Übereinstimmung der molekularen Klassifizierung basierend auf Feinnadelbiopsie (FNB) und chirurgischen Proben

HINTERGRUNDINFORMATIONEN Schilddrüsenkrebs ist gemessen an der Prävalenz die achthäufigste Krebsart und die Inzidenz steigt seit 1992 um >6 % pro Jahr. Papillärer Schilddrüsenkrebs (PTC) ist die häufigste Form von Schilddrüsenkrebs, und die steigende Inzidenz von Schilddrüsenkrebs kann fast ausschließlich auf die erhöhte Erkennung kleiner PTCs zurückgeführt werden (1). PTC hat in der Regel eine günstige Prognose mit hohen Heilungsraten. Allerdings zeigen etwa 10–15 % der PTCs ein aggressiveres Verhalten und sind häufig resistent gegen herkömmliche adjuvante Therapien wie radioaktives Jod (2,3). Angesichts der steigenden Zahl von PTC-Fällen (und der möglichen Belastung der Gesundheitskosten) wird eine genaue Prognose immer wichtiger. Durch genaue Schätzungen der Prognose und des Risikos eines erneuten Auftretens werden unnötig umfangreiche Operationen, Untersuchungen und Nachsorgeuntersuchungen bei Personen mit einer guten Prognose vermieden und umfangreichere Operationen, adjuvante Therapien und längere Nachsorgeuntersuchungen an diejenigen gerichtet, die diese benötigen.

Das Risikostratifizierungssystem der American Thyroid Association (ATA) Behandlungsentscheidungen werden durch das Risikostratifizierungssystem der American Thyroid Association (ATA) beeinflusst, das das Risiko eines erneuten Auftretens der Krankheit auf der Grundlage klinischer und pathologischer Faktoren schätzt. Obwohl dieses System durch eine Reihe von Studien retrospektiv validiert wurde, ist der Anteil der erklärten Varianz suboptimal und liegt zwischen 19 % und 34 % (4, 5). Die Unfähigkeit des ATA-Systems, ein Wiederauftreten vollständig vorherzusagen, hängt möglicherweise damit zusammen, dass dieses System das mit dem molekularen Profil eines Tumors verbundene Risiko nicht angemessen berücksichtigt. Derzeit ist nur ein molekularer Marker, BRAFV600E, im ATA-Risikostratifizierungssystem enthalten. Eine weitere Einschränkung des ATA-Risikostratifizierungssystems besteht darin, dass es erst nach einer Operation vollständig implementiert werden kann, wenn alle zur Risikoabschätzung erforderlichen klinischen und pathologischen Daten verfügbar sind. Zu diesem Zeitpunkt wurden bereits wichtige Behandlungsentscheidungen getroffen und die Auswirkungen der Operation wurden vom Patienten bereits erkannt.

Risikoabschätzung vor der Behandlung: Der aktuelle Versorgungsstandard Im Jahr 2015 berichtete die ATA über Kriterien, die zur Auswahl von Patienten für konservativere Operationen wie die Schilddrüsenlobektomie herangezogen werden könnten. Gemäß den ATA-Richtlinien von 2015 gelten Patienten mit den folgenden präoperativen Kriterien als risikoarm: Tumorgröße 1–4 cm, klinisch nodalnegativ, keine extrathyroidale Ausbreitung, kein Schilddrüsenkrebs in der Familienanamnese und keine Strahlentherapie des Halses in der Vorgeschichte ( 6). Diese Patienten könnten zunächst mit einer Schilddrüsenlobektomie (im Gegensatz zu einer totalen Thyreoidektomie) behandelt werden. Bei 40–60 % ist jedoch eine vollständige Thyreoidektomie erforderlich, da die postoperative Risikostratifizierung (unter Verwendung aller nach der Operation verfügbaren klinischen und pathologischen Informationen) sie als ein höheres Risiko einstufte als ursprünglich angenommen (7–11). In einer aktuellen Studie benötigten 51 % der Patienten eine Umstellung auf eine vollständige Thyreoidektomie, weil zusätzliche Risikofaktoren während der Operation oder nach Vorliegen der endgültigen Pathologie erkannt wurden (12). Dies zeigt die Grenzen der klinischen präoperativen Risikoabschätzung und die Notwendigkeit einer verbesserten Methode zur präoperativen Risikoabschätzung. Daher würden Schilddrüsenkrebschirurgen und Patienten von zusätzlichen Informationen profitieren, die die Entscheidung zur Durchführung einer Lobektomie bei geeigneten Patienten präzisieren und gleichzeitig die Notwendigkeit einer vollständigen Schilddrüsenentfernung minimieren würden.

Thyroid GuidePx®: Ein neues molekulares Risikostratifizierungssystem Die Mängel des ATA-Risikostratifizierungssystems bei der zuverlässigen Bestimmung der Prognose wurden durch den Einsatz eines neuen molekularen Risikostratifizierungssystems behoben, das die Thyroid GuidePx®-Gensignatur umfasst. Mithilfe eines Computersoftwarealgorithmus wurden Transkripte (mRNA), die mit einem erneuten Auftreten in Zusammenhang stehen, und Transkripte, die mit dem Ausbleiben eines erneuten Auftretens verbunden sind, in einem Trainingssatz von 335 Patienten mit PTC identifiziert und anschließend in einem Validierungssatz von 167 Patienten validiert. Die im Datensatz enthaltenen Tumoren waren frisch eingefroren.

Basierend auf dem Expressionsmuster prognostischer Gene wurden drei molekulare Subtypen identifiziert. Diese wurden als Typ 1, Typ 2 und Typ 3 bezeichnet. PTCs vom Typ 3 hatten die aggressivste Biologie und die höchste Rezidivrate. Anschließend wurde die Studie an 124 PTC-Patienten aus Korea sowie 167 Patienten aus Edmonton validiert.

Die molekularen Subtypen wurden im Zusammenhang mit dem Tumorstadium betrachtet. Insbesondere wurden Tumoren mit einer Größe von 1 bis 4 cm ohne Lymphknotenerkrankung (darunter Patienten, die potenzielle Kandidaten für eine Schilddrüsenlobektomie wären) getrennt von Patienten mit fortgeschrittener Erkrankung analysiert. Interessanterweise hatten Typ-3-PTCs unabhängig vom Tumorstadium eine hohe Rezidivrate. Lobektomiekandidaten mit PTCs vom Typ 1 und Typ 2 hatten eine Rezidivrate von <3 % (Abbildung 1A, B, siehe Protocol_Calgary_July 11, 2023.docx). beigefügt).

Testleistung Der NGS-basierte Test, der den molekularen Subtyp von PTC identifizierte, hieß Thyroid GuidePx®. Die kombinierte molekulare und klinische Unterklassifizierung von PTC mithilfe von Thyroid GuidePx® wurde mit dem ATA Risk Stratification System verglichen. Die ATA-Risikostratifizierungsgruppen wurden für jeden Fall von zwei praktizierenden Ärzten festgelegt. Zur Berechnung der zeitabhängigen Fläche unter der Receiver Operating Characteristic Curve (AUROC) wurde eine binäre Klassifizierung angewendet: geringes Risiko versus mittleres/hohes Risiko. AUROC wurde auf der Grundlage der Wiederholungsergebnisse der TCGA-Entdeckungskohorte und der Edmonton-Kohorte berechnet. Die beste Risikostratifizierungsleistung wurde durch den Thyroid GuidePx®-Test in Verbindung mit klinischen Merkmalen (d. h. Tumorgröße und Lymphknotenbefall) erzielt. Unter Verwendung des SmoothROCtime-Pakets betrug der 5-Jahres-AUROC 0,80 für Thyroid GuidePx® unter Berücksichtigung der Tumorgröße und des Lymphknotenstatus und 0,51 für das ATA-Risikostratifizierungssystem (Abbildung 2, siehe Protocol_Calgary_July 11, 2023.docx). beigefügt).

Thyroid GuidePx®: Assay-Beschreibung Der Thyroid GuidePx®-Test ist ein Assay, der auf gezielter Hybrid-Capture-Enrichment-RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) basiert. Der Testeingang besteht aus RNA, die aus formalinfixiertem, in Paraffin eingebettetem (FFPE) Gewebe oder Feinnadelbiopsieproben (FNB) von papillärem Schilddrüsenkrebs isoliert wurde. Bei der Bibliotheksvorbereitung werden die Zielregionen jedes einzelnen Gens im Thyroid GuidePx®-Panel gezielt verstärkt. Das Panel besteht aus 82 Genen. Die resultierenden Probenbibliotheken werden auf eine MiSeq/MiSeqDx-Reagenzienkartusche übertragen, die alle Reagenzien für die Sequenzierung enthält. Die Echtzeitanalysesoftware (RTA), eine Komponente des MiSeq/MiSeqDx-Sequenzers, stellt während des Sequenzierungslaufs Basisaufrufe und zugehörige Qualitätsbewertungen bereit. Es werden FASTQ-Dateien generiert, die die Sequenzierungs- und Qualitätsinformationen enthalten. Die FASTQ-Datei ist ein weit verbreitetes textbasiertes Dateiformat zum Speichern der Nukleotidsequenz für jedes Amplifikat und des entsprechenden Qualitätsfaktors. Die FASTQ-Dateien dienen als Eingabe für Sequenzausrichtungsalgorithmen. Ausgerichtete Lesevorgänge werden in Dateien im BAM-Format geschrieben, die anschließend in Lesezahlen und Ausdruckswerte konvertiert werden. Anschließend werden die Genexpressionsniveaus an den Algorithmus übermittelt, um Risikokategorien zu klassifizieren.

Die Software klassifiziert das Risiko basierend auf dem Expressionsmuster von Gengruppen innerhalb des 82 Gene umfassenden Thyroid GuidePx®-Panels. Basierend auf einer Studie mit 502 Patientenproben wurden drei molekulare Klassen definiert, die das Muster der Genexpression mit dem rezidivfreien Überleben nach 5 Jahren in Verbindung bringen. Eine Hochrisikogruppe, angereichert mit BRAFV600E-Mutationen; und zwei molekulare Untergruppen mit geringerem Risiko wurden identifiziert.

Klinischer Nutzen

Die genauere Prognose von Thyroid GuidePx® könnte sich auf die Behandlungsentscheidungen von Ärzten auswirken. Im Folgenden finden Sie Beispiele dafür, wie Ärzte die neuen Informationen aus Thyroid GuidePx® anwenden können:

1. PTC mit geringem Risiko könnte möglicherweise eher mit einer partiellen Thyreoidektomie (z. B. Lobektomie) oder sogar mit aktiver Überwachung als mit einer vollständigen Thyreoidektomie behandelt werden. Dies hat neben der Zeit- und Kostenersparnis zwei große Vorteile. Erstens verringert sich der potenzielle Bedarf an lebenslangem Schilddrüsenhormonersatz nach einer Lobektomie. Zweitens besteht praktisch kein Risiko für die potenziell verheerenden Komplikationen einer totalen Thyreoidektomie, wie etwa eine beidseitige Verletzung des Nervus recurrens oder ein dauerhafter Hypoparathyreoidismus.
2. Die genaue Identifizierung von PTC mit geringem Risiko würde auch die Eignung von adjuvantem radioaktivem Jod (RAI) erhöhen. Die RAI-Therapie kann sowohl zu vorübergehenden als auch zu langfristigen Nebenwirkungen wie Funktionsstörungen der Speicheldrüsen, Eierstöcken und Hoden sowie einer Knochenmarkssuppression führen. Bei der RAI-Therapie besteht theoretisch auch das Risiko einer sekundären Malignität: Eine Schätzung geht davon aus, dass 100 mCi 131I 56 Malignome pro 10.000 behandelten Patienten hervorruft (15). Auch die Beschränkung der RAI-Therapie auf diejenigen Patienten, die eine Verbesserung des Gesamtüberlebens oder des krankheitsfreien Überlebens erzielen würden, ist kosteneffektiv.
3. Die Überwachung von PTC kann aus zwei Gründen eine Belastung für Patienten und Gesundheitsorganisationen darstellen: PTC wird am häufigsten im mittleren Alter diagnostiziert und Patienten überleben oft noch lange Zeit nach ihrer Diagnose. Regelmäßige Untersuchungen und Untersuchungen zur Früherkennung eines Rezidivs können sich daher über viele Jahre hinziehen. Die Nachsorge umfasst in der Regel eine jährliche körperliche Untersuchung, eine Serummessung des Schilddrüsen-stimulierenden Hormons und des Thyreoglobulins sowie eine regelmäßige Ultraschalluntersuchung des Halses. Bei Patienten mit geringem Risiko kann es zu längeren Abständen zwischen Nachuntersuchungen und Untersuchungen kommen und sie könnten möglicherweise aus der Überwachung entlassen werden.
4. Wichtig ist auch die genaue Identifizierung von Patienten mit einem hohen Rezidivrisiko. Es ist bekannt, dass das ATA-Risikostratifizierungssystem bei der Vorhersage eines erneuten Auftretens ungenau ist. Bei Patienten, die nach dem ATA Risk Stratification System 2015 als „geringes Risiko“ eingestuft wurden, entwickeln 16 % der Patienten schließlich eine wiederkehrende Erkrankung (16). Aufgrund dieser Risikoeinstufung kann es sein, dass diese Patienten unterbehandelt werden. Bei Patienten, bei denen eine genauere Zuordnung des hohen Risikos verfügbar ist, können aggressivere Behandlungen (d. h. totale Thyreoidektomie und RAI) oder die Aufnahme in klinische Studien in Betracht gezogen werden.

Schilddrüsen-GuidePx® durch Feinnadelbiopsie Unsere Studien wurden bisher mit chirurgischen Proben durchgeführt und ein im Handel erhältlicher Test wurde in diesem Format erstellt. Eine aktuelle Studie des Institute of Health Economics hat jedoch ergeben, dass eine verbesserte Kosteneffizienz von Thyroid GuidePx® durch die Durchführung des Tests vor der Operation erreicht werden könnte. Die präoperative Durchführung eines Tests würde erfordern, dass der Test unter Verwendung von Proben aus einer Feinnadelbiopsie (FNB) gut funktioniert.

Schilddrüsen-FNBs werden routinemäßig bis zu 7 Tage lang in CytoLyt, einem gepufferten flüssigen Konservierungsmittel auf Methanolbasis, gelagert, bevor die Zellen zur zytologischen Auswertung auf einen ThinPrep übertragen werden. Wir und andere (17-21) haben zuvor festgestellt, dass hochwertige DNA und RNA aus Zellen in CytoLyt gewonnen werden können. Unsere aktuelle Machbarkeitsstudie mit 12 Patienten mit PTC hat gezeigt, dass die Durchführung des Thyroid GuidePx®-Tests an FNBs machbar ist. Bisher lag die technische Erfolgsquote bei 100 %, und die Übereinstimmung der Genniveaus mit chirurgischen Proben übersteigt 0,9. Wenn man sich jedoch bei der molekularen Krankheitscharakterisierung auf einen begrenzten FNB verlässt, bedeutet dies, dass die Probe für den gesamten Tumor repräsentativ ist. Genomische und transkriptomische Heterogenität wurde bei Primärtumoren und Metastasen beschrieben (23). Daher ist es wichtig, die Übereinstimmung zwischen den von der FNB entnommenen Proben und den chirurgischen Proben zu dokumentieren.

ZIELE UND ZWECK DES VERSUCHS Der allgemeine Zweck der Studie besteht darin, festzustellen, ob die begrenztere Probe aus einer Feinnadelbiopsie ausreichend repräsentativ für den größeren Tumor ist, um eine gültige molekulare Klassifizierung mithilfe des Thyroid GuidePx®-Tests zu bestimmen.

Hauptziel 1. Bestimmung der Übereinstimmung zwischen den von FNAs erfassten molekularen Klassifizierungen von Thyroid GuidePx® und passenden chirurgischen Proben.

Sekundäre Ziele

1. Vergleich der technischen Erfolgsrate bei der Erstellung eines gültigen Thyroid GuidePx® anhand von FNAs und chirurgischen Proben.
2. Vergleich der Rezidivergebnisse unter Verwendung des ATA-Risikostratifizierungssystems mit Patienten, die von Thyroid GuidePx® anhand chirurgischer Proben klassifiziert wurden.
3. Vergleich der Rezidivergebnisse mithilfe des ATA-Risikostratifizierungssystems mit Patienten, die von Thyroid GuidePx® anhand von FNA-Proben klassifiziert wurden.

VERSUCHSDESIGN Versuchsschema (siehe Protocol_Calgary_July 11, 2023.docx). beigefügt)

Patienten zur Probenentnahme und -analyse werden zur Teilnahme eingeladen, wenn bei ihnen eine präoperative Gewebediagnose von PTC (Bethesda VI) oder ein Verdacht auf PTC (Bethesda V) vorliegt und sie Anspruch auf eine teilweise oder vollständige Thyreoidektomie haben, wie in den Einschluss- und Ausschlusskriterien beschrieben . Nach der Einwilligung werden die Patienten wie von ihrem Chirurgen geplant operiert. Von allen Teilnehmern werden demografische, klinische und pathologische Daten erhoben.

Wenn während der Operation die Schilddrüse und der Tumor freigelegt werden, führt der Chirurg unter direkter Sicht eine FNB des dominanten Tumors (d. h. der präoperativ identifizierten Läsion) durch. Dies simuliert am ehesten die In-vivo-Bedingungen einer präoperativen FNB, begrenzt jedoch mögliche technische Nachteile einer perkutanen Biopsie (z. B. unzureichendes Targeting der Läsion). Das aus dem FNB gewonnene Zellmaterial wird sofort in das Transportmedium (CytoLyt) gegeben und dann gekühlt. Die Proben werden wöchentlich zur RNA-Isolierung und RNASeq an das Zentrallabor geschickt. Gleichzeitig werden FNB-Proben von einem ausgebildeten Zytopathologen auf das Vorhandensein von Tumorzellen untersucht.

Wenn mehr als ein Knoten vorhanden ist, wird der FNB-Knoten vom Chirurgen für den Pathologen markiert. Unter der Leitung eines kooperierenden Pathologen wird ein Stück des Tumors entfernt und eingefroren, und ein angrenzendes Stück wird zur Formalinfixierung und Paraffineinbettung (FFPE) entnommen. Ein H&E-Objektträger aus der FFPE-Probe wird auf H&E gefärbt, und 3–6 ungefärbte Schnitte werden vorbereitet und dann zur Mikrodissektion, RNA-Isolierung und RNASeq an das Zentrallabor geschickt. Dieser Prozess folgt routinemäßigen Probenverarbeitungsprotokollen und beeinträchtigt nicht die Standardmethoden der pathologischen Diagnose.

Wenn Patienten das optionale Einverständnisformular für das Biobanking unterzeichnet haben und noch genügend gefrorene Probe vorhanden ist, wird die Probe zum Zweck erneuter Tests (falls erforderlich) oder zur Unterstützung zusätzlicher Studien wie der Analyse des gesamten Transkriptoms und der Mutationsanalyse aufbewahrt. Die Verwendung dieser Proben für diese Zwecke würde zusätzliche ethische Genehmigungen erfordern.

Eine Machbarkeitsstudie mit 12 Patienten wurde bereits abgeschlossen. Die technische Erfolgsquote bei der Probenentnahme und der Durchführung des Tests betrug 100 %, die RNA-Quantität und -Qualität in FNBs war ausgezeichnet und es gab eine hervorragende Übereinstimmung der Genniveaus bei Tests, die an FNBs und chirurgischen Proben durchgeführt wurden.

RNASeq für Thyroid GuidePx® wird bei OncoHelix durchgeführt, einem klinischen Labor mit Fachkenntnissen in Präzisionsonkologie an der Cumming School of Medicine der University of Calgary. Wenn die Tests bei OncoHelix nicht rechtzeitig durchgeführt werden können, werden die Proben bei Protean BioDiagnostics getestet, einem CAP/CLIA-zertifizierten Labor in Orlando, FL, das den Test derzeit kommerziell durchführt. Risikoklassen werden durch eine von Qualisure Diagnostics entwickelte Software anhand der von RNASeq generierten Daten zugewiesen.

Endpunkte

Primärer Endpunkt:

1. Konkordanz, molekulare Risikoklassifizierung von FNBs bei papillärem Schilddrüsenkrebs und passenden gefrorenen chirurgischen Proben

Sekundäre Endpunkte:

1. Technische Erfolgsquote beim Ausfüllen eines gültigen Thyroid GuidePx® mit FNBs
2. Technische Erfolgsquote bei der Erstellung eines gültigen Schilddrüsen-GuidePx® in chirurgischen FFPE-Proben.
3. Biochemische Rezidivrate nach 5 Jahren (Thyreoglobulin ≥ 1 ng/ml, nur für Patienten, die eine vollständige Thyreoidektomie hatten)
4. Strukturelle Rezidivrate nach 5 Jahren

5. Testdurchführung als Prognosetest, Thyroid GuidePx®: FNB und chirurgische Proben

   1. Spezifität: der durch den Test vorhergesagte Anteil an Patienten ohne strukturelles Rezidiv
   2. Sensitivität: die Fähigkeit des Tests, Personen zu identifizieren, deren Krankheit innerhalb von 5 Jahren erneut auftritt (Prognoseanteil der strukturellen Rezidive)
   3. AUROC
   4. Positiv vorhergesagter Wert
   5. Negativer Vorhersagewert

6. Leistung, ATA-Risikostratifizierung

   1. Spezifität: der durch den Test vorhergesagte Anteil an Patienten ohne strukturelles Rezidiv
   2. Sensitivität: die Fähigkeit des Tests, Personen zu identifizieren, deren Krankheit innerhalb von 5 Jahren erneut auftritt (Prognoseanteil der strukturellen Rezidive)
   3. AUROC
   4. Positiv vorhergesagter Wert
   5. Negativer Vorhersagewert

Verblindung und Begrenzung der Verzerrung Nur Proben mit ausreichender RNA-Qualität (DV200>30) werden in die Analyse einbezogen. In die Konkordanzberechnung werden nur FNBs einbezogen, die Tumorzellen enthalten („zytologiepositiv“). RNASeq wird von einem Techniker durchgeführt, der keine Kenntnis von klinischen Details hat. Der Techniker wird insbesondere nicht in der Lage sein, übereinstimmende Proben aus chirurgischen Proben und FNBs zu identifizieren. Die molekulare Klassifizierung wird blind durchgeführt. Die Daten werden von einem unabhängigen Datenüberwachungsausschuss überwacht. Der Datenüberwachungsausschuss, der aus mindestens drei Personen, darunter einem Statistiker, besteht, überwacht die Datenanalyse.

Stoppregeln In unseren chirurgischen Proben wiesen Wiederholungen zwischen und innerhalb der Chargen durchweg eine Übereinstimmung der Genebenen von >0,9 auf. Die Übereinstimmung des Genniveaus zwischen zytologiepositivem FNB und gefrorenen chirurgischen Proben (der „Goldstandard“) wird für jede Gruppe von 24 Patienten überwacht. Wenn R<0,9, machen wir eine Pause, um den analytischen Arbeitsablauf und die Instrumentierung neu zu bewerten. Wenn die Konkordanz nach 72 Patienten dauerhaft unter 0,9 liegt, werden wir die Auswertung von FNBs einstellen, aber weiterhin chirurgische Proben testen. Da es sich hierbei nicht um eine Hochrisikostudie handelt, beabsichtigen wir nicht, die Studie vorzeitig abzubrechen. Auch wenn die Übereinstimmung zwischen FNB und chirurgischen Proben gering ist, sind die Daten aus der Untersuchung der Ergebnisse in Bezug auf die molekulare Klassifizierung (in chirurgischen Proben) nützlich.

Auswahl und Entnahme von Fächern, Einschlusskriterien

1. Alter ≥ 18 Jahre
2. Eine Diagnose von papillärem Schilddrüsenkrebs basierend auf einer Feinnadelbiopsie (FNB), interpretiert als Bethesda V- oder VI-Zytologie
3. Tumorgröße > 1 cm im maximalen Durchmesser
4. Der Patient ist ein operativer Kandidat
5. Der Patient hat sein Einverständnis gegeben

Ausschlusskriterien

1. Familiengeschichte von Schilddrüsenkrebs
2. Vorgeschichte einer Bestrahlung des Halses
3. Unfähig oder nicht willens, eine Feinnadelbiopsie durchführen zu lassen
4. Ich bin nicht bereit, mich einer Schilddrüsenentfernung zu unterziehen
5. Die endgültige Pathologie weist keinen papillären Schilddrüsenkrebs auf
6. Fälle, in denen kein klarer dominanter Knoten vorhanden ist
7. Fälle, in denen mehrere Knötchen vorhanden sind, die eine Probenahme eines definierten Knötchens ausschließen

Kriterien für den Austritt des Probanden: Probanden können die Teilnahme jederzeit abbrechen, indem sie einen der Prüfer oder das Forschungspersonal benachrichtigen. Die vor dem Widerruf erfassten Daten werden für die Analyse verwendet, nach dem Widerruf werden jedoch keine weiteren Daten erhoben. Auf Wunsch des Probanden können Proben vor der Untersuchung entnommen werden. Die Probanden werden ersetzt, wenn die Proben nicht mit RNASeq (Thyroid GuidePx®) getestet wurden.

BEHANDLUNG VON THEMEN Die molekulare Klassifizierung und das von Thyroid GuidePx® ermittelte Rezidivrisiko werden dem Arzt und dem Patienten mitgeteilt. Das Wiederholungsrisiko basiert auf kumulativen Validierungsdaten, einschließlich Fällen aus Alberta und Australien. Nur die Ergebnisse der gefrorenen chirurgischen Probe (der „Goldstandard“) werden offengelegt. Wie üblich werden Behandlungsentscheidungen vom Arzt in Zusammenarbeit mit dem Patienten auf der Grundlage einer Synthese aller verfügbaren klinischen Informationen getroffen. Diese klinische Studie definiert keinen Behandlungspfad. Häufigkeit und Dauer der Nachuntersuchungen werden nicht im Protokoll vorgeschrieben und vom behandelnden Arzt festgelegt. Da es sich um eine nicht-interventionelle Studie handelt, wird die Einhaltung nicht überwacht.

BEWERTUNG DER WIRKSAMKEIT Ein sekundäres Ergebnis ist die Testleistung zur Stratifizierung des Wiederholungsrisikos. Die Testleistung wird anhand von FNB-Proben und chirurgischen Proben verglichen und dann mit dem aktuellen Pflegestandard (dem ATA-Risikostratifizierungssystem) verglichen. Die Zeit bis zum Wiederauftreten wird ab dem Zeitpunkt der vollständigen Erstbehandlung gemessen. Bei Patienten mit mikroskopisch kleinen Erkrankungen, die nach der Operation verbleiben, wird die Zeit bis zum Wiederauftreten ab der Beendigung der therapeutischen Dosis von radioaktivem Jod gemessen. Wiederkehrende Ereignisse werden auf der Grundlage der Richtlinien der American Thyroid Association aus dem Jahr 2016 definiert.

Die folgenden Kriterien weisen nach der Therapie auf einen krankheitsfreien Status hin: (i) kein klinischer Hinweis auf einen Tumor; (ii) kein Hinweis auf einen Tumor in der Bildgebung mit radioaktivem Jod und/oder im Ultraschall des Gebärmutterhalses; (iii) bei posttotaler Thyreoidektomie: unstimuliertes Serum-Thyreoglobulin (Tg) <0,2 ng/ml; für Post-Lobektomie, unstimulierter Tg <30. Eine unbestimmte Reaktion auf die Therapie wird definiert als: (i) kein klinischer Hinweis auf einen Tumor; (ii) kein Hinweis auf einen Tumor in der Bildgebung mit radioaktivem Jod und/oder im Ultraschall des Gebärmutterhalses; (iii) für posttotale Thyreoidektomie, unstimulierter Tg 0,2–1; für Post-Lobektomie, Tg>30. Nach einer totalen Thyreoidektomie wird eine biochemische unvollständige Reaktion als Tg>1 ohne strukturelle Erkrankung definiert. Tg-Werte sind nur dann zuverlässig, wenn keine störenden Antikörper (TgAb) vorhanden sind (6).

Die Krankheit wird als echtes Rezidiv definiert, wenn ein Patient zuvor innerhalb eines Jahres nach der vorherigen Operation einen nicht nachweisbaren Tg-Wert ohne TgAb und eine negative Hals-Ultraschalluntersuchung hatte. Eine anhaltende Erkrankung wird als Tg über den oben genannten Schwellenwerten, ein abnormaler Halsultraschall, anhaltend erhöhte TgAb-Werte oder das Vorhandensein von Fernmetastasen definiert.

Patienten mit persistierender Erkrankung und/oder metastasierender Erkrankung (nicht kurative Resektion) werden nicht in die Berechnung des rezidivfreien Überlebens einbezogen.

BEWERTUNG DER SICHERHEIT Die einzige Abweichung von der klinischen Standardversorgung ist die intraoperative Probenentnahme durch FNB. Im Vergleich zum geplanten chirurgischen Eingriff ist dieses Risiko jedoch gering. Das Hauptrisiko besteht in einem geringen Risiko klinisch signifikanter Blutungen, das auf <1 % geschätzt wird. Da mit dieser Studie keine Intervention verbunden ist, gibt es keinen Plan zur Überwachung unerwünschter Ereignisse.

STATISTIK Optimierung der RNASeq-Bedingungen für Proben in CytoLyt RNA wird gemäß SOP aus FNBs in CytoLyt isoliert. Die RNA-Menge wird von NanoDrop bewertet und die Qualität wird von DV200 quantifiziert. RNASeq wird in CytoLyt-Proben und passenden gefrorenen Proben in unterschiedlichen Lesetiefen durchgeführt. In gepaarten CytoLyt- und FFPE-Geweben werden die Testmetriken als Funktion der Lagerungsmethode des Eingangsgewebes, der RNA-Qualität (DV200) und der Lagerungszeit ausgewertet. Die Genexpression wird in gepaarten CytoLyt- und gefrorenen Geweben verglichen und dann zwischen den Bedingungen korreliert. Das wichtigste Ergebnis, die molekulare Klassenzuordnung, wird in gepaarten Stichproben verglichen.

Die folgenden Leistungsmetriken werden für jedes Experiment bewertet, basierend auf der Checkliste des College of American Pathologists (CAP) mit spezifischen Anforderungen für die Sequenzierung der nächsten Generation:

Assay-Metriken

a) RNASeq-Metriken: (i) Lesezahlen (Gesamt-Lesevorgänge, eindeutige Lesevorgänge, doppelte Lesevorgänge, rRNA-Lesevorgänge, Strangspezifität); (ii) Abdeckung (Anzahl der Lesevorgänge, die eine bestimmte genomische Position abdecken): mittlere Abdeckung, mittlerer Variationskoeffizient, 5'/3'-Abdeckung, Lücken in der Abdeckung, GC-Bias (iii) Expressionskorrelation (gemessene Expressionsniveaus im Vergleich zu bekannten Niveaus). b) Einzelgennachweis: (i) Analytische Sensitivität: Bruchteil der Fälle, in denen jedes Gen im internen ERCC-Standard korrekt identifiziert wird.

(ii) Analytische Spezifität: Fähigkeit, das Fehlen der Gene festzustellen, die den internen Standard des ERCC bilden. (iii) Genauigkeit: Sensitivität + Spezifität

Vergleich der molekularen Risikostratifizierung (Thyroid GuidePx®), ermittelt in FNB-Proben und in chirurgischen Proben. Patienten mit einer endgültigen Pathologie, die keinen papillären Schilddrüsenkrebs aufweist, werden von der Konkordanzanalyse ausgeschlossen. Ebenso werden FNB-Proben, die zytologisch negativ sind, von der Konkordanzanalyse ausgeschlossen. Die molekulare Klassenzuordnung wird zwischen von FNB erhaltenen Proben und passenden gefrorenen chirurgischen Proben verglichen. Chirurgische Proben gelten als Goldstandard. Die Kappa-Statistik wird verwendet, um die Signifikanz der Konkordanz zwischen den beiden Probentypen zu bestimmen.

Risikoschichten werden blind mithilfe von Thyroid GuidePx® und dem ATA Risk Stratification System zugewiesen. Für jede Risikoklasse werden die strukturellen und biochemischen Rezidivraten nach 5 Jahren verglichen. Zur Beurteilung der Testgenauigkeit wird ein binäres Testergebnis herangezogen, das vom Krankheitsstatus (strukturelles Rezidiv) abhängig ist. Strukturelle Wiederholungen stellen den Goldstandard dar. Ein zweiseitiger McNemar-Test für zwei abhängige Anteile wird verwendet, um die Sensitivität und Spezifität jeder Methode der Risikostratifizierung zu bewerten, wobei Holms Multiplizitätsanpassung zur separaten Bewertung jedes Genauigkeitsmaßes verwendet wird.

Leistung von Thyroid GuidePx®

Anhand der oben beschriebenen Studien wird die Leistung von Thyroid GuidePx® separat anhand von FNB-Proben und chirurgischen Proben bewertet. Die Leistungsmerkmale werden wie folgt bewertet:

1. Zeitabhängige AUROC (Fläche unter der Receiver-Operator-Kurve) (24). Für die Zwecke der Berechnungen ist der Schwellenwert für einen positiven Test eine Bezeichnung für ein mittleres oder hohes Risiko (da davon ausgegangen wird, dass eine Zuordnung eines mittleren Risikos zu deutlich anderen klinischen Entscheidungen führen würde).
2. Sensitivität: berechnet als kumulative Sensitivität nach 5 Jahren, wie von Kamarudin und Kolamunnage-Dona beschrieben (24)
3. Spezifität: berechnet als dynamische Spezifität, wie von Kamarudin und Kolamunnage-Dona (24) beschrieben

Berechnung der Probengröße Wir vergleichen die molekulare Risikozuordnung von chirurgischen Proben und passenden FNBs von 109 Patienten. Ein klinisch akzeptabler Mindestkonkordanzgrad liegt bei 80 %. Die Berechnungen der Stichprobengröße basierten auf der Kappa-Statistik von Lin, um die Übereinstimmung zwischen den beiden Maßen für drei molekulare Untergruppen zu ermitteln (25). Es wurde eine zweiseitige Hypothese mit einem Signifikanzniveau von 0,05 angewendet und die Trennschärfe auf 90 % festgelegt. Die Größe der molekularen Untergruppen wurde auf 23 % (Typ 1), 49 % (Typ 2) und 28 % (Typ 3) festgelegt. Wenn die Nullhypothese lautet, dass der Grad der Übereinstimmung zwischen FNB und chirurgischen Proben 0,6 beträgt, dann könnten wir bei 109 Patienten einen Grad der Übereinstimmung von 0,8 oder höher feststellen. Eine Konkordanz von 0,90 wäre nachweisbar, wenn 40 Patienten das gleiche Nullniveau der Übereinstimmung annehmen würden.

Etwa 25 % der Patienten mit Bethesda-V-Zytologie und etwa 5 % der Patienten mit Bethesda-VI-Zytologie haben eine gutartige Erkrankung. Darüber hinaus ist in etwa 5 % der Fälle die RNASeq-Qualität in FFPE-Proben unzureichend. Auf dieser Grundlage planen wir eine Abbrecherquote von 20 %. Daher ist die Studie auf 130 Patienten ausgelegt.

DIREKTER ZUGRIFF AUF QUELLENDATEN/DOKUMENTE Der Standort für klinische Studien ermöglicht studienbezogene Überwachung, Audits, REB-Überprüfungen und behördliche Inspektion(en) und bietet direkten Zugriff auf Quelldaten/Dokumente.

Audits klinischer Studien werden durchgeführt, um sicherzustellen, dass die Rechte, die Sicherheit und das Wohlergehen der Patienten angemessen geschützt sind, um die Einhaltung des Protokolls, der Prozesse und Vereinbarungen, der ICH Good Clinical Practice-Standards und der geltenden gesetzlichen Anforderungen zu bewerten und um die Qualität der Daten zu bewerten.

Jede inländische Aufsichtsbehörde kann jederzeit zur Prüfung oder Inspektion des Studienstandorts kommen. Dieses Audit besteht aus Interviews mit dem Hauptforscher und dem Studienteam, der Überprüfung der Dokumentation und Praktiken, der Überprüfung der Einrichtungen, der Ausrüstung und der Überprüfung der Quelldaten.

Der Prüfer gewährt jeder inländischen Aufsichtsbehörde direkten Zugriff auf die Papier- und/oder elektronische Dokumentation der klinischen Studie (z. B. CRFs, Quelldokumente wie Krankenhauspatientenakten und Studiendateien von Prüfärzten). Alle Standorteinrichtungen, die mit der Studiendurchführung in Zusammenhang stehen, könnten während eines Audits besichtigt werden (z. B. Labor, Ambulanz). Der Prüfer verpflichtet sich, zu angemessenen Zeiten und an angemessenen Orten mitzuarbeiten und Unterstützung im Hinblick auf jegliche Prüfungstätigkeit zu leisten.

QUALITÄTSKONTROLLE UND QUALITÄTSSICHERUNG Der Hauptprüfer stellt sicher, dass alle Studienteilnehmer das Protokoll befolgen und die behördlichen und guten klinischen Praxisstandards einhalten. Alle Standorte für klinische Studien ermöglichen studienbezogene Überwachung, Audits, REB-Überprüfungen und behördliche Inspektionen und bieten direkten Zugriff auf Quelldaten/-dokumente.

Das Data Monitoring Committee (DMC) wird während der Durchführung des Prozesses wie folgt zusammentreten: 1. Bei Beginn des Prozesses, um die DMC-Charta fertigzustellen; 2. Nachdem 24 Teilnehmer eingeschrieben sind; 3. Nachdem 72 Teilnehmer eingeschrieben sind; und 4. nach Abschluss der Immatrikulation.

ETHIK Der verantwortliche Prüfer wird sicherstellen, dass diese Studie im Einklang mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt wird. Diese Studie wird gemäß den kanadischen und internationalen Standards der guten klinischen Praxis für alle Studien durchgeführt, einschließlich der ICH Harmonized Tripartite Guideline on Good Clinical Practice. Geltende staatliche Vorschriften, Richtlinien für klinische Studien des NNHPD sowie Forschungsrichtlinien und -verfahren des Alberta Health Services werden ebenfalls befolgt.

Dieses Protokoll und alle Änderungen werden dem HREBA-CC zur formellen Genehmigung zur Durchführung der Studie vorgelegt. Die Entscheidung des HREBA-CC über die Durchführung der Studie wird dem Prüfer schriftlich mitgeteilt.

Die Offenlegung der molekularen Risikoklassifizierung aus chirurgischen Proben (der „Goldstandard“) ist gerechtfertigt, da umfangreiche Ergebnisdaten aus chirurgischen Proben vorliegen. Darüber hinaus wird der Test mit Beginn dieser Studie als im Labor entwickelter Test (Laboratory Developed Test, LDT) kommerziell erhältlich sein.

DATENVERARBEITUNG UND AUFZEICHNUNGSAUFBEWAHRUNG Nach Abschluss der Studie werden alle Daten für diese Studie 15 Jahre lang gemäß dem Protokoll im Calgary Center for Clinical Research aufbewahrt.

FINANZIERUNG UND VERSICHERUNG Die Studie wird von Qualisure Diagnostics, Inc. finanziert und durch von Experten begutachtete Zuschüsse ergänzt. Die Versicherung wird von den Gesundheitsdiensten der University of Calgary und Alberta sowie von Qualisure Diagnostics übernommen.

VERÖFFENTLICHUNGSRICHTLINIEN Die Ergebnisse dieser klinischen Studie werden in einer von Experten begutachteten Fachzeitschrift veröffentlicht, in der alle genannten Forscher als Co-Autoren fungieren. Alle Finanzierungsquellen werden anerkannt.

6.0 Beschreiben Sie Verfahren, Behandlungen oder Aktivitäten, die über die Standardpraktiken hinausgehen oder diese ergänzen: .

Die einzige Abweichung von der klinischen Standardversorgung ist die intraoperative Probenentnahme durch FNB. Im Vergleich zum geplanten chirurgischen Eingriff ist dieses Risiko jedoch gering. Das Hauptrisiko besteht in einem geringen Risiko klinisch signifikanter Blutungen, das auf <1 % geschätzt wird. Da mit dieser Studie keine Intervention verbunden ist, gibt es keinen Plan zur Überwachung unerwünschter Ereignisse.

Wenn während der Operation die Schilddrüse und der Tumor freigelegt werden, führt der Chirurg unter direkter Sicht eine FNB des dominanten Tumors (d. h. der präoperativ identifizierten Läsion) durch. Dies simuliert am ehesten die In-vivo-Bedingungen einer präoperativen FNB, begrenzt jedoch mögliche technische Nachteile einer perkutanen Biopsie (z. B. unzureichendes Targeting der Läsion).

Unter der Leitung eines kooperierenden Pathologen wird ein Stück des Tumors entfernt und eingefroren, und ein angrenzendes Stück wird zur Formalinfixierung und Paraffineinbettung entnommen. Gewebe wird nur dann für Forschungszwecke freigegeben, wenn ausreichend Gewebe für die diagnostische und klinische Verwendung entnommen wurde.