部分或全部甲状腺切除术，则将邀请患者参加。 在同意后，患者将按照外科医生的计划接受手术。 将从所有参与者处获取人口统计、临床和病理数据。

在手术过程中，当甲状腺和肿瘤暴露时，外科医生将在直视下对显性肿瘤（即术前确定的病变）进行 FNB。 这最接近地模拟了术前 FNB 的体内条件，但限制了经皮活检的潜在技术缺陷（例如：病变靶向不充分）。 来自 FNB 的细胞材料将立即放入运输介质 (CytoLyt) 中，然后冷藏。 样品将每周送往中心实验室进行 RNA 分离和 RNASeq。 同时，训练有素的细胞病理学家将检查 FNB 样本中是否存在肿瘤细胞。

如果存在多个结节，外科医生将为病理学家标记 FNB 结节。 在合作病理学家的指导下，将切除一块肿瘤并速冻，并取相邻的一块进行福尔马林固定和石蜡包埋 (FFPE)。 将制备来自 FFPE 样品的一张经过 H&E 染色的 H&E 切片和 3 - 6 个未染色的切片，然后送往中心实验室进行显微切割、RNA 分离和 RNASeq。 该过程将遵循常规标本处理方案，不会干扰病理诊断的标准方法。

如果患者签署了可选的生物样本库知情同意书，如果有足够的剩余冷冻样本，样本将被保留用于重新测试（如果需要）或支持其他研究，例如全转录组分析和突变分析。 将这些样本用于这些目的需要额外的道德批准。

一项由 12 名患者参与的可行性研究已经完成。 获取样本和进行检测的技术成功率为 100%，FNB 中的 RNA 数量和质量非常出色，并且 FNB 和手术样本进行的检测具有出色的基因水平一致性。

RNASeq for Thyroid GuidePx® 将在 OncoHelix 进行，该实验室位于卡尔加里大学卡明医学院，拥有精准肿瘤学专业知识。 如果 OncoHelix 无法及时进行测试，样本将在 Protean BioDiagnostics 进行测试，Protean BioDiagnostics 是一家位于佛罗里达州奥兰多的 CAP/CLIA 认证实验室，目前正在进行商业测试。 Qualisure Diagnostics 设计的软件将使用 RNASeq 生成的数据来分配风险类别。

端点

主要终点：

1.甲状腺乳头状癌FNB和匹配冷冻手术样本的一致性、分子风险分类

次要终点：

1. 使用 FNB 完成有效 Thyroid GuidePx® 的技术成功率
2. 在 FFPE 手术样本中完成有效甲状腺 GuidePx® 的技术成功率。
3. 5 年生化复发率（甲状腺球蛋白 ≥ 1 ng/mL，仅接受甲状腺全切除术的患者）
4. 5 年结构性复发率

5. 作为预后测试的测试性能，Thyroid GuidePx®：FNB 和手术样本

   1. 特异性：测试预测无结构性复发的患者比例
   2. 敏感性：测试识别疾病将在 5 年内复发的个体的能力（预测的结构性复发的比例）
   3. 奥罗克
   4. 阳性预测值
   5. 阴性预测值

6. 性能、ATA 风险分层

   1. 特异性：测试预测无结构性复发的患者比例
   2. 敏感性：测试识别疾病将在 5 年内复发的个体的能力（预测的结构性复发的比例）
   3. 奥罗克
   4. 阳性预测值
   5. 阴性预测值

盲法和偏差限制 只有具有足够 RNA 质量 (DV200>30) 的样本才会被纳入分析中。 只有含有肿瘤细胞（“细胞学阳性”）的 FNB 才会包含在一致性计算中。 RNASeq 将由不了解任何临床细节的技术人员执行。 技术人员将无法从手术标本和 FNB 中识别出匹配的样本。 分子分类将以盲法进行。 数据将由独立的数据监测委员会进行监测。 数据监测委员会由至少三人（包括一名统计学家）组成，负责监测数据分析。

停止规则在我们的手术样本中，批次间和批次内重复的基因水平一致性始终>0.9。 将监测每批 24 名患者的细胞学阳性 FNB 和冷冻手术样本（“金标准”）之间的基因水平一致性。 如果 R<0.9，我们将暂停重新评估分析工作流程和仪器。 如果 72 名患者后一致性持续低于 0.9，我们将停止评估 FNB，但我们将继续测试手术样本。 由于这不是一项高风险研究，我们不打算提前终止试验。 即使 FNB 和手术样本之间的一致性较低，从与分子分类（手术样本中）相关的研究结果中获得的数据也将是有用的。

受试者的选择和退出纳入标准

1. 年龄≥18岁
2. 基于细针活检 (FNB) 的贝塞斯达 V 或 VI 细胞学诊断诊断甲状腺乳头状癌
3. 肿瘤大小最大直径 > 1 cm
4. 患者是手术候选人
5. 患者已同意

排除标准

1. 甲状腺癌家族史
2. 颈部放射史
3. 无法或不愿意进行细针活检
4. 不愿意接受甲状腺切除术
5. 最终病理结果未显示甲状腺乳头状癌
6. 无明显优势结节的病例
7. 存在多个结节而无法对特定结节进行采样的情况

受试者退出标准 受试者可以通过通知一名研究者或研究人员随时停止参与。 提款前获取的数据将用于分析，但提款后不会收集任何额外数据。 根据受试者的要求，可以在测试前提取样本。 如果样本未经 RNASeq (Thyroid GuidePx®) 测试，受试者将被更换。

受试者的治疗 Thyroid GuidePx® 确定的分子分类和复发风险将向医生和患者公开。 复发风险基于累积验证数据，包括艾伯塔省和澳大利亚的病例。 仅披露冷冻手术样本（“金标准”）的结果。 按照通常的标准，治疗决策将由医生与患者合作，根据所有可用的临床信息综合做出。 该临床试验没有定义治疗途径。 随访频率和持续时间不会由方案规定，而是由治疗医生决定。 这是一项非干预性研究，因此不会监测依从性。

疗效评估 次要结果是对复发风险进行分层的测试表现。 将比较 FNB 采集的样本和手术样本的测试性能，然后与当前的护理标准（ATA 风险分层系统）进行比较。 复发时间将从完成初始治疗的时间开始计算。 对于手术后仍有微小疾病的患者，从完成放射性碘治疗剂量开始计算到复发的时间。 复发事件将根据 2016 年美国甲状腺协会指南进行定义。

以下标准表示治疗后无病状态： (i) 无肿瘤临床证据； (ii) 放射性碘成像和/或宫颈超声检查没有发现肿瘤的证据； (iii) 对于甲状腺全切除术后，未刺激的血清甲状腺球蛋白 (Tg) <0.2 ng/ml；对于肺叶切除术后，未刺激的 Tg<30。 对治疗的不确定反应将被定义为： (i) 没有肿瘤的临床证据； (ii) 放射性碘成像和/或宫颈超声检查没有发现肿瘤的证据； (iii) 对于甲状腺全切除术后，未刺激的 Tg 0.2 - 1；对于肺叶切除术后，Tg>30。 甲状腺全切除术后，生化不完全反应定义为在不存在结构性疾病的情况下 Tg>1。 Tg 值仅在不存在干扰抗体 (TgAb) 的情况下才可靠 (6)。

如果患者在上次手术后 1 年内在没有 TgAb 的情况下未检测到 Tg，并且颈部超声检查呈阴性，则疾病将被定义为真正的复发。 持续性疾病将被定义为 Tg 大于上述阈值、颈部超声异常、TgAb 水平持续升高或存在远处转移。

患有持续性疾病和/或转移性疾病（非治愈性切除）的患者将不包括在无复发生存期的计算中。

安全性评估 与标准临床护理的唯一不同之处是 FNB 术中采集样本。 然而，与计划的手术相比，这种风险很小。 主要风险是临床显着出血的小风险，估计<1%。 由于本研究不会进行任何干预，因此没有监测不良事件的计划。

统计 CytoLyt 中样品的 RNASeq 条件优化 RNA 将按照 SOP 从 CytoLyt 中的 FNB 中分离出来。 RNA 数量将由 NanoDrop 评估，质量将由 DV200 量化。 RNASeq 将以不同的读取深度在 CytoLyt 样品和匹配的冷冻样品中进行。 在配对的 CytoLyt 和 FFPE 组织中，检测指标将根据输入组织储存方法、RNA 质量 (DV200) 和储存时间进行评估。 将比较配对的 CytoLyt 和冷冻组织中的基因表达，然后在条件之间进行关联。 最重要的结果，即分子类别分配，将在配对样本中进行比较。

将根据美国病理学家学会 (CAP) 下一代测序特定要求清单，对每个实验的以下性能指标进行评估：

测定指标

a) RNASeq 指标： (i) 读数计数（总读数、唯一读数、重复读数、rRNA 读数、链特异性）； (ii) 覆盖率（覆盖给定基因组位置的读数数量）：平均覆盖率、平均变异系数、5'/3' 覆盖率、覆盖率差距、GC 偏差 (iii) 表达相关性（测量的表达水平与已知水平b) 个体基因检测： (i) 分析灵敏度：正确识别 ERCC 内标中每个基因的病例比例。

(ii) 分析特异性：能够识别是否存在构成 ERCC 内标的基因 (iii) 准确性：灵敏度 + 特异性

FNB 标本和手术标本中确定的分子风险分层 (甲状腺 GuidePx®) 的比较 最终病理学结果未证明甲状腺乳头状癌的患者将被排除在一致性分析之外。 同样，细胞学阴性的 FNB 样本将被排除在一致性分析之外。 将比较 FNB 获得的样本和匹配的冷冻手术标本之间的分子类别分配。 手术样本将被视为黄金标准。 kappa 统计量将用于确定两种样本类型之间一致性的显着性。

将使用 Thyroid GuidePx® 和 ATA 风险分层系统以盲法分配风险分层。 将比较每个风险类别的 5 年结构和生化复发率。 以疾病状态（结构性复发）为条件的二元测试结果将用于评估测试准确性。 结构性复发代表了黄金标准。 将使用两个相关比例的 2 边 McNemar 检验来评估每种风险分层方法的敏感性和特异性，并使用 Holm 的多重性调整来单独评估每个准确性度量。

甲状腺 GuidePx® 的性能

根据上述研究，甲状腺 GuidePx® 的性能将在 FNB 样本和手术样本中分别进行评估。 性能特征将评估如下：

1. 与时间相关的 AUROC（接收者操作曲线下面积）(24)。 出于计算的目的，阳性测试的阈值水平是中度或高风险的指定（因为预计中度风险分配将导致显着不同的临床决策）。
2. 敏感性：按照 5 年累积敏感性计算，如 Kamarudin 和 Kolamunnage-Dona 所描述 (24)
3. 特异性：按照动态特异性计算，如 Kamarudin 和 Kolamunnage-Dona 所描述 (24)

样本量计算 我们将比较来自 109 名患者的手术标本和匹配的 FNB 的分子风险分配。 临床可接受的最低一致性水平为 80%。 样本量计算基于 Lin's Kappa 统计，以确保三个分子亚组的两种测量值之间的一致性 (25)。 应用双边假设，显着性水平为 0.05，功效固定为 90%。 分子亚组大小固定为 23%（类型 1）、49%（类型 2）和 28%（类型 3）。 如果零假设是 FNB 和手术样本之间的一致性水平为 0.6，那么我们将能够检测到 109 名患者的一致性水平为 0.8 或更高。 假设一致的无效水平相同，则 40 名患者的一致性为 0.90。

约 25% 接受 Bethesda V 细胞学检查的患者和约 5% 接受 Bethesda VI 细胞学检查的患者患有良性疾病。 此外，在大约 5% 的情况下，FFPE 样品中的 RNASeq 质量不足。 基于此，我们计划辍学率为20%。 因此，该试验设计为包括 130 名患者。

直接访问源数据/文件 临床试验站点将允许与试验相关的监测、审计、REB 审查和监管检查，从而提供对源数据/文件的直接访问。

进行临床试验审核的目的是确保患者的权利、安全和福祉得到适当保护，评估对方案、流程和协议、ICH 良好临床实践标准和适用监管要求的遵守情况，并评估数据质量。

国内监管机构可以随时对研究场所进行审计或检查。 该审计包括与主要研究者和研究团队的面谈、文件和实践的审查、设施、设备和源数据验证的审查。

研究者将授予任何国内监管机构直接访问与临床研究相关的纸质和/或电子文件的权限（例如， CRF、源文档，例如医院患者图表和研究者研究文件）。 在审核期间可以访问与研究行为相关的所有现场设施（例如 实验室、门诊）。 调查员同意在合理的时间和地点对任何审计活动进行合作并提供协助。

质量控制和质量保证 首席研究员将确保所有研究成员都遵循方案并遵守监管​​和良好临床实践标准。 所有临床试验地点将允许与试验相关的监测、审计、REB 审查和监管检查，从而提供对源数据/文件的直接访问。

数据监测委员会 (DMC) 将在试验期间召开如下会议： 1. 试验开始后，最终确定 DMC 章程； 2. 报名人数达到24人后； 3. 72名参与者报名后； 4. 注册完成后。

道德规范 负责的研究者将确保本研究的进行符合《赫尔辛基宣言》。 本研究将根据所有研究的加拿大和国际良好临床实践标准进行，包括 ICH 良好临床实践三方协调指南。 还将遵循适用的政府法规、NNHPD 临床试验指南和艾伯塔省卫生服务研究政策和程序。

该方案和任何修正案将提交给 HREBA-CC 正式批准进行研究。 HREBA-CC 关于开展研究的决定将以书面形式提交给研究者。

公开手术样本的分子风险分类（“金标准”）是合理的，因为手术样本中有大量结果数据。 此外，当该试验启动时，该测试将作为实验室开发测试（LDT）投入商业使用。

数据处理和记录保存 研究完成后，本研究的所有数据将保留 15 年，按照协议存储在卡尔加里临床研究中心。

融资和保险 该试验将由 Qualisure Diagnostics, Inc. 资助，并辅以同行评审赠款。 保险将由卡尔加里大学和艾伯塔省健康服务中心以及 Qualisure Diagnostics 提供。

出版政策 这项临床研究的结果将发表在同行评审的期刊上，所有指定的研究人员都是共同作者。 所有资金来源都将得到承认。

6.0 描述高于标准实践或除标准实践之外的程序、治疗或活动： .

与标准临床护理的唯一不同是 FNB 术中采集样本。 然而，与计划的手术相比，这种风险很小。 主要风险是临床显着出血的小风险，估计<1%。 由于本研究不会进行任何干预，因此没有监测不良事件的计划。

在手术过程中，当甲状腺和肿瘤暴露时，外科医生将在直视下对显性肿瘤（即术前确定的病变）进行 FNB。 这最接近地模拟了术前 FNB 的体内条件，但限制了经皮活检的潜在技术缺陷（例如：病变靶向不充分）。

在合作病理学家的指导下，将切除一块肿瘤并速冻，并取相邻的一块进行福尔马林固定和石蜡包埋。 只有在获取足够的组织用于诊断和临床用途后，组织才会被释放用于研究。