Concordanza della classificazione molecolare basata sulla biopsia con ago sottile (FNB) e sui campioni chirurgici

INFORMAZIONI DI BASE Il cancro della tiroide è l'ottavo tumore più comune per prevalenza e l'incidenza è aumentata di oltre il 6% all'anno dal 1992. Il cancro papillare della tiroide (PTC) rappresenta la maggior parte dei tumori della tiroide e la crescente incidenza del cancro alla tiroide può essere quasi interamente attribuita a un aumento del rilevamento di piccoli PTC (1). Il PTC ha solitamente una prognosi favorevole con tassi di guarigione elevati. Tuttavia, circa il 10-15% dei PTC mostra un comportamento più aggressivo e spesso è resistente alle terapie adiuvanti convenzionali come lo iodio radioattivo (2,3). Dato il numero crescente di casi di PTC (e il potenziale onere sui costi sanitari), una previsione accurata sta diventando sempre più importante. Stime accurate della prognosi e del rischio di recidiva eviteranno interventi chirurgici, indagini e follow-up inutilmente estesi nei soggetti con una buona prognosi e indirizzeranno interventi chirurgici più estesi, terapie adiuvanti e follow-up prolungati a coloro che ne hanno bisogno.

Il sistema di stratificazione del rischio dell'American Thyroid Association (ATA) Le decisioni terapeutiche sono basate sul sistema di stratificazione del rischio dell'American Thyroid Association (ATA), che stima il rischio di recidiva della malattia sulla base di fattori clinici e patologici. Sebbene questo sistema sia stato validato retrospettivamente da numerosi studi, la percentuale di varianza spiegata non è ottimale e varia dal 19% al 34% (4, 5). L'incapacità del sistema ATA di prevedere completamente la recidiva può essere correlata all'incapacità di questo sistema di integrare adeguatamente il rischio associato al profilo molecolare di un tumore. Solo un marcatore molecolare, BRAFV600E, è attualmente incorporato nel sistema di stratificazione del rischio ATA. Un altro limite dell’ATA Risk Stratification System è che può essere pienamente implementato solo dopo l’intervento chirurgico, quando sono disponibili tutti i dati clinici e patologici necessari per stimare il rischio. A quel punto, sono già state prese importanti decisioni terapeutiche e il paziente si è già reso conto dell’impatto dell’intervento chirurgico.

Stima del rischio prima del trattamento: l'attuale standard di cura Nel 2015, l'ATA ha riferito sui criteri che potrebbero essere utilizzati per selezionare i pazienti per interventi chirurgici più conservativi come la lobectomia tiroidea. Secondo le linee guida ATA del 2015, i pazienti con i seguenti criteri preoperatori sono considerati a basso rischio: dimensione del tumore 1-4 cm, clinicamente linfonodo negativo, nessuna diffusione extratiroidea, nessuna storia familiare di cancro alla tiroide e nessuna storia di radioterapia al collo ( 6). Questi pazienti potrebbero essere inizialmente trattati con una lobectomia tiroidea (invece di una tiroidectomia totale). Tuttavia, il 40-60% dei pazienti richiederà una tiroidectomia completa poiché la stratificazione del rischio postoperatorio (utilizzando tutte le informazioni cliniche e patologiche disponibili dopo l'intervento) li ha classificati come a rischio più elevato rispetto a quanto inizialmente stimato (7-11). In uno studio recente, il 51% dei pazienti ha richiesto la conversione ad una tiroidectomia completa perché ulteriori fattori di rischio sono stati riconosciuti durante l'intervento o dopo che era disponibile la patologia finale (12). Ciò dimostra i limiti delle stime del rischio clinico preoperatorio e la necessità di un metodo migliore di stima del rischio preoperatorio. Pertanto, i chirurghi e i pazienti affetti da cancro alla tiroide trarrebbero beneficio da informazioni aggiuntive che potrebbero perfezionare la decisione di eseguire la lobectomia in pazienti idonei, riducendo al minimo la necessità di completare la tiroidectomia.

Thyroid GuidePx®: un nuovo sistema di stratificazione del rischio molecolare Le carenze del sistema di stratificazione del rischio ATA nel determinare in modo affidabile la prognosi sono state affrontate utilizzando un nuovo sistema di stratificazione del rischio molecolare che comprende la firma genetica Thyroid GuidePx®. Utilizzando un algoritmo software per computer, le trascrizioni (mRNA) associate alla recidiva e le trascrizioni associate all'assenza di recidiva sono state identificate in un set di addestramento di 335 pazienti con PTC, quindi convalidate in un set di validazione di 167 pazienti. I tumori inclusi nel set di dati erano freschi congelati.

Sono stati identificati tre sottotipi molecolari in base al modello di espressione dei geni prognostici. Questi erano chiamati Tipo 1, Tipo 2 e Tipo 3. I PTC di tipo 3 avevano la biologia più aggressiva e il più alto tasso di recidiva. Il metodo è stato successivamente convalidato in 124 pazienti con PTC coreani e in 167 pazienti di Edmonton.

I sottotipi molecolari sono stati considerati nel contesto dello stadio del tumore. Nello specifico, i tumori che misuravano 1-4 cm in assenza di malattia linfonodale (che comprendono pazienti che sarebbero potenziali candidati alla lobectomia tiroidea) sono stati analizzati separatamente dai pazienti con malattia più avanzata. È interessante notare che i PTC di tipo 3 presentavano un alto tasso di recidiva indipendentemente dallo stadio del tumore. I candidati alla lobectomia con PTC di tipo 1 e di tipo 2 avevano un tasso di recidiva <3% (Figura 1A, B, fare riferimento a Protocol_Calgary_11 luglio 2023.docx allegato).

Prestazioni del test Il test basato su NGS che ha identificato il sottotipo molecolare di PTC è stato chiamato Thyroid GuidePx®. La sottoclassificazione molecolare e clinica combinata del PTC utilizzando Thyroid GuidePx® è stata confrontata con il sistema di stratificazione del rischio ATA. I gruppi di stratificazione del rischio ATA sono stati determinati da due medici praticanti per ciascun caso. Per calcolare l'area dipendente dal tempo sotto la curva caratteristica operativa del ricevitore (AUROC), è stata applicata una classificazione binaria: rischio basso rispetto a rischio intermedio/alto. L'AUROC è stato calcolato sulla base dei risultati di recidiva della coorte di scoperta del TCGA e della coorte di Edmonton. La migliore prestazione in termini di stratificazione del rischio è stata ottenuta dal test Thyroid GuidePx® in combinazione con le caratteristiche cliniche (ad esempio, dimensione del tumore e coinvolgimento dei linfonodi). Utilizzando il pacchetto smoothROCtime, l'AUROC a 5 anni è stato 0,80 per Thyroid GuidePx® se si considerano le dimensioni del tumore e lo stato dei linfonodi e 0,51 per il sistema di stratificazione del rischio ATA (Figura 2, fare riferimento a Protocol_Calgary_July 11, 2023.docx allegato).

Thyroid GuidePx®: Descrizione del test Il test Thyroid GuidePx® è un test basato sul sequenziamento mirato dell'RNA con arricchimento con cattura ibrida (RNA-Seq). L'input del test è l'RNA isolato da tessuto fissato in formalina incluso in paraffina (FFPE) o da campioni di cancro papillare della tiroide mediante biopsia con ago sottile (FNB). La preparazione della libreria prevede l'amplificazione specifica delle regioni target di ciascuno dei geni nel pannello Thyroid GuidePx®. Il pannello è composto da 82 geni. Le librerie di campioni risultanti vengono trasferite in una cartuccia di reagenti MiSeq/MiSeqDx che contiene tutti i reagenti per il sequenziamento. Il software Real-Time Analysis (RTA), che è un componente del sequenziatore MiSeq/MiSeqDx, fornisce identificazioni delle basi e punteggi di qualità associati durante la corsa di sequenziamento. Vengono generati file FASTQ che contengono le informazioni sulla sequenza e sulla qualità. Il file FASTQ è un formato di file basato su testo ampiamente utilizzato per memorizzare la sequenza nucleotidica per ciascun amplicone e il relativo punteggio di qualità. I file FASTQ servono come input per gli algoritmi di allineamento delle sequenze. Le letture allineate vengono scritte su file in formato BAM che vengono successivamente convertiti in conteggi di letture e valori di espressione. I livelli di espressione genica vengono quindi sottoposti all'algoritmo per classificare le categorie di rischio.

Il software classifica il rischio in base al modello di espressione di gruppi di geni all'interno del pannello Thyroid GuidePx® da 82 geni. Sono state definite tre classi molecolari sulla base di uno studio con 502 campioni di pazienti che associavano il modello di espressione genica alla sopravvivenza libera da recidiva a 5 anni. Un gruppo ad alto rischio arricchito con mutazioni BRAFV600E; e sono stati identificati due sottogruppi molecolari a rischio inferiore.

Utilità clinica

La prognosi più accurata fornita da Thyroid GuidePx® potrebbe influenzare le decisioni terapeutiche dei medici. Di seguito sono riportati esempi di come i medici possono applicare le nuove informazioni derivate da Thyroid GuidePx®:

1. Il PTC a basso rischio potrebbe potenzialmente essere trattato con una tiroidectomia parziale (ad esempio, lobectomia) o anche con sorveglianza attiva, piuttosto che con una tiroidectomia totale. Ciò comporta due vantaggi principali oltre al risparmio di tempo e costi. In primo luogo, vi è una riduzione della potenziale necessità di sostituzione permanente dell’ormone tiroideo a seguito di una lobectomia. In secondo luogo, non vi è praticamente alcun rischio di complicazioni potenzialmente devastanti di una tiroidectomia totale, come lesioni bilaterali del nervo laringeo ricorrente o ipoparatiroidismo permanente.
2. L’identificazione accurata del PTC a basso rischio aumenterebbe anche l’adeguatezza dello iodio radioattivo adiuvante (RAI). La terapia con radioiodio può provocare effetti collaterali sia transitori che a lungo termine, quali disfunzione delle ghiandole salivari, disfunzione ovarica e testicolare e soppressione del midollo osseo. La terapia con radioiodio presenta anche un rischio teorico di neoplasie secondarie: una stima è che 100 mCi di 131I inducono 56 neoplasie maligne ogni 10.000 pazienti trattati (15). Anche limitare la terapia con radioiodio a quei pazienti che otterrebbero un miglioramento della sopravvivenza globale o libera da malattia è economicamente vantaggioso.
3. La sorveglianza del PTC può mettere a dura prova i pazienti e le organizzazioni sanitarie per due motivi: il PTC viene diagnosticato più comunemente nella mezza età e i pazienti spesso sopravvivono per lunghi periodi dopo la diagnosi. Ciò significa che gli esami e le indagini regolari per la diagnosi precoce delle recidive possono andare avanti per molti anni. Il follow-up prevede in genere l'esame obiettivo annuale, la misurazione sierica dell'ormone stimolante la tiroide e della tireoglobulina e l'ecografia periodica del collo. I pazienti a basso rischio possono avere intervalli più lunghi tra gli esami di follow-up e le indagini e potrebbero essere potenzialmente dimessi dalla sorveglianza.
4. È importante anche identificare accuratamente i pazienti ad alto rischio di recidiva. È noto che il sistema di stratificazione del rischio ATA è impreciso nel prevedere la recidiva. Nei pazienti classificati come "a basso rischio" utilizzando il sistema di stratificazione del rischio ATA 2015, il 16% dei pazienti alla fine sviluppa una malattia ricorrente (16). Questi pazienti potrebbero essere sottotrattati a causa di questa classificazione del rischio. Nei pazienti per i quali è disponibile un’assegnazione più accurata del rischio elevato, possono essere presi in considerazione trattamenti più aggressivi (ad esempio tiroidectomia totale e radioiodio) o l’arruolamento in studi clinici.

Thyroid GuidePx® mediante biopsia con ago sottile Finora i nostri studi sono stati condotti utilizzando campioni chirurgici ed è stato prodotto un test disponibile in commercio in questo formato. Tuttavia, un recente studio condotto dall’Institute of Health Economics ha stabilito che una maggiore efficacia in termini di costi di Thyroid GuidePx® si otterrebbe eseguendo il test prima dell’intervento chirurgico. L'implementazione di un test prima dell'intervento richiederebbe che il test funzioni bene utilizzando campioni derivati ​​da una biopsia con ago sottile (FNB).

Gli FNB tiroidei vengono regolarmente conservati in CytoLyt, un conservante liquido tamponato a base di metanolo, fino a 7 giorni prima del trasferimento delle cellule in un ThinPrep per la valutazione citologica. Noi e altri (17-21) abbiamo precedentemente determinato che DNA e RNA di qualità possono essere derivati ​​da cellule in CytoLyt. Il nostro recente studio di fattibilità composto da 12 pazienti con PTC ha dimostrato che l'esecuzione del test Thyroid GuidePx® sugli FNB è fattibile. Finora, il tasso di successo tecnico è stato del 100% e la concordanza del livello genetico con i campioni chirurgici supera lo 0,9. Tuttavia, fare affidamento su un FNB limitato per la caratterizzazione della malattia molecolare implica che il campione sia rappresentativo dell'intero tumore. L'eterogeneità genomica e trascrittomica è stata descritta nei tumori primari e nelle metastasi (23). Pertanto, sarà importante documentare la concordanza tra i campioni acquisiti dalla FNB e i campioni chirurgici.

OBIETTIVI E SCOPO DELLA SPERIMENTAZIONE Lo scopo generale dello studio è determinare se il campione più limitato ottenuto da una biopsia con ago sottile è sufficientemente rappresentativo del tumore più grande per determinare una classificazione molecolare valida utilizzando il test Thyroid GuidePx®.

Obiettivo primario 1. Determinare la concordanza tra le classificazioni molecolari Thyroid GuidePx® acquisite da FNA e campioni chirurgici abbinati.

Obiettivi secondari

1. Per confrontare il tasso di successo tecnico nel completare un Thyroid GuidePx® valido utilizzando FNA e campioni chirurgici.
2. Confrontare gli esiti di recidiva utilizzando il sistema di stratificazione del rischio ATA rispetto ai pazienti classificati da Thyroid GuidePx® utilizzando campioni chirurgici.
3. Confrontare gli esiti di recidiva utilizzando il sistema di stratificazione del rischio ATA rispetto ai pazienti classificati da Thyroid GuidePx® utilizzando campioni FNA.

PROGETTAZIONE DELLA PROVA Schema della prova (fare riferimento a Protocol_Calgary_11 luglio 2023.docx allegato)

Acquisizione e analisi dei campioni I pazienti saranno invitati a partecipare se hanno una diagnosi tissutale preoperatoria di PTC (Bethesda VI) o sospetta per PTC (Bethesda V) e sono idonei alla tiroidectomia parziale o totale, come descritto nei criteri di inclusione ed esclusione . Dopo il consenso, i pazienti verranno sottoposti a intervento chirurgico come pianificato dal loro chirurgo. Verranno acquisiti dati demografici, clinici e patologici da tutti i partecipanti.

Durante l'intervento chirurgico, quando la ghiandola tiroidea e il tumore sono esposti, il chirurgo eseguirà una FNB del tumore dominante (ovvero: la lesione identificata preoperatoriamente), sotto visione diretta. Questo simula il più fedelmente possibile le condizioni in vivo di un FNB preoperatorio, ma limita i potenziali inconvenienti tecnici di una biopsia percutanea (ad esempio: targeting inadeguato della lesione). Il materiale cellulare derivato dall'FNB verrà immediatamente posto nel mezzo di trasporto (CytoLyt), quindi refrigerato. I campioni verranno inviati settimanalmente al laboratorio centrale per l'isolamento dell'RNA e l'RNASeq. Allo stesso tempo, i campioni di FNB verranno esaminati per la presenza di cellule tumorali da un citopatologo esperto.

Se è presente più di un nodulo, il nodulo FNB verrà contrassegnato dal chirurgo per il patologo. Sotto la direzione di un patologo collaboratore, un pezzo del tumore verrà rimosso e congelato, mentre un pezzo adiacente verrà prelevato per la fissazione in formalina e l'inclusione in paraffina (FFPE). Un vetrino H&E dal campione FFPE verrà colorato per H&E e verranno preparate 3-6 sezioni non colorate, quindi inviate al laboratorio centrale per la microdissezione, l'isolamento dell'RNA e l'RNASeq. Questo processo seguirà i protocolli di elaborazione dei campioni di routine e non interferirà con i metodi standard di diagnosi patologica.

Se i pazienti hanno firmato il modulo di consenso informato facoltativo per la biobanca, se è presente un campione congelato rimanente sufficiente, il campione verrà conservato allo scopo di ripetere il test (se necessario) o per supportare studi aggiuntivi come l'analisi dell'intero trascrittoma e l'analisi mutazionale. L'utilizzo di questi campioni per questi scopi richiederebbe ulteriori approvazioni etiche.

Uno studio di fattibilità composto da 12 pazienti è già stato completato. Il tasso di successo tecnico nell'acquisizione dei campioni e nell'esecuzione del test è stato del 100%, la quantità e la qualità dell'RNA erano eccellenti negli FNB e si è riscontrata un'eccellente concordanza dei livelli genici nei test eseguiti sugli FNB e sui campioni chirurgici.

RNASeq for Thyroid GuidePx® sarà eseguito presso OncoHelix, un laboratorio clinico esperto in oncologia di precisione situato presso la Cumming School of Medicine, Università di Calgary. Se i test non possono essere eseguiti tempestivamente presso OncoHelix, i campioni verranno testati presso Protean BioDiagnostics, un laboratorio certificato CAP/CLIA a Orlando, FL che attualmente esegue il test a livello commerciale. Le classi di rischio verranno assegnate dal software progettato da Qualisure Diagnostics utilizzando i dati generati da RNASeq.

Endpoint

Endpoint primario:

1. Concordanza, classificazione del rischio molecolare degli FNB del cancro papillare della tiroide e campioni chirurgici congelati abbinati

Endpoint secondari:

1. Tasso di successo tecnico nel completare un Thyroid GuidePx® valido utilizzando gli FNB
2. Tasso di successo tecnico nel completare un Thyroid GuidePx® valido in campioni chirurgici FFPE.
3. Tasso di recidiva biochimica a 5 anni (tireoglobulina ≥ 1 ng/mL, solo per i pazienti sottoposti a tiroidectomia totale)
4. Tasso di recidiva strutturale a 5 anni

5. Prestazioni del test come test prognostico, Thyroid GuidePx®: FNB e campioni chirurgici

   1. Specificità: la percentuale di pazienti senza recidiva strutturale prevista dal test
   2. Sensibilità: la capacità del test di identificare individui la cui malattia recidiverà entro 5 anni (percentuale di recidive strutturali previste)
   3. AUROC
   4. Valore predittivo positivo
   5. Valore predittivo negativo

6. Performance, stratificazione del rischio ATA

   1. Specificità: la percentuale di pazienti senza recidiva strutturale prevista dal test
   2. Sensibilità: la capacità del test di identificare individui la cui malattia recidiverà entro 5 anni (percentuale di recidive strutturali previste)
   3. AUROC
   4. Valore predittivo positivo
   5. Valore predittivo negativo

Accecamento e limitazione del bias Verranno inclusi nell'analisi solo i campioni con una qualità di RNA sufficiente (DV200>30). Solo gli FNB contenenti cellule tumorali ("citologia positiva") saranno inclusi nel calcolo della concordanza. RNASeq verrà eseguito da un tecnico che è all'oscuro di qualsiasi dettaglio clinico. In particolare, il tecnico non sarà in grado di identificare campioni corrispondenti da campioni chirurgici e FNB. La classificazione molecolare sarà effettuata in cieco. I dati saranno monitorati da un comitato indipendente per il monitoraggio dei dati. Il Comitato per il monitoraggio dei dati, composto da almeno tre persone tra cui uno statistico, monitorerà l'analisi dei dati.

Regole di arresto Nei nostri campioni chirurgici, le ripetizioni inter-lotto e intra-lotto presentavano costantemente una concordanza del livello genico >0,9. La concordanza a livello genico tra FNB positivo al citologia e campioni chirurgici congelati (il "gold standard") sarà monitorata per ciascun lotto di 24 pazienti. Se R<0,9, faremo una pausa per rivalutare il flusso di lavoro analitico e la strumentazione. Se la concordanza è persistentemente inferiore a 0,9 dopo 72 pazienti, smetteremo di valutare gli FNB, ma continueremo a testare i campioni chirurgici. Poiché non si tratta di uno studio ad alto rischio, non intendiamo terminare prematuramente lo studio. Anche se esiste una bassa concordanza tra FNB e campioni chirurgici, saranno utili i dati derivati ​​dallo studio dei risultati in relazione alla classificazione molecolare (nei campioni chirurgici).

SELEZIONE E RITIRO DEI SOGGETTI Criteri di inclusione

1. Età ≥ 18 anni
2. Una diagnosi di cancro papillare della tiroide basata su una biopsia con ago sottile (FNB) interpretata come una citologia Bethesda V o VI
3. Dimensioni del tumore > 1 cm di diametro massimo
4. Il paziente è un candidato operatorio
5. Il paziente ha fornito il consenso

Criteri di esclusione

1. Storia familiare di cancro alla tiroide
2. Storia di radiazioni al collo
3. Impossibile o non disposto a sottoporsi a una biopsia con ago sottile
4. Non disposto a sottoporsi a tiroidectomia
5. La patologia finale non dimostra il cancro papillare della tiroide
6. Casi in cui non è presente un chiaro nodulo dominante
7. Casi in cui sono presenti più noduli che precludono il campionamento di un nodulo definito

Criteri di ritiro del soggetto I soggetti possono interrompere la partecipazione in qualsiasi momento avvisando uno dei ricercatori o il personale di ricerca. I dati acquisiti prima della revoca verranno utilizzati per analisi, ma nessun ulteriore dato verrà raccolto dopo la revoca. Su richiesta del soggetto, i campioni possono essere ritirati prima del test. I soggetti verranno sostituiti se i campioni non sono stati testati da RNASeq (Thyroid GuidePx®).

TRATTAMENTO DEI SOGGETTI La classificazione molecolare e il rischio di recidiva determinati da Thyroid GuidePx® saranno divulgati al medico e al paziente. Il rischio di recidiva si basa su dati di validazione cumulativi che includono casi provenienti da Alberta e Australia. Verranno divulgati solo i risultati del campione chirurgico congelato (il "gold standard"). Come di consueto, le decisioni terapeutiche verranno prese dal medico in collaborazione con il paziente, sulla base di una sintesi di tutte le informazioni cliniche disponibili. Questo studio clinico non definisce un percorso di trattamento. La frequenza e la durata del follow-up non saranno prescritte dal protocollo e saranno determinate dal medico curante. Questo è uno studio non interventistico e quindi la conformità non sarà monitorata.

VALUTAZIONE DELL'EFFICACIA Un risultato secondario è la prestazione del test per stratificare il rischio di recidiva. Le prestazioni del test verranno confrontate con campioni acquisiti da FNB e campioni chirurgici, quindi confrontate con l'attuale standard di cura (il sistema di stratificazione del rischio ATA). Il tempo alla recidiva sarà misurato dal momento del completamento del trattamento iniziale. Nei pazienti con malattia microscopica residua dopo l'intervento chirurgico, il tempo alla recidiva sarà misurato dal completamento della dose terapeutica di iodio radioattivo. Gli eventi di ricorrenza saranno definiti sulla base delle linee guida dell'American Thyroid Association del 2016.

I seguenti criteri indicheranno uno stato libero da malattia dopo la terapia: (i) nessuna evidenza clinica di tumore; (ii) nessuna evidenza di tumore all'imaging con iodio radioattivo e/o all'ecografia cervicale; (iii) per tiroidectomia post-totale, tireoglobulina sierica (Tg) non stimolata <0,2 ng/ml; per post-lobectomia, Tg<30 non stimolata. Una risposta indeterminata alla terapia sarà definita come: (i) nessuna evidenza clinica di tumore; (ii) nessuna evidenza di tumore all'imaging con iodio radioattivo e/o all'ecografia cervicale; (iii) per tiroidectomia post-totale, Tg non stimolata 0,2 - 1; per post-lobectomia, Tg>30. Dopo una tiroidectomia totale, una risposta biochimica incompleta è definita come Tg>1 in assenza di malattia strutturale. I valori della Tg sono affidabili solo in assenza di anticorpi interferenti (TgAb) (6).

La malattia sarà definita come una vera recidiva se un paziente aveva precedentemente una Tg non rilevabile in assenza di TgAb e un esame ecografico del collo negativo entro 1 anno dal precedente intervento. La malattia persistente sarà definita come Tg superiore alle soglie sopra indicate, un'ecografia del collo anormale, livelli persistentemente aumentati di TgAb o presenza di metastasi a distanza.

I pazienti con malattia persistente e/o malattia metastatica (resezione non curativa) non saranno inclusi nel calcolo della sopravvivenza libera da recidiva.

VALUTAZIONE DELLA SICUREZZA L'unica deviazione dalla cura clinica standard è il prelievo intraoperatorio del campione da parte della FNB. Tuttavia, rispetto all’intervento chirurgico pianificato, questo rischio è minimo. Il rischio principale è un piccolo rischio di sanguinamento clinicamente significativo, stimato <1%. Poiché non ci sarà alcun intervento associato a questo studio, non esiste un piano per il monitoraggio degli eventi avversi.

STATISTICHE Ottimizzazione delle condizioni RNASeq per i campioni in CytoLyt L'RNA verrà isolato dagli FNB in ​​CytoLyt secondo la SOP. La quantità di RNA sarà valutata mediante NanoDrop e la qualità sarà quantificata mediante DV200. RNASeq verrà eseguito in campioni CytoLyt e campioni congelati abbinati a diverse profondità di lettura. Nei tessuti CytoLyt e FFPE accoppiati, le metriche del test verranno valutate in funzione del metodo di conservazione del tessuto in ingresso, della qualità dell'RNA (DV200) e del tempo di conservazione. L'espressione genica verrà confrontata in CytoLyt accoppiati e in tessuti congelati, quindi correlata tra le condizioni. Il risultato più importante, l'assegnazione delle classi molecolari, sarà confrontato in campioni accoppiati.

Per ciascun esperimento verranno valutate le seguenti metriche prestazionali, sulla base dell'elenco di controllo dei requisiti specifici del sequenziamento di prossima generazione del College of American Pathologists (CAP):

Metriche di analisi

a) Metriche RNASeq: (i) Conteggi delle letture (letture totali, letture uniche, letture duplicate, letture rRNA, specificità del filamento); (ii) Copertura (numero di letture che coprono una data posizione genomica): copertura media, coefficiente medio di variazione, copertura 5'/3', lacune nella copertura, bias GC (iii) Correlazione dell'espressione (livelli di espressione misurati rispetto a livelli noti degli standard interni ERCC) b) Rilevazione di singoli geni: (i) Sensibilità analitica: frazione di casi in cui ciascun gene nello standard interno ERCC è identificato correttamente.

(ii) Specificità analitica: capacità di identificare l'assenza dei geni che compongono lo standard interno ERCC (iii) Accuratezza: sensibilità + specificità

Confronto della stratificazione del rischio molecolare (Tiroide GuidePx®) determinata nei campioni FNB e nei campioni chirurgici I pazienti con una patologia finale che non dimostra cancro papillare della tiroide saranno esclusi dall'analisi di concordanza. Allo stesso modo, i campioni FNB negativi alla citologia verranno esclusi dall'analisi di concordanza. L'assegnazione della classe molecolare verrà confrontata tra i campioni ottenuti da FNB e campioni chirurgici congelati abbinati. I campioni chirurgici saranno considerati il ​​gold standard. La statistica kappa verrà utilizzata per determinare il significato della concordanza tra i due tipi di campione.

Gli strati di rischio verranno assegnati in cieco utilizzando Thyroid GuidePx® e il sistema di stratificazione del rischio ATA. Per ciascuna classe di rischio verranno confrontati i tassi di recidiva strutturale e biochimica a 5 anni. Per valutare l'accuratezza del test verrà utilizzato un risultato binario del test, condizionato allo stato della malattia (recidiva strutturale). La ricorrenza strutturale rappresenta il gold standard. Verrà utilizzato un test McNemar a due code per due proporzioni dipendenti per valutare la sensibilità e la specificità di ciascun metodo di stratificazione del rischio, con l'aggiustamento di Holm per la molteplicità per valutare ciascuna misura di accuratezza separatamente.

Prestazioni di Thyroid GuidePx®

Dagli studi sopra descritti, le prestazioni di Thyroid GuidePx® saranno valutate separatamente nei campioni FNB e nei campioni chirurgici. Le caratteristiche prestazionali verranno valutate come segue:

1. AUROC dipendente dal tempo (area sotto la curva dell'operatore del ricevitore) (24). Ai fini dei calcoli, il livello soglia per un test positivo è una designazione di rischio intermedio o alto (poiché si prevede che un'assegnazione di rischio intermedio comporterebbe decisioni cliniche significativamente diverse).
2. Sensibilità: calcolata come sensibilità cumulativa a 5 anni, come descritto da Kamarudin e Kolamunnage-Dona (24)
3. Specificità: calcolata come specificità dinamica, come descritto da Kamarudin e Kolamunnage-Dona (24)

Calcolo della dimensione del campione Confronteremo l'assegnazione del rischio molecolare da campioni chirurgici e FNB abbinati di 109 pazienti. Un livello minimo di concordanza clinicamente accettabile è dell’80%. I calcoli della dimensione del campione erano basati sulla statistica Kappa di Lin per la concordanza tra le due misure per tre sottogruppi molecolari (25). È stata applicata un'ipotesi bilaterale con un livello di significatività di 0,05 e la potenza è stata fissata al 90%. Le dimensioni dei sottogruppi molecolari sono state fissate al 23% (Tipo 1), 49% (Tipo 2) e 28% (Tipo 3). Se l’ipotesi nulla fosse che il livello di concordanza tra FNB e campioni chirurgici fosse 0,6, allora saremmo in grado di rilevare un livello di concordanza pari o superiore a 0,8 con 109 pazienti. Una concordanza di 0,90 sarebbe rilevabile con 40 pazienti che assumessero lo stesso livello di concordanza nullo.

Circa il 25% dei pazienti con citologia Bethesda V e circa il 5% dei pazienti con citologia Bethesda VI presenteranno una malattia benigna. Inoltre, in circa il 5% dei casi, la qualità dell'RNASeq è insufficiente nei campioni FFPE. Su questa base prevediamo un tasso di abbandono del 20%. Pertanto, lo studio è progettato per includere 130 pazienti.

ACCESSO DIRETTO AI DATI/DOCUMENTI FONTE Il sito della sperimentazione clinica consentirà il monitoraggio correlato alla sperimentazione, gli audit, la revisione dei REB e le ispezioni normative, fornendo accesso diretto ai dati/documenti sorgente.

Gli audit degli studi clinici vengono eseguiti per garantire che i diritti, la sicurezza e il benessere dei pazienti siano adeguatamente protetti, per valutare la conformità al protocollo, ai processi e agli accordi, agli standard di buona pratica clinica ICH e ai requisiti normativi applicabili e per valutare la qualità dei dati.

Qualsiasi agenzia di regolamentazione nazionale può venire in qualsiasi momento per verificare o ispezionare il sito di studio. Questo audit consiste in interviste con il ricercatore principale e il gruppo di studio, revisione della documentazione e delle pratiche, revisione delle strutture, delle attrezzature e verifica dei dati di origine.

Lo sperimentatore garantirà a qualsiasi agenzia regolatoria nazionale l'accesso diretto alla documentazione cartacea e/o elettronica relativa allo studio clinico (ad es. CRF, documenti di origine come cartelle cliniche dei pazienti ospedalieri e file di studi dello sperimentatore). Tutte le strutture del sito legate alla conduzione dello studio potrebbero essere visitate durante un audit (ad es. laboratorio, ambulatorio). L'investigatore si impegna a collaborare e fornire assistenza in tempi e luoghi ragionevoli rispetto a qualsiasi attività di audit.

CONTROLLO DI QUALITÀ E ASSICURAZIONE DI QUALITÀ Il ricercatore principale garantirà che tutti i membri dello studio seguano il protocollo e si conformino agli standard normativi e di buona pratica clinica. Tutti i siti di sperimentazione clinica consentiranno il monitoraggio correlato alla sperimentazione, gli audit, la revisione REB e le ispezioni normative, fornendo accesso diretto ai dati/documenti di origine.

Il Comitato per il Monitoraggio dei Dati (DMC) si riunirà durante lo svolgimento dello studio come segue: 1. All'inizio dello studio per finalizzare la Carta del DMC; 2. Dopo che sono stati iscritti 24 partecipanti; 3. Dopo che sono stati iscritti 72 partecipanti; e 4. dopo il completamento dell'iscrizione.

ETICA Il ricercatore responsabile garantirà che questo studio sia condotto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki. Questo studio sarà condotto secondo gli standard canadesi e internazionali di buona pratica clinica per tutti gli studi, inclusa la linea guida tripartita armonizzata ICH sulla buona pratica clinica. Verranno inoltre seguite le normative governative applicabili, le linee guida sugli studi clinici dell'NNHPD e le politiche e le procedure di ricerca dei servizi sanitari dell'Alberta.

Questo protocollo ed eventuali modifiche saranno sottoposti all'HREBA-CC per l'approvazione formale per condurre lo studio. La decisione dell'HREBA-CC relativa alla conduzione dello studio sarà presa per iscritto allo sperimentatore.

La divulgazione della classificazione del rischio molecolare dai campioni chirurgici (il "gold standard") è giustificabile, poiché esistono dati sostanziali sui risultati dei campioni chirurgici. Inoltre, quando questa sperimentazione verrà lanciata, il test sarà disponibile in commercio come test sviluppato in laboratorio (LDT).

GESTIONE DEI DATI E CONSERVAZIONE DELLA REGISTRAZIONE Una volta completato lo studio, tutti i dati per questo studio verranno conservati per 15 anni, archiviati secondo il protocollo presso il Calgary Center for Clinical Research.

FINANZIAMENTO E ASSICURAZIONE Lo studio sarà finanziato da Qualisure Diagnostics, Inc., integrato da sovvenzioni sottoposte a revisione paritaria. L'assicurazione sarà fornita dall'Università di Calgary e dai servizi sanitari dell'Alberta, nonché da Qualisure Diagnostics.

POLITICA DI PUBBLICAZIONE I risultati di questo studio clinico saranno pubblicati in una rivista sottoposta a revisione paritaria con tutti i ricercatori nominati come coautori. Verranno riconosciute tutte le fonti di finanziamento.

6.0 Descrivere procedure, trattamenti o attività che sono al di sopra o in aggiunta alle pratiche standard: .

L'unica deviazione dalla cura clinica standard è l'acquisizione intraoperatoria del campione da parte della FNB. Tuttavia, rispetto all’intervento chirurgico pianificato, questo rischio è minimo. Il rischio principale è un piccolo rischio di sanguinamento clinicamente significativo, stimato <1%. Poiché non ci sarà alcun intervento associato a questo studio, non esiste un piano per il monitoraggio degli eventi avversi.

Durante l'intervento chirurgico, quando la ghiandola tiroidea e il tumore sono esposti, il chirurgo eseguirà una FNB del tumore dominante (ovvero: la lesione identificata preoperatoriamente), sotto visione diretta. Questo simula il più fedelmente possibile le condizioni in vivo di un FNB preoperatorio, ma limita i potenziali inconvenienti tecnici di una biopsia percutanea (ad esempio: targeting inadeguato della lesione).

Sotto la direzione di un patologo collaboratore, un pezzo del tumore verrà rimosso e congelato, mentre un pezzo adiacente verrà prelevato per la fissazione in formalina e l'inclusione in paraffina. Il tessuto verrà rilasciato per la ricerca solo una volta prelevato tessuto sufficiente per uso diagnostico e clinico.