Shoda molekulární klasifikace na základě biopsie tenkou jehlou (FNB) a chirurgických vzorků

ZÁKLADNÍ INFORMACE Rakovina štítné žlázy je 8. nejčastější rakovinou podle prevalence a její incidence se od roku 1992 zvyšuje o >6 % ročně. Papilární karcinom štítné žlázy (PTC) odpovídá za většinu karcinomů štítné žlázy a rostoucí výskyt karcinomu štítné žlázy lze téměř zcela připsat zvýšené detekci malých PTC (1). PTC má obvykle příznivou prognózu s vysokou mírou vyléčení. Přibližně 10–15 % PTC však vykazuje agresivnější chování a jsou často rezistentní vůči konvenčním adjuvantním terapiím, jako je radioaktivní jód (2,3). Vzhledem k rostoucímu počtu případů PTC (a potenciální zátěži nákladů na zdravotní péči) je stále důležitější přesná prognóza. Přesné odhady prognózy a rizika recidivy zabrání zbytečně rozsáhlým operacím, vyšetřováním a sledováním u jedinců s dobrou prognózou a nasměrují rozsáhlejší operace, adjuvantní terapie a delší sledování k těm, kteří to potřebují.

Rozhodnutí o léčbě systémem stratifikace rizik Americké tyreoidální asociace (ATA) jsou informována systémem rizikové stratifikace Americké tyreoidální asociace (ATA), který odhaduje riziko recidivy onemocnění na základě klinických a patologických faktorů. Přestože byl tento systém retrospektivně ověřen řadou studií, podíl vysvětlených rozptylů není optimální a pohybuje se v rozmezí 19–34 % (4, 5). Neschopnost systému ATA plně predikovat recidivu může souviset se selháním tohoto systému adekvátně integrovat riziko spojené s molekulárním profilem nádoru. V systému ATA Risk Stratification System je v současnosti začleněn pouze jeden molekulární marker, BRAFV600E. Dalším omezením ATA Risk Stratification System je, že může být plně implementován pouze po operaci, kdy jsou k dispozici všechna klinická a patologická data potřebná k odhadu rizika. V té době již byla učiněna významná rozhodnutí o léčbě a dopad operace si již pacient uvědomil.

Odhad rizika před léčbou: Současný standard péče V roce 2015 ATA informovala o kritériích, která by mohla být použita k výběru pacientů pro konzervativnější operace, jako je lobektomie štítné žlázy. Podle směrnic ATA z roku 2015 jsou za nízké riziko považováni pacienti s následujícími předoperačními kritérii: velikost nádoru 1–4 cm, klinicky negativní uzlina, žádné extratyreoidální rozšíření, žádná rodinná anamnéza rakoviny štítné žlázy a žádná anamnéza radiační terapie krku ( 6). Tito pacienti by mohli být zpočátku léčeni lobektomií štítné žlázy (na rozdíl od totální tyreoidektomie). 40–60 % však bude vyžadovat kompletní tyreoidektomii, protože stratifikace pooperačního rizika (s využitím všech klinických a patologických informací dostupných po operaci) je klasifikovala jako riziko s vyšším rizikem, než se původně odhadovalo [7–11]. V nedávné studii vyžadovalo 51 % pacientů konverzi na kompletní tyreoidektomii, protože během operace nebo poté, co byla k dispozici konečná patologie, byly rozpoznány další rizikové faktory [12]. To ukazuje omezení klinických předoperačních odhadů rizika a potřebu vylepšené metody předoperačního odhadu rizika. Chirurgové a pacienti s karcinomem štítné žlázy by proto měli užitek z dalších informací, které by upřesnily rozhodnutí provést lobektomii u vhodných pacientů a zároveň minimalizovaly nutnost kompletní tyreoidektomie.

Thyroid GuidePx®: Nový systém stratifikace molekulárního rizika Nedostatky systému ATA stratifikace rizika pro spolehlivé stanovení prognózy byly vyřešeny pomocí nového systému stratifikace molekulárního rizika, který obsahuje podpis genu Thyroid GuidePx®. Pomocí algoritmu počítačového softwaru byly v tréninkové sadě 335 pacientů s PTC identifikovány transkripty (mRNA) spojené s recidivou a transkripty spojené s absencí recidivy, poté validovány ve validačním souboru 167 pacientů. Nádory zahrnuté v souboru dat byly čerstvě zmrazené.

Na základě vzoru exprese prognostických genů byly identifikovány tři molekulární podtypy. Ty se nazývaly typ 1, typ 2 a typ 3. PTC typu 3 měly nejagresivnější biologii a nejvyšší míru recidivy. Následně byl validován u 124 pacientů s PTC z Koreje a také u 167 pacientů z Edmontonu.

Molekulární podtypy byly zvažovány v kontextu stadia nádoru. Konkrétně nádory o velikosti 1 - 4 cm bez onemocnění lymfatických uzlin (které zahrnují pacienty, kteří by byli potenciálními kandidáty na lobektomii štítné žlázy) byly analyzovány odděleně od pacientů s pokročilejším onemocněním. Je zajímavé, že PTC typu 3 měly vysokou míru recidivy bez ohledu na stadium nádoru. Kandidáti na lobektomii s PTC typu 1 a typu 2 měli míru recidivy < 3 % (obrázek 1A, B, viz Protocol_Calgary_July 11, 2023.docx připojený).

Výkon testu Test založený na NGS, který identifikoval molekulární podtyp PTC, se nazýval Thyroid GuidePx®. Kombinovaná molekulární a klinická subklasifikace PTC pomocí Thyroid GuidePx® byla porovnána se systémem ATA Risk Stratification System. Skupiny rizikové stratifikace ATA byly stanoveny dvěma praktickými lékaři pro každý případ. Pro výpočet časově závislé oblasti pod křivkou provozní charakteristiky přijímače (AUROC) byla použita binární klasifikace: nízké riziko versus střední/vysoké riziko. AUROC byl vypočítán na základě výsledků recidivy z kohorty objevů TCGA a kohorty z Edmontonu. Nejlepšího výkonu stratifikace rizika bylo dosaženo testem Thyroid GuidePx® ve spojení s klinickými rysy (tj. velikost nádoru a postižení lymfatických uzlin). Při použití balíčku smoothROCtime byl 5letý AUROC 0,80 pro Thyroid GuidePx® při zvážení velikosti nádoru a stavu lymfatických uzlin a 0,51 pro systém stratifikace rizika ATA (obrázek 2, viz Protocol_Calgary_July 11, 2023.docx připojený).

Thyroid GuidePx®: Popis testu Test Thyroid GuidePx® je test založený na cíleném sekvenování RNA s obohaceným hybridním zachycením (RNA-Seq). Vstupem testu je RNA izolovaná ze vzorků tkáně papilárního karcinomu štítné žlázy fixované v parafínu (FFPE) nebo tenkou jehlovou biopsií (FNB). Příprava knihovny zahrnuje specifickou amplifikaci cílových oblastí každého z genů v panelu Thyroid GuidePx®. Panel se skládá z 82 genů. Výsledné knihovny vzorků se přenesou do kazety s reagenciemi MiSeq/MiSeqDx, která obsahuje všechna činidla pro sekvenování. Software analýzy v reálném čase (RTA), který je součástí sekvenceru MiSeq/MiSeqDx, poskytuje základní volání a související skóre kvality během běhu sekvenování. Jsou generovány soubory FASTQ, které obsahují informace o pořadí a kvalitě. Soubor FASTQ je široce používaný textový formát souboru pro ukládání nukleotidové sekvence pro každý amplikon a jeho odpovídající skóre kvality. Soubory FASTQ slouží jako vstup pro algoritmy sekvenčního zarovnání. Zarovnaná čtení se zapisují do souborů ve formátu BAM, které jsou následně převedeny na počty přečtení a hodnoty výrazů. Úrovně genové exprese jsou pak předloženy algoritmu pro klasifikaci rizikových kategorií.

Software klasifikuje riziko na základě vzoru exprese skupin genů v rámci panelu 82 genů Thyroid GuidePx®. Na základě studie s 502 vzorky pacientů byly definovány tři molekulární třídy, které spojovaly vzor genové exprese s přežitím bez recidivy po 5 letech. Vysoce riziková skupina obohacená o mutace BRAFV600E; a byly identifikovány dvě molekulární podskupiny s nižším rizikem.

Klinická užitečnost

Přesnější prognóza poskytovaná Thyroid GuidePx® by mohla ovlivnit rozhodnutí lékařů o léčbě. Níže jsou uvedeny příklady toho, jak mohou lékaři použít nové informace odvozené z Thyroid GuidePx®:

1. Nízkorizikové PTC by mohly být potenciálně léčeny částečnou tyreoidektomií (např. lobektomií) nebo dokonce aktivním sledováním spíše než totální tyreoidektomií. To má kromě úspory času a nákladů dvě hlavní výhody. Za prvé, dochází ke snížení potenciální potřeby celoživotní náhrady hormonu štítné žlázy po lobektomii. Za druhé, neexistuje prakticky žádné riziko potenciálně devastujících komplikací totální tyreoidektomie, jako je bilaterální poranění recidivujícího laryngeálního nervu nebo trvalá hypoparatyreóza.
2. Přesná identifikace PTC s nízkým rizikem by také zvýšila vhodnost adjuvantního radioaktivního jódu (RAI). Léčba RAI může mít za následek přechodné i dlouhodobé vedlejší účinky, jako je dysfunkce slinných žláz, dysfunkce vaječníků a varlat a suprese kostní dřeně. Léčba RAI má také teoretické riziko sekundární malignity: jeden odhad je, že 100 mCi 131I indukuje 56 malignit na 10 000 léčených pacientů (15). Omezení terapie RAI na ty pacienty, u kterých by došlo ke zlepšení celkového přežití nebo přežití bez onemocnění, je také nákladově efektivní.
3. Sledování PTC může představovat zátěž pro pacienty a zdravotnické organizace ze dvou důvodů: PTC je nejčastěji diagnostikována ve středním věku a pacienti často přežívají dlouhou dobu po stanovení diagnózy. To znamená, že pravidelná vyšetření a vyšetřování pro včasné odhalení recidivy mohou trvat mnoho let. Sledování obvykle zahrnuje každoroční fyzikální vyšetření, měření hormonu stimulujícího štítnou žlázu a tyreoglobulinu v séru a pravidelné ultrazvukové vyšetření krku. U pacientů s nízkým rizikem se mohou prodloužit intervaly mezi následnými vyšetřeními a vyšetřeními a mohou být potenciálně propuštěni z dohledu.
4. Důležitá je také přesná identifikace pacientů s vysokým rizikem recidivy. Je známo, že ATA Risk Stratification System je nepřesný při předpovídání opakování. U pacientů klasifikovaných jako „nízkorizikové“ pomocí ATA Risk Stratification System 2015 se u 16 % pacientů nakonec rozvine recidivující onemocnění (16). Tito pacienti mohou být v důsledku této klasifikace rizika nedostatečně léčeni. U pacientů, kde je k dispozici přesnější přiřazení vysokého rizika, lze zvážit agresivnější léčbu (tj. totální tyreoidektomii a RAI) nebo zařazení do klinických studií.

Thyroid GuidePx® pomocí jemné jehlové biopsie Naše studie byly dosud prováděny s použitím chirurgických vzorků a v tomto formátu byl vytvořen komerčně dostupný test. Nedávná studie Institute of Health Economics však zjistila, že zvýšené nákladové efektivity Thyroid GuidePx® by bylo dosaženo provedením testu před operací. Provedení testu před operací by vyžadovalo, aby test probíhal dobře pomocí vzorků získaných z biopsie tenkou jehlou (FNB).

FNB štítné žlázy jsou rutinně skladovány v CytoLyt, methanolovém pufrovaném kapalném konzervačním prostředku, po dobu až 7 dnů před přenosem buněk do ThinPrep pro cytologické hodnocení. My a další (17-21) jsme již dříve zjistili, že kvalitní DNA a RNA lze získat z buněk v CytoLytu. Naše nedávná studie proveditelnosti sestávající z 12 pacientů s PTC ukázala, že provedení testu Thyroid GuidePx® na FNB je proveditelné. Dosud byla technická úspěšnost 100% a shoda genové úrovně s chirurgickými vzorky přesahuje 0,9. Avšak spoléhání se na omezenou FNB pro charakterizaci molekulárního onemocnění znamená, že vzorek je reprezentativní pro celý nádor. Genomická a transkriptomická heterogenita byla popsána u primárních nádorů a metastáz (23). Proto bude důležité zdokumentovat shodu mezi vzorky získanými FNB a chirurgickými vzorky.

CÍLE A ÚČEL ZKOUŠKY Obecným účelem studie je určit, zda omezenější vzorek z biopsie tenkou jehlou dostatečně reprezentuje větší nádor pro stanovení platné molekulární klasifikace pomocí testu Thyroid GuidePx®.

Primární cíl 1. Stanovit shodu mezi molekulárními klasifikacemi Thyroid GuidePx® získanými z FNA a odpovídajícími chirurgickými vzorky.

Sekundární cíle

1. Porovnat míru technické úspěšnosti při vyplňování platného průvodce štítnou žlázou s použitím FNA a chirurgických vzorků.
2. Porovnat výsledky recidivy pomocí systému stratifikace rizika ATA s pacienty klasifikovanými Thyroid GuidePx® pomocí chirurgických vzorků.
3. Porovnat výsledky recidivy pomocí systému stratifikace rizika ATA s pacienty klasifikovanými Thyroid GuidePx® pomocí vzorků FNA.

ZKUŠEBNÍ NÁVRH Schéma zkušební verze (viz Protocol_Calgary_July 11, 2023.docx připojený)

Získávání a analýza vzorků Pacienti budou pozváni k účasti, pokud mají předoperační tkáňovou diagnózu PTC (Bethesda VI) nebo mají podezření na PTC (Bethesda V) a jsou způsobilí pro částečnou nebo úplnou tyreoidektomii, jak je popsáno v kritériích pro zařazení a vyloučení . Po souhlasu podstoupí pacienti operaci podle plánu jejich chirurga. Demografické, klinické a patologické údaje budou získány od všech účastníků.

Během operace, kdy jsou štítná žláza a nádor obnaženy, chirurg provede FNB dominantního nádoru (tj. léze identifikované před operací) pod přímým viděním. To nejpřesněji simuluje in vivo podmínky předoperační FNB, ale zároveň omezuje potenciální technické pády perkutánní biopsie (např.: nedostatečné zacílení léze). Buněčný materiál získaný z FNB bude okamžitě vložen do transportního média (CytoLyt) a poté zmražen. Vzorky budou zasílány týdně do centrální laboratoře pro izolaci RNA a RNASeq. Zároveň budou vzorky FNB vyšetřeny na přítomnost nádorových buněk vyškoleným cytopatologem.

Pokud je přítomen více než jeden uzlík, označí uzel FNB chirurg pro patologa. Pod vedením spolupracujícího patologa bude část nádoru odstraněna a rychle zmražena a sousední část bude odebrána pro fixaci formalínu a zalití do parafínu (FFPE). Připraví se jedno H&E sklíčko ze vzorku FFPE s barvením na H&E a 3 - 6 nebarvených řezů, které se poté pošlou do centrální laboratoře na mikrodisekci, izolaci RNA a RNASeq. Tento proces se bude řídit rutinními protokoly zpracování vzorků a nebude interferovat se standardními metodami patologické diagnostiky.

Pokud pacienti podepsali volitelný formulář informovaného souhlasu s biobankovnictvím, pokud je dostatek zbývajícího zmrazeného vzorku, vzorek bude uchován pro účely opětovného testování (v případě potřeby) nebo pro podporu dalších studií, jako je analýza celého transkriptomu a mutační analýza. Použití těchto vzorků pro tyto účely by vyžadovalo další etické schválení.

Studie proveditelnosti sestávající z 12 pacientů již byla dokončena. Technická úspěšnost při získávání vzorků a provádění testu byla 100 %, kvantita a kvalita RNA byla u FNB vynikající a v testech prováděných na FNB a chirurgických vzorcích byla vynikající shoda genové úrovně.

RNASeq for Thyroid GuidePx® bude prováděna v OncoHelix, klinické laboratoři s odbornými znalostmi v oblasti přesné onkologie na Cumming School of Medicine, University of Calgary. Pokud není možné včas provést testování v OncoHelix, vzorky budou testovány v Protean BioDiagnostics, laboratoři s certifikací CAP/CLIA v Orlandu na Floridě, která v současnosti test provádí komerčně. Třídy rizika budou přiřazeny softwarem navrženým společností Qualisure Diagnostics pomocí dat generovaných RNASeq.

Koncové body

Primární koncový bod:

1. Shoda, klasifikace molekulárního rizika FNB papilárního karcinomu štítné žlázy a odpovídající zmrazené chirurgické vzorky

Sekundární koncové body:

1. Technická úspěšnost při vyplňování platného Thyroid GuidePx® pomocí FNB
2. Technická úspěšnost při vyplňování platného Thyroid GuidePx® v chirurgických vzorcích FFPE.
3. Míra biochemické recidivy po 5 letech (tyreoglobulin ≥ 1 ng/ml, pouze u pacientů, kteří podstoupili totální tyreoidektomii)
4. Míra strukturální recidivy po 5 letech

5. Test výkonnosti jako prognostický test, Thyroid GuidePx®: FNB a chirurgické vzorky

   1. Specifičnost: podíl pacientů bez strukturální recidivy predikovaný testem
   2. Senzitivita: schopnost testu identifikovat jedince, u nichž se onemocnění vrátí do 5 let (předpovězený podíl strukturálních recidiv)
   3. AUROC
   4. Pozitivní prediktivní hodnota
   5. Negativní prediktivní hodnota

6. Výkon, stratifikace rizika ATA

   1. Specifičnost: podíl pacientů bez strukturální recidivy predikovaný testem
   2. Senzitivita: schopnost testu identifikovat jedince, u nichž se onemocnění vrátí do 5 let (předpovězený podíl strukturálních recidiv)
   3. AUROC
   4. Pozitivní prediktivní hodnota
   5. Negativní prediktivní hodnota

Zaslepení a omezení zkreslení Do analýzy budou zahrnuty pouze vzorky s dostatečnou kvalitou RNA (DV200>30). Do výpočtu konkordance budou zahrnuty pouze FNB obsahující nádorové buňky („cytologicky pozitivní“). RNASeq provede technik, který je zaslepený vůči jakýmkoli klinickým detailům. Technik konkrétně nebude schopen identifikovat odpovídající vzorky z chirurgických vzorků a FNB. Molekulární klasifikace bude provedena zaslepeným způsobem. Data budou monitorována nezávislým výborem pro monitorování dat. Analýza dat bude monitorovat Výbor pro monitorování dat, který se skládá nejméně ze tří osob včetně statistika.

Pravidla zastavení V našich chirurgických vzorcích měly opakování mezi vsádkou a v rámci vsádky konzistentně shodu genové hladiny >0,9. U každé šarže 24 pacientů bude sledována shoda genové hladiny mezi cytologicky pozitivními FNB a zmrazenými chirurgickými vzorky ("zlatý standard"). Je-li R<0,9, pozastavíme se, abychom znovu vyhodnotili analytický pracovní postup a vybavení. Pokud bude konkordance po 72 pacientech trvale pod 0,9, přestaneme vyhodnocovat FNB, ale budeme pokračovat v testování chirurgických vzorků. Vzhledem k tomu, že se nejedná o vysoce rizikovou studii, nehodláme studii předčasně ukončit. I když existuje nízká konkordance mezi FNB a chirurgickými vzorky, budou užitečná data odvozená z výsledků studia ve vztahu k molekulární klasifikaci (v chirurgických vzorcích).

VÝBĚR A ODSTRANĚNÍ PŘEDMĚTŮ Kritéria zařazení

1. Věk ≥ 18 let
2. Diagnóza papilárního karcinomu štítné žlázy založená na biopsii tenkou jehlou (FNB) interpretovaná jako Bethesda V nebo VI cytologie
3. Velikost nádoru > 1 cm v maximálním průměru
4. Pacient je kandidátem na operaci
5. Pacient poskytl souhlas

Kritéria vyloučení

1. Rodinná anamnéza rakoviny štítné žlázy
2. Historie záření do krku
3. Neschopnost nebo ochotu podstoupit biopsii jemnou jehlou
4. Neochotný podstoupit tyreoidektomii
5. Konečná patologie neprokazuje papilární rakovinu štítné žlázy
6. Případy, kdy není jasný dominantní uzel
7. Případy, kdy je více uzlů, které znemožňují odběr vzorků z definovaného uzlu

Kritéria odstoupení subjektu Subjekty mohou kdykoli ukončit účast tím, že to oznámí jednomu z vyšetřovatelů nebo výzkumnému personálu. Data získaná před stažením budou použita pro analýzu, ale po stažení nebudou shromažďována žádná další data. Na žádost subjektu mohou být vzorky před testováním odebrány. Subjekty budou nahrazeny, pokud vzorky nebyly testovány pomocí RNASeq (Thyroid GuidePx®).

LÉČBA SUBJEKTů Molekulární klasifikace a riziko recidivy stanovené pomocí Thyroid GuidePx® bude sděleno lékaři a pacientovi. Riziko recidivy je založeno na kumulativních validačních datech včetně případů z Alberty a Austrálie. Budou zveřejněny pouze výsledky zmrazeného chirurgického vzorku („zlatý standard“). Jak je obvyklým standardem, rozhodnutí o léčbě bude činit lékař ve spolupráci s pacientem na základě syntézy všech dostupných klinických informací. Tato klinická studie nedefinuje cestu léčby. Frekvence a doba sledování nebudou předepsány protokolem a určí je ošetřující lékař. Toto je neintervenční studie, a proto nebude dodržování kontrolováno.

POSOUZENÍ ÚČINNOSTI Sekundárním výsledkem je provedení testu pro stratifikaci rizika recidivy. Výkon testu bude porovnán ve vzorcích získaných FNB a chirurgických vzorcích a následně porovnán se současným standardem péče (systém stratifikace rizika ATA). Doba do recidivy se bude měřit od doby úplné počáteční léčby. U pacientů s mikroskopickým onemocněním zbývajícím po operaci bude doba do recidivy měřena od dokončení terapeutické dávky radioaktivního jódu. Recidivující události budou definovány na základě pokynů American Thyroid Association z roku 2016.

Následující kritéria budou znamenat stav bez onemocnění po terapii: (i) žádný klinický důkaz nádoru; (ii) žádný důkaz nádoru při zobrazování radioaktivním jódem a/nebo ultrazvuku děložního čípku; (iii) pro posttotální tyreoidektomii nestimulovaný sérový tyreoglobulin (Tg) <0,2 ng/ml; po lobektomii, nestimulovaný Tg<30. Neurčitá odpověď na terapii bude definována jako: (i) žádný klinický důkaz nádoru; (ii) žádný důkaz nádoru při zobrazování radioaktivním jódem a/nebo ultrazvuku děložního čípku; (iii) pro posttotální tyreoidektomii, nestimulovaný Tg 0,2 - 1; po lobektomii, Tg>30. Po totální tyreoidektomii je biochemická neúplná odpověď definována jako Tg>1 v nepřítomnosti strukturálního onemocnění. Hodnoty Tg jsou spolehlivé pouze v nepřítomnosti interferujících protilátek (TgAb) (6).

Onemocnění bude definováno jako opravdová recidiva, pokud měl pacient dříve nedetekovatelné Tg při absenci TgAb a negativní ultrazvukové vyšetření krku do 1 roku po předchozí operaci. Přetrvávající onemocnění bude definováno jako Tg vyšší než výše uvedené prahové hodnoty, abnormální ultrazvuk krku, trvale zvýšené hladiny TgAb nebo přítomnost vzdálených metastáz.

Pacienti s perzistujícím onemocněním a/nebo metastatickým onemocněním (nekurativní resekce) nebudou zahrnuti do výpočtu přežití bez recidivy.

POSOUZENÍ BEZPEČNOSTI Jedinou odchylkou od standardní klinické péče je intraoperační odběr vzorku FNB. Ve srovnání s plánovaným chirurgickým výkonem je však toto riziko malé. Hlavním rizikem je malé riziko klinicky významného krvácení, odhadované na < 1 %. Vzhledem k tomu, že s touto studií nebude spojena žádná intervence, neexistuje žádný plán pro sledování nežádoucích účinků.

STATISTIKA Optimalizace podmínek RNASeq pro vzorky v CytoLyt RNA bude izolována z FNB v CytoLyt podle SOP. Množství RNA bude hodnoceno pomocí NanoDrop a kvalita bude kvantifikována pomocí DV200. RNASeq bude proveden ve vzorcích CytoLyt a spárovaných zmrazených vzorcích v různých hloubkách čtení. Ve spárovaných tkáních CytoLyt a FFPE budou metriky testu hodnoceny jako funkce způsobu skladování vstupní tkáně, kvality RNA (DV200) a doby skladování. Genová exprese bude porovnána v párových CytoLyt a zmrazených tkáních, poté bude korelována mezi podmínkami. Nejdůležitější výsledek, přiřazení molekulárních tříd, bude porovnán v párových vzorcích.

Následující výkonnostní metriky budou vyhodnoceny pro každý experiment na základě kontrolního seznamu požadavků College of American Pathologists (CAP) specifických pro sekvenování nové generace:

Metriky testu

a) Metriky RNASeq: (i) Počty čtení (celková čtení, jedinečná čtení, duplicitní čtení, čtení rRNA, specificita vlákna); (ii) Pokrytí (počet čtení, která pokrývají danou genomickou pozici): střední pokrytí, průměrný variační koeficient, pokrytí 5'/3', mezery v pokrytí, zkreslení GC (iii) Korelace exprese (naměřené úrovně exprese vs. známé úrovně vnitřních standardů ERCC) b) Detekce jednotlivých genů: (i) Analytická citlivost: zlomek případů, kdy je každý gen v interním standardu ERCC správně identifikován.

(ii) Analytická specificita: schopnost identifikovat nepřítomnost genů obsahujících vnitřní standard ERCC (iii) Přesnost: citlivost + specificita

Porovnání stratifikace molekulárního rizika (Thyroid GuidePx®) stanovené ve vzorcích FNB a v chirurgických vzorcích Pacienti s konečnou patologií, která neprokazuje papilární karcinom štítné žlázy, budou z analýzy shody vyloučeni. Podobně vzorky FNB, které jsou cytologicky negativní, budou z analýzy shody vyloučeny. Přiřazení molekulární třídy bude porovnáno mezi vzorky získanými FNB a odpovídajícími zmrazenými chirurgickými vzorky. Chirurgické vzorky budou považovány za zlatý standard. Kappa statistika bude použita ke stanovení významnosti konkordance mezi dvěma typy vzorků.

Rizikové vrstvy budou přiřazeny zaslepeným způsobem pomocí Thyroid GuidePx® a ATA Risk Stratification System. Strukturální a biochemické míry recidivy po 5 letech budou porovnány pro každou třídu rizika. K posouzení přesnosti testu bude použit binární výsledek testu, podmíněný stavem onemocnění (strukturální recidivou). Strukturální opakování představuje zlatý standard. K vyhodnocení citlivosti a specifičnosti každé metody stratifikace rizika bude použit 2stranný McNemarův test pro dva závislé podíly, s Holmovou úpravou pro multiplicitu pro posouzení každé míry přesnosti samostatně.

Výkon Thyroid GuidePx®

Z výše popsaných studií bude účinnost Thyroid GuidePx® hodnocena samostatně ve vzorcích FNB a chirurgických vzorcích. Výkonnostní charakteristiky budou hodnoceny následovně:

1. Časově závislé AUROC (oblast pod křivkou operátora přijímače) (24). Pro účely výpočtů je prahová úroveň pro pozitivní test označení středního nebo vysokého rizika (protože se předpokládá, že přiřazení středního rizika by vedlo k výrazně odlišným klinickým rozhodnutím).
2. Citlivost: počítá se jako kumulativní citlivost po 5 letech, jak popsali Kamarudin a Kolamunnage-Dona (24)
3. Specifičnost: vypočtena jako dynamická specifičnost, jak popsali Kamarudin a Kolamunnage-Dona (24)

Výpočet velikosti vzorku Porovnáme přiřazení molekulárního rizika z chirurgických vzorků a odpovídajících FNB od 109 pacientů. Minimální úroveň shody, která je klinicky přijatelná, je 80 %. Výpočty velikosti vzorku byly založeny na Lin's Kappa statistice pro shodu mezi dvěma měřeními pro tři molekulární podskupiny (25). Byla použita oboustranná hypotéza s hladinou významnosti 0,05 a síla byla stanovena na 90 %. Velikosti molekulárních podskupin byly stanoveny na 23 % (Typ 1), 49 % (Typ 2) a 28 % (Typ 3). Pokud je nulová hypotéza, že úroveň shody mezi FNB a chirurgickými vzorky je 0,6, pak bychom byli schopni detekovat úroveň shody 0,8 nebo vyšší u 109 pacientů. Shoda 0,90 by byla detekovatelná se 40 pacienty za předpokladu stejné nulové úrovně shody.

Asi 25 % pacientů s cytologií Bethesda V a asi 5 % pacientů s cytologií Bethesda VI bude mít benigní onemocnění. Navíc přibližně v 5 % případů je kvalita RNASeq ve vzorcích FFPE nedostatečná. Na základě toho plánujeme míru opuštění ve výši 20 %. Proto je studie navržena tak, aby zahrnovala 130 pacientů.

PŘÍMÝ PŘÍSTUP KE ZDROJOVÝM ÚDAJŮM/DOKUMENTŮM Místo klinického hodnocení umožní sledování související s hodnocením, audity, přezkoumání REB a regulační inspekce, které poskytují přímý přístup ke zdrojovým údajům/dokumentům.

Audity klinických zkoušek se provádějí s cílem poskytnout ujištění, že jsou řádně chráněna práva, bezpečnost a blaho pacientů, posoudit soulad s protokolem, procesy a dohodami, standardy správné klinické praxe ICH a platnými regulačními požadavky a posoudit kvalitu dat.

Kterákoli domácí regulační agentura může kdykoli přijít provést audit nebo inspekci místa studie. Tento audit se skládá z rozhovorů s hlavním řešitelem a studijním týmem, přezkoumání dokumentace a postupů, přezkoumání zařízení, vybavení a ověření zdrojových dat.

Zkoušející udělí jakékoli domácí regulační agentuře přímý přístup k papírové a/nebo elektronické dokumentaci týkající se klinické studie (např. CRF, zdrojové dokumenty, jako jsou tabulky nemocničních pacientů a studijní soubory vyšetřovatelů). Během auditu lze navštívit všechna zařízení na místě související s prováděním studie (např. laboratoř, ambulance). Vyšetřovatel souhlasí s tím, že bude spolupracovat a poskytovat pomoc v přiměřených časech a místech s ohledem na jakoukoli auditorskou činnost.

KONTROLA KVALITY A ZAJIŠTĚNÍ KVALITY Hlavní zkoušející zajistí, aby všichni členové studie dodržovali protokol a dodržovali regulační normy a standardy správné klinické praxe. Všechna místa klinických studií umožní monitorování, audity, revize REB a regulační inspekce související se studiem a poskytují přímý přístup ke zdrojovým datům/dokumentům.

Výbor pro monitorování dat (DMC) se během řízení sejde takto: 1. Po zahájení procesu k dokončení Charty DMC; 2. Po zapsání 24 účastníků; 3. Po zapsání 72 účastníků; a 4. po dokončení zápisu.

ETIKA Odpovědný zkoušející zajistí, aby tato studie byla provedena v souladu s Helsinskou deklarací. Tato studie bude provedena podle kanadských a mezinárodních standardů správné klinické praxe pro všechny studie včetně harmonizovaného tripartitního pokynu ICH pro správnou klinickou praxi. Budou také dodržovány platné vládní předpisy, pokyny pro klinické zkoušky NNHPD a zásady a postupy výzkumu Alberta Health Services.

Tento protokol a případné změny budou předloženy HREBA-CC k formálnímu schválení k provedení studie. Rozhodnutí HREBA-CC o provedení studie bude písemně zasláno zkoušejícímu.

Zveřejnění klasifikace molekulárního rizika z chirurgických vzorků ("zlatý standard") je ospravedlnitelné, protože existují podstatná data o výsledcích z chirurgických vzorků. Navíc, až bude tato zkouška zahájena, bude test komerčně dostupný jako test vyvinutý v laboratoři (LDT).

ZPRACOVÁNÍ DAT A UCHOVÁVÁNÍ ZÁZNAMŮ Jakmile je studie dokončena, všechna data pro tuto studii budou uchovávána po dobu 15 let a uložena podle protokolu v Centru pro klinický výzkum v Calgary.

FINANCOVÁNÍ A POJIŠTĚNÍ Zkouška bude financována společností Qualisure Diagnostics, Inc., doplněná o granty s hodnocením. Pojištění bude poskytovat University of Calgary a Alberta Health Services, stejně jako Qualisure Diagnostics.

PUBLIKAČNÍ POLITIKA Výsledky této klinické studie budou publikovány v recenzovaném časopise se všemi jmenovanými výzkumníky jako spoluautory. Všechny zdroje financování budou uznány.

6.0 Popište postupy, léčbu nebo činnosti, které jsou nad standardními postupy nebo je doplňují: .

Jedinou odchylkou od standardní klinické péče je intraoperační odběr vzorku FNB. Ve srovnání s plánovaným chirurgickým výkonem je však toto riziko malé. Hlavním rizikem je malé riziko klinicky významného krvácení, odhadované na < 1 %. Vzhledem k tomu, že s touto studií nebude spojena žádná intervence, neexistuje žádný plán pro sledování nežádoucích účinků.

Během operace, kdy jsou štítná žláza a nádor obnaženy, chirurg provede FNB dominantního nádoru (tj. léze identifikované před operací) pod přímým viděním. To nejpřesněji simuluje in vivo podmínky předoperační FNB, ale zároveň omezuje potenciální technické pády perkutánní biopsie (např.: nedostatečné zacílení léze).

Pod vedením spolupracujícího patologa bude část nádoru odstraněna a rychle zmrazena a sousední část bude odebrána pro fixaci formalínu a zalití parafínem. Tkáň bude uvolněna pro výzkum až po odebrání dostatečného množství tkáně pro diagnostické a klinické použití.