Concordância da classificação molecular baseada em biópsia por agulha fina (FNB) e amostras cirúrgicas

INFORMAÇÕES BÁSICAS O câncer de tireoide é o oitavo tipo de câncer mais comum em termos de prevalência, e a incidência tem aumentado >6% ao ano desde 1992. O câncer papilar de tireoide (CPT) é responsável pela maioria dos cânceres de tireoide, e a incidência crescente de câncer de tireoide pode ser quase inteiramente atribuída a um aumento na detecção de pequenos PTCs (1). O PTC geralmente tem prognóstico favorável com altas taxas de cura. No entanto, aproximadamente 10-15% dos PTC apresentam um comportamento mais agressivo e são frequentemente resistentes às terapias adjuvantes convencionais, como o iodo radioactivo (2,3). Dado o número crescente de casos de PTC (e o peso potencial nos custos dos cuidados de saúde), um prognóstico preciso está a tornar-se cada vez mais importante. Estimativas precisas do prognóstico e do risco de recorrência evitarão cirurgias, investigações e acompanhamentos desnecessariamente extensos em indivíduos com bom prognóstico e direcionarão cirurgias mais extensas, terapias adjuvantes e acompanhamentos prolongados para aqueles que precisarem.

As decisões de tratamento do Sistema de Estratificação de Risco da American Thyroid Association (ATA) são informadas pelo Sistema de Estratificação de Risco da American Thyroid Association (ATA), que estima o risco de recorrência da doença com base em fatores clínicos e patológicos. Embora este sistema tenha sido validado retrospectivamente por vários estudos, a proporção de variância explicada é subótima e varia de 19% a 34% (4, 5). A incapacidade do sistema ATA em prever completamente a recorrência pode estar relacionada com a falha deste sistema em integrar adequadamente o risco associado ao perfil molecular de um tumor. Apenas um marcador molecular, BRAFV600E, está atualmente incorporado no Sistema de Estratificação de Risco ATA. Outra limitação do Sistema de Estratificação de Risco ATA é que ele só pode ser totalmente implementado após a cirurgia, quando todos os dados clínicos e patológicos necessários para estimar o risco estiverem disponíveis. Nesse momento, decisões significativas de tratamento já foram tomadas e o impacto da cirurgia já foi percebido pelo paciente.

Estimando o risco antes do tratamento: o padrão atual de atendimento Em 2015, a ATA relatou critérios que poderiam ser usados ​​para selecionar pacientes para cirurgias mais conservadoras, como a lobectomia da tireoide. De acordo com as diretrizes da ATA de 2015, pacientes com os seguintes critérios pré-operatórios são considerados de baixo risco: tamanho do tumor de 1 a 4 cm, linfonodo clínico negativo, sem disseminação extratireoidiana, sem histórico familiar de câncer de tireoide e sem histórico de radioterapia no pescoço. 6). Esses pacientes poderiam ser inicialmente tratados com lobectomia tireoidiana (em oposição a tireoidectomia total). No entanto, 40-60% necessitarão de tireoidectomia completa porque a estratificação de risco pós-operatório (utilizando todas as informações clínicas e patológicas disponíveis após a cirurgia) os classificou como de risco mais elevado do que o inicialmente estimado (7-11). Num estudo recente, 51% dos pacientes necessitaram de conversão para uma tireoidectomia completa porque fatores de risco adicionais foram reconhecidos durante a cirurgia ou após a patologia final estar disponível (12). Isto demonstra as limitações das estimativas clínicas de risco pré-operatório e a necessidade de um método melhorado de estimativa de risco pré-operatório. Portanto, cirurgiões e pacientes com câncer de tireoide se beneficiariam de informações adicionais que refinariam a decisão de realizar lobectomia em pacientes apropriados, minimizando ao mesmo tempo a necessidade de conclusão da tireoidectomia.

Thyroid GuidePx®: um novo sistema de estratificação de risco molecular As deficiências do sistema de estratificação de risco ATA para determinar o prognóstico de forma confiável foram abordadas usando um novo sistema de estratificação de risco molecular que compreende a assinatura do gene Thyroid GuidePx®. Usando um algoritmo de software de computador, as transcrições (mRNA) associadas à recorrência e as transcrições associadas à ausência de recorrência foram identificadas em um conjunto de treinamento de 335 pacientes com PTC e depois validadas em um conjunto de validação de 167 pacientes. Os tumores incluídos no conjunto de dados foram congelados recentemente.

Foram identificados três subtipos moleculares com base no padrão de expressão de genes prognósticos. Estes foram chamados de Tipo 1, Tipo 2 e Tipo 3. Os PTCs do Tipo 3 tiveram a biologia mais agressiva e a maior taxa de recorrência. O foi posteriormente validado em 124 pacientes com PTC da Coreia, bem como em 167 pacientes de Edmonton.

Os subtipos moleculares foram considerados no contexto do estágio do tumor. Especificamente, tumores medindo 1 a 4 cm na ausência de doença linfonodal (que compreendem pacientes que seriam potenciais candidatos à lobectomia da tireoide) foram analisados ​​separadamente dos pacientes com doença mais avançada. Curiosamente, os PTCs Tipo 3 tiveram uma alta taxa de recorrência, independentemente do estágio do tumor. Candidatos à lobectomia com PTCs Tipo 1 e Tipo 2 tiveram uma taxa de recorrência de <3% (Figura 1A, B, consulte Protocol_Calgary_July 11, 2023.docx apegado).

Desempenho do teste O teste baseado em NGS que identificou o subtipo molecular de PTC foi denominado Thyroid GuidePx®. A subclassificação molecular e clínica combinada do PTC usando Thyroid GuidePx® foi comparada com o Sistema de Estratificação de Risco ATA. Os grupos de estratificação de risco de ATA foram determinados por dois médicos praticantes para cada caso. Para calcular a área dependente do tempo sob a curva característica de operação do receptor (AUROC), foi aplicada uma classificação binária: risco baixo versus risco intermediário/alto. A AUROC foi calculada com base nos resultados de recorrência da coorte de descoberta do TCGA e da coorte de Edmonton. O melhor desempenho na estratificação de risco foi alcançado pelo teste Thyroid GuidePx® em conjunto com características clínicas (ou seja, tamanho do tumor e envolvimento de linfonodos). Usando o pacote smoothROCtime, a AUROC de 5 anos foi de 0,80 para Thyroid GuidePx® ao considerar o tamanho do tumor e o status dos linfonodos, e 0,51 para o sistema de estratificação de risco ATA (Figura 2, consulte Protocol_Calgary_July 11, 2023.docx apegado).

Thyroid GuidePx®: Descrição do ensaio O teste Thyroid GuidePx® é um ensaio baseado no sequenciamento de RNA de enriquecimento de captura híbrida direcionado (RNA-Seq). A entrada do teste é RNA isolado de tecido fixado em formalina e embebido em parafina (FFPE) ou amostras de câncer papilar de tireoide de biópsia por agulha fina (FNB). A preparação da biblioteca envolve a amplificação específica das regiões-alvo de cada um dos genes no painel Thyroid GuidePx®. O painel consiste em 82 genes. As bibliotecas de amostras resultantes são transferidas para um cartucho de reagentes MiSeq/MiSeqDx que contém todos os reagentes para sequenciamento. O software Real-Time Analysis (RTA), que é um componente do sequenciador MiSeq/MiSeqDx, fornece chamadas de base e índices de qualidade associados durante a execução do sequenciamento. São gerados arquivos FASTQ que contêm as informações de sequenciamento e qualidade. O arquivo FASTQ é um formato de arquivo baseado em texto amplamente utilizado para armazenar sequência de nucleotídeos para cada amplicon e seu índice de qualidade correspondente. Os arquivos FASTQ servem como entrada para algoritmos de alinhamento de sequências. As leituras alinhadas são gravadas em arquivos no formato BAM que são posteriormente convertidos em contagens de leitura e valores de expressão. Os níveis de expressão gênica são então submetidos ao algoritmo para classificar as categorias de risco.

O software classifica o risco com base no padrão de expressão de grupos de genes no painel de 82 genes Thyroid GuidePx®. Três classes moleculares foram definidas com base em um estudo com 502 amostras de pacientes associando o padrão de expressão gênica à sobrevida livre de recorrência em 5 anos. Um grupo de alto risco enriquecido com mutações BRAFV600E; e dois subgrupos moleculares de menor risco foram identificados.

Utilidade Clínica

O prognóstico mais preciso fornecido pelo Thyroid GuidePx® pode afetar as decisões de tratamento dos médicos. A seguir estão exemplos de como os médicos podem aplicar as novas informações derivadas do Thyroid GuidePx®:

1. O PTC de baixo risco poderia potencialmente ser tratado com uma tireoidectomia parcial (por exemplo, lobectomia) ou mesmo vigilância ativa, em vez de uma tireoidectomia total. Isso traz dois benefícios principais, além da economia de tempo e custos. Primeiro, há uma redução na necessidade potencial de reposição vitalícia do hormônio tireoidiano após uma lobectomia. Em segundo lugar, não há praticamente nenhum risco de complicações potencialmente devastadoras de uma tireoidectomia total, como lesão bilateral do nervo laríngeo recorrente ou hipoparatireoidismo permanente.
2. A identificação precisa de PTC de baixo risco também aumentaria a adequação do iodo radioativo adjuvante (RAI). A terapia com RAI pode resultar em efeitos colaterais transitórios e de longo prazo, como disfunção das glândulas salivares, disfunção ovariana e testicular e supressão da medula óssea. A terapia com RAI também apresenta um risco teórico de malignidade secundária: uma estimativa é que 100mCi de 131I induzem 56 malignidades por 10.000 pacientes tratados (15). Limitar a terapia com radioiodoterapia aos pacientes que obteriam melhora na sobrevida global ou livre de doença também é custo-efetivo.
3. A vigilância do PTC pode colocar pressão sobre os pacientes e as organizações de saúde por dois motivos: o PTC é mais comumente diagnosticado na meia-idade e os pacientes geralmente sobrevivem por longos períodos após o diagnóstico. Isto significa que exames e investigações regulares para a detecção precoce de recorrência podem durar muitos anos. O acompanhamento geralmente envolve exame físico anual, dosagem sérica do hormônio estimulador da tireoide e da tireoglobulina e ultrassonografia cervical periódica. Pacientes de baixo risco podem ter intervalos maiores entre exames e investigações de acompanhamento e podem potencialmente receber alta da vigilância.
4. Identificar com precisão os pacientes com alto risco de recorrência também é importante. O Sistema de Estratificação de Risco ATA é conhecido por ser impreciso na previsão de recorrência. Em pacientes classificados como “baixo risco” pelo Sistema de Estratificação de Risco ATA 2015, 16% dos pacientes eventualmente desenvolvem doença recorrente (16). Esses pacientes podem ser subtratados como resultado desta classificação de risco. Em pacientes onde está disponível uma classificação mais precisa de alto risco, tratamentos mais agressivos (ou seja, tireoidectomia total e radioiodoterapia) ou inscrição em ensaios clínicos podem ser considerados.

Thyroid GuidePx® por biópsia por agulha fina Nossos estudos até agora foram feitos usando amostras cirúrgicas, e um ensaio disponível comercialmente foi produzido neste formato. No entanto, um estudo recente do Institute of Health Economics determinou que o aumento da relação custo-eficácia do Thyroid GuidePx® seria alcançado através da realização do teste antes da cirurgia. A implementação de um teste pré-operatório exigiria que o teste tivesse um bom desempenho usando amostras derivadas de uma biópsia por agulha fina (FNB).

Os FNBs da tireoide são rotineiramente armazenados em CytoLyt, um conservante líquido tamponado à base de metanol, por até 7 dias antes da transferência das células para um ThinPrep para avaliação citológica. Nós e outros (17-21) determinamos anteriormente que DNA e RNA de qualidade podem ser derivados de células no CytoLyt. Nosso recente estudo de viabilidade composto por 12 pacientes com PTC demonstrou que a realização do ensaio Thyroid GuidePx® em BNFs é viável. Até agora, a taxa de sucesso técnico foi de 100% e a concordância do nível genético com amostras cirúrgicas excede 0,9. No entanto, a dependência de um FNB limitado para a caracterização molecular da doença implica que a amostra é representativa da totalidade do tumor. A heterogeneidade genômica e transcriptômica foi descrita em tumores primários e metástases (23). Portanto, será importante documentar a concordância entre as amostras adquiridas pelo FNB e as amostras cirúrgicas.

OBJETIVOS E PROPÓSITO DO TESTE O objetivo geral do estudo é determinar se a amostra mais limitada de uma biópsia com agulha fina é suficientemente representativa do tumor maior para determinar uma classificação molecular válida usando o teste Thyroid GuidePx®.

Objetivo Primário 1. Para determinar a concordância entre as classificações moleculares do Thyroid GuidePx® adquiridas de PAAFs e amostras cirúrgicas correspondentes.

Objetivos Secundários

1. Comparar a taxa de sucesso técnico no preenchimento de um Thyroid GuidePx® válido usando PAAF e amostras cirúrgicas.
2. Comparar os resultados de recorrência usando o sistema de estratificação de risco ATA versus pacientes classificados pelo Thyroid GuidePx® usando amostras cirúrgicas.
3. Comparar os resultados de recorrência usando o sistema de estratificação de risco ATA versus pacientes classificados pelo Thyroid GuidePx® usando amostras de PAAF.

PROJETO DE TESTE Esquema de teste (consulte Protocol_Calgary_11 de julho de 2023.docx apegado)

Aquisição e análise de amostras Os pacientes serão convidados a participar se tiverem diagnóstico tecidual pré-operatório de PTC (Bethesda VI) ou suspeita de PTC (Bethesda V), e forem elegíveis para tireoidectomia parcial ou total, conforme descrito nos critérios de inclusão e exclusão . Após o consentimento, os pacientes serão submetidos à cirurgia conforme planejado pelo cirurgião. Dados demográficos, clínicos e patológicos serão adquiridos de todos os participantes.

Durante a cirurgia, quando a glândula tireoide e o tumor estiverem expostos, o cirurgião realizará um BNF do tumor dominante (ou seja: a lesão identificada no pré-operatório), sob visão direta. Isto simula mais de perto as condições in vivo de um BNF pré-operatório, mas limita potenciais falhas técnicas de uma biópsia percutânea (por exemplo: direcionamento inadequado da lesão). O material celular derivado do FNB será imediatamente colocado no meio de transporte (CytoLyt) e depois refrigerado. As amostras serão enviadas semanalmente ao laboratório central para isolamento de RNA e RNASeq. Ao mesmo tempo, as amostras de FNB serão examinadas quanto à presença de células tumorais por um citopatologista treinado.

Se houver mais de um nódulo, o nódulo FNB será marcado pelo cirurgião para o patologista. Sob a orientação de um patologista colaborador, um pedaço do tumor será removido e congelado, e um pedaço adjacente será levado para fixação em formalina e inclusão em parafina (FFPE). Uma lâmina H&E da amostra FFPE será corada para H&E, e 3 - 6 seções não coradas serão preparadas e depois enviadas ao laboratório central para microdissecção, isolamento de RNA e RNASeq. Este processo seguirá os protocolos de processamento de amostras de rotina e não interferirá nos métodos padrão de diagnóstico patológico.

Se os pacientes tiverem assinado o formulário de consentimento informado opcional para biobanco, se houver amostra congelada restante suficiente, a amostra será retida para fins de novo teste (se necessário) ou para apoiar estudos adicionais, como análise do transcriptoma completo e análise mutacional. A utilização destas amostras para estes fins exigiria aprovações éticas adicionais.

Um estudo de viabilidade composto por 12 pacientes já foi concluído. A taxa de sucesso técnico na aquisição de amostras e realização do ensaio foi de 100%, a quantidade e a qualidade do RNA foram excelentes em FNBs e houve excelente concordância de nível genético em ensaios realizados em FNBs e amostras cirúrgicas.

O RNASeq para Thyroid GuidePx® será realizado no OncoHelix, um laboratório clínico com experiência em oncologia de precisão localizado na Cumming School of Medicine, University of Calgary. Se o teste não puder ser feito em tempo hábil na OncoHelix, as amostras serão testadas no Protean BioDiagnostics, um laboratório certificado CAP/CLIA em Orlando, Flórida, que atualmente realiza o teste comercialmente. As classes de risco serão atribuídas por software desenvolvido pela Qualisure Diagnostics utilizando os dados gerados pelo RNASeq.

Pontos finais

Ponto final primário:

1. Concordância, classificação de risco molecular de FNBs de câncer papilar de tireoide e amostras cirúrgicas congeladas correspondentes

Pontos finais secundários:

1. Taxa de sucesso técnico no preenchimento de um Thyroid GuidePx® válido usando FNBs
2. Taxa de sucesso técnico no preenchimento de um Thyroid GuidePx® válido em amostras cirúrgicas FFPE.
3. Taxa de recorrência bioquímica em 5 anos (tireoglobulina ≥ 1 ng/mL, apenas para pacientes submetidos à tireoidectomia total)
4. Taxa de recorrência estrutural em 5 anos

5. Desempenho do teste como teste prognóstico, Thyroid GuidePx®: FNB e amostras cirúrgicas

   1. Especificidade: proporção de pacientes sem recorrência estrutural prevista pelo teste
   2. Sensibilidade: a capacidade do teste de identificar indivíduos cuja doença irá recorrer dentro de 5 anos (proporção de recorrências estruturais previstas)
   3. AUROC
   4. Valor preditivo positivo
   5. Valor preditivo negativo

6. Desempenho, estratificação de risco ATA

   1. Especificidade: proporção de pacientes sem recorrência estrutural prevista pelo teste
   2. Sensibilidade: a capacidade do teste de identificar indivíduos cuja doença irá recorrer dentro de 5 anos (proporção de recorrências estruturais previstas)
   3. AUROC
   4. Valor preditivo positivo
   5. Valor preditivo negativo

Cegamento e limitação de viés Somente amostras com qualidade de RNA suficiente (DV200>30) serão incluídas na análise. Apenas FNBs contendo células tumorais ("citologia positiva") serão incluídos no cálculo de concordância. O RNASeq será realizado por um técnico que não conhece quaisquer detalhes clínicos. O técnico não será especificamente capaz de identificar amostras correspondentes de espécimes cirúrgicos e FNBs. A classificação molecular será realizada de forma cega. Os dados serão monitorados por um Comitê de Monitoramento de Dados independente. O Comité de Monitorização de Dados, composto por pelo menos três indivíduos, incluindo um estatístico, irá monitorizar a análise dos dados.

Regras de parada Em nossas amostras cirúrgicas, as repetições entre lotes e intralote tiveram consistentemente uma concordância de nível genético> 0,9. A concordância de nível genético entre FNB positivo para citologia e amostras cirúrgicas congeladas (o "padrão ouro") será monitorada para cada lote de 24 pacientes. Se R<0,9, faremos uma pausa para reavaliar o fluxo de trabalho analítico e a instrumentação. Se a concordância for persistentemente inferior a 0,9 após 72 pacientes, deixaremos de avaliar os BNFs, mas continuaremos a testar amostras cirúrgicas. Como este não é um estudo de alto risco, não pretendemos encerrar o estudo prematuramente. Mesmo que haja baixa concordância entre o FNB e as amostras cirúrgicas, os dados derivados do estudo dos resultados em relação à classificação molecular (em amostras cirúrgicas) serão úteis.

SELEÇÃO E RETIRADA DE ASSUNTOS Critérios de Inclusão

1. Idade ≥ 18 anos
2. Um diagnóstico de câncer papilar de tireoide com base em uma biópsia por agulha fina (FNB) interpretada como citologia Bethesda V ou VI
3. Tamanho do tumor > 1 cm de diâmetro máximo
4. O paciente é um candidato operativo
5. O paciente forneceu consentimento

Critério de exclusão

1. História familiar de câncer de tireoide
2. História de radiação no pescoço
3. Incapaz ou sem vontade de fazer uma biópsia com agulha fina
4. Não quer se submeter à tireoidectomia
5. A patologia final não demonstra câncer papilar de tireoide
6. Casos em que não há nódulo dominante claro
7. Casos em que existem múltiplos nódulos que impedem a amostragem de um nódulo definido

Critérios de retirada do sujeito Os sujeitos podem interromper a participação a qualquer momento, notificando um dos investigadores ou a equipe de pesquisa. Os dados adquiridos antes da retirada serão utilizados para análise, mas nenhum dado adicional será coletado após a retirada. A pedido do sujeito, as amostras podem ser retiradas antes do teste. Os indivíduos serão substituídos se as amostras não tiverem sido testadas por RNASeq (Thyroid GuidePx®).

TRATAMENTO DE SUJEITOS A classificação molecular e o risco de recorrência determinado pelo Thyroid GuidePx® serão divulgados ao médico e ao paciente. O risco de recorrência baseia-se em dados de validação cumulativos, incluindo casos de Alberta e da Austrália. Somente serão divulgados os resultados da amostra cirúrgica congelada (o “padrão ouro”). Como é habitual, as decisões de tratamento serão tomadas pelo médico em colaboração com o paciente, com base numa síntese de toda a informação clínica disponível. Este ensaio clínico não define uma via de tratamento. A frequência e duração do acompanhamento não serão prescritas pelo protocolo e serão determinadas pelo médico assistente. Este é um estudo não intervencionista e, portanto, a conformidade não será monitorada.

AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA Um resultado secundário é o desempenho do teste para estratificar o risco de recorrência. O desempenho do teste será comparado em amostras adquiridas pelo FNB e em amostras cirúrgicas, depois comparadas com o padrão atual de atendimento (o sistema de estratificação de risco ATA). O tempo até a recorrência será medido a partir do momento do tratamento inicial completo. Em pacientes com doença microscópica remanescente após a cirurgia, o tempo até a recorrência será medido a partir do término da dose terapêutica de iodo radioativo. Os eventos de recorrência serão definidos com base nas diretrizes da American Thyroid Association de 2016.

Os seguintes critérios significarão um estado livre de doença após a terapia: (i) nenhuma evidência clínica de tumor; (ii) nenhuma evidência de tumor na imagem com iodo radioativo e/ou ultrassonografia cervical; (iii) para tireoidectomia pós-total, tireoglobulina sérica (Tg) não estimulada <0,2 ng/ml; para pós-lobectomia, Tg não estimulado<30. Uma resposta indeterminada à terapia será definida como: (i) nenhuma evidência clínica de tumor; (ii) nenhuma evidência de tumor na imagem com iodo radioativo e/ou ultrassonografia cervical; (iii) para tireoidectomia pós-total, Tg não estimulada 0,2 - 1; para pós-lobectomia, Tg>30. Após uma tireoidectomia total, uma resposta bioquímica incompleta é definida como Tg>1 na ausência de doença estrutural. Os valores de Tg só são confiáveis ​​na ausência de anticorpos interferentes (TgAb) (6).

A doença será definida como uma verdadeira recorrência se um paciente já tivesse uma Tg indetectável na ausência de TgAb e um exame de ultrassonografia cervical negativo dentro de 1 ano após a operação anterior. A doença persistente será definida como Tg maior que os limites acima, ultrassonografia cervical anormal, níveis persistentemente aumentados de TgAb ou presença de metástases à distância.

Pacientes com doença persistente e/ou doença metastática (ressecção não curativa) não serão incluídos no cálculo da sobrevida livre de recorrência.

AVALIAÇÃO DA SEGURANÇA O único desvio do cuidado clínico padrão é a coleta intraoperatória de amostra pelo FNB. Porém, em comparação com o procedimento cirúrgico planejado, esse risco é pequeno. O principal risco é um pequeno risco de sangramento clinicamente significativo, estimado em <1%. Como não haverá qualquer intervenção associada a este estudo, não há plano de monitoramento de eventos adversos.

ESTATÍSTICAS Otimização das condições de RNASeq para amostras no CytoLyt O RNA será isolado de FNBs no CytoLyt de acordo com o SOP. A quantidade de RNA será avaliada pelo NanoDrop e a qualidade será quantificada pelo DV200. O RNASeq será realizado em amostras CytoLyt e amostras congeladas correspondentes em diferentes profundidades de leitura. Em tecidos CytoLyt e FFPE emparelhados, as métricas do ensaio serão avaliadas em função do método de armazenamento do tecido de entrada, qualidade do RNA (DV200) e tempo de armazenamento. A expressão gênica será comparada em CytoLyt pareado e tecidos congelados, e então correlacionada entre as condições. O resultado mais importante, atribuição de classe molecular, será comparado em amostras pareadas.

As seguintes métricas de desempenho serão avaliadas para cada experimento, com base na lista de verificação de requisitos específicos do College of American Pathologists (CAP) para o sequenciamento de próxima geração:

Métricas de ensaio

a) Métricas de RNASeq: (i) Contagens de leituras (leituras totais, leituras únicas, leituras duplicadas, leituras de rRNA, especificidade de cadeia); (ii) Cobertura (número de leituras que cobrem uma determinada posição genômica): cobertura média, coeficiente médio de variação, cobertura 5'/3', lacunas na cobertura, viés de GC (iii) Correlação de expressão (níveis de expressão medidos vs. níveis conhecidos dos padrões internos do ERCC) b) Detecção individual de genes: (i) Sensibilidade analítica: fração de casos em que cada gene do padrão interno do ERCC é corretamente identificado.

(ii) Especificidade analítica: capacidade de identificar a ausência dos genes que compõem o padrão interno ERCC (iii) Precisão: sensibilidade + especificidade

Comparação da estratificação de risco molecular (Thyroid GuidePx®) determinada em amostras FNB e em amostras cirúrgicas Pacientes com patologia final que não demonstra câncer papilar de tireoide serão excluídos da análise de concordância. Da mesma forma, as amostras de FNB com citologia negativa serão excluídas da análise de concordância. A atribuição de classe molecular será comparada entre amostras obtidas pelo FNB e espécimes cirúrgicos congelados correspondentes. As amostras cirúrgicas serão consideradas padrão ouro. A estatística kappa será usada para determinar a significância da concordância entre os dois tipos de amostra.

Os estratos de risco serão atribuídos de forma cega usando Thyroid GuidePx® e o ATA Risk Stratification System. As taxas de recorrência estrutural e bioquímica em 5 anos serão comparadas para cada classe de risco. Um resultado de teste binário, condicionado ao estado da doença (recorrência estrutural), será usado para avaliar a precisão do teste. A recorrência estrutural representa o padrão ouro. Um teste de McNemar bilateral para duas proporções dependentes será usado para avaliar a sensibilidade e especificidade de cada método de estratificação de risco, com ajuste de Holm para multiplicidade para avaliar cada medida de precisão separadamente.

Desempenho do Thyroid GuidePx®

A partir dos estudos descritos acima, o desempenho do Thyroid GuidePx® será avaliado separadamente em amostras de FNB e amostras cirúrgicas. As características de desempenho serão avaliadas da seguinte forma:

1. AUROC dependente do tempo (área sob a curva do operador do receptor) (24). Para efeitos dos cálculos, o nível limite para um teste positivo é uma designação de risco intermédio ou alto (uma vez que se prevê que uma atribuição de risco intermédio resultaria em decisões clínicas significativamente diferentes).
2. Sensibilidade: calculada como sensibilidade cumulativa em 5 anos, conforme descrito por Kamarudin e Kolamunnage-Dona (24)
3. Especificidade: calculada como especificidade dinâmica, conforme descrito por Kamarudin e Kolamunnage-Dona (24)

Cálculo do tamanho da amostra Compararemos a atribuição de risco molecular de espécimes cirúrgicos e FNBs correspondentes de 109 pacientes. Um nível mínimo de concordância clinicamente aceitável é de 80%. Os cálculos do tamanho da amostra foram baseados na estatística Kappa de Lin para concordância entre as duas medidas para três subgrupos moleculares (25). Foi aplicada uma hipótese bilateral com nível de significância de 0,05 e o poder foi fixado em 90%. Os tamanhos dos subgrupos moleculares foram fixados em 23% (Tipo 1), 49% (Tipo 2) e 28% (Tipo 3). Se a hipótese nula for de que o nível de concordância entre o BNF e as amostras cirúrgicas é de 0,6, então seríamos capazes de detectar um nível de concordância de 0,8 ou superior com 109 pacientes. Uma concordância de 0,90 seria detectável com 40 pacientes assumindo o mesmo nível nulo de concordância.

Cerca de 25% dos pacientes com citologia Bethesda V e cerca de 5% dos pacientes com citologia Bethesda VI terão doença benigna. Além disso, em aproximadamente 5% dos casos, a qualidade do RNASeq é insuficiente nas amostras FFPE. Com base nisso, planejamos uma taxa de evasão de 20%. Portanto, o estudo foi projetado para incluir 130 pacientes.

ACESSO DIRETO A DADOS/DOCUMENTOS DE FONTE O local do ensaio clínico permitirá monitoramento, auditorias, revisão de REB e inspeções regulatórias relacionadas ao ensaio, fornecendo acesso direto aos dados/documentos de origem.

As auditorias de ensaios clínicos são realizadas para garantir que os direitos, a segurança e o bem-estar dos pacientes estão devidamente protegidos, para avaliar a conformidade com o protocolo, processos e acordos, os padrões de Boas Práticas Clínicas da ICH e os requisitos regulamentares aplicáveis, e para avaliar a qualidade dos dados.

Qualquer agência reguladora nacional pode vir a qualquer momento auditar ou inspecionar o local do estudo. Esta auditoria consiste em entrevistas com o investigador principal e a equipe de estudo, revisão de documentação e práticas, revisão de instalações, equipamentos e verificação de dados de origem.

O investigador concederá a qualquer agência reguladora nacional acesso direto à documentação em papel e/ou eletrônica relativa ao estudo clínico (por exemplo, CRFs, documentos de origem, como prontuários de pacientes hospitalares e arquivos de estudo do investigador). Todas as instalações do local relacionadas com a realização do estudo poderiam ser visitadas durante uma auditoria (por exemplo, laboratório, ambulatório). O investigador concorda em cooperar e fornecer assistência em horários e locais razoáveis ​​com relação a qualquer atividade de auditoria.

CONTROLE DE QUALIDADE E GARANTIA DE QUALIDADE O investigador principal garantirá que todos os membros do estudo estejam seguindo o protocolo e cumprindo os padrões regulatórios e de boas práticas clínicas. Todos os locais de ensaios clínicos permitirão monitoramento, auditorias, revisão de REB e inspeções regulatórias relacionadas ao ensaio, fornecendo acesso direto aos dados/documentos de origem.

O Comitê de Monitoramento de Dados (DMC) se reunirá durante a condução do ensaio da seguinte forma: 1. Após o início do ensaio para finalizar o Estatuto do DMC; 2. Após a inscrição de 24 participantes; 3. Após a inscrição de 72 participantes; e 4. após conclusão da matrícula.

ÉTICA O investigador responsável garantirá que este estudo seja conduzido de acordo com a Declaração de Helsinque. Este estudo será conduzido de acordo com os padrões canadenses e internacionais de Boas Práticas Clínicas para todos os estudos, incluindo a Diretriz Tripartite Harmonizada da ICH sobre Boas Práticas Clínicas. Os regulamentos governamentais aplicáveis, as diretrizes de ensaios clínicos do NNHPD e as políticas e procedimentos de pesquisa dos Serviços de Saúde de Alberta também serão seguidos.

Este protocolo e quaisquer alterações serão submetidos ao HREBA-CC para aprovação formal para condução do estudo. A decisão do HREBA-CC relativa à condução do estudo será feita por escrito ao investigador.

A divulgação da classificação de risco molecular de amostras cirúrgicas (o "padrão ouro") é justificável, uma vez que existem dados substanciais de resultados de amostras cirúrgicas. Além disso, quando este ensaio for lançado, o teste estará disponível comercialmente como Teste Desenvolvido em Laboratório (LDT).

MANUSEIO DE DADOS E MANUTENÇÃO DE REGISTROS Assim que o estudo for concluído, todos os dados deste estudo serão retidos por 15 anos, armazenados de acordo com o protocolo do Calgary Center for Clinical Research.

FINANCIAMENTO E SEGURO O estudo será financiado pela Qualisure Diagnostics, Inc., complementado por doações revisadas por pares. O seguro será fornecido pelos Serviços de Saúde da Universidade de Calgary e Alberta, bem como pela Qualisure Diagnostics.

POLÍTICA DE PUBLICAÇÃO Os resultados deste estudo clínico serão publicados em um periódico revisado por pares com todos os investigadores nomeados como coautores. Todas as fontes de financiamento serão reconhecidas.

6.0 Descreva procedimentos, tratamentos ou atividades que estejam acima ou além das práticas padrão: .

O único desvio do atendimento clínico padrão é a coleta intraoperatória de amostra pelo FNB. Porém, em comparação com o procedimento cirúrgico planejado, esse risco é pequeno. O principal risco é um pequeno risco de sangramento clinicamente significativo, estimado em <1%. Como não haverá qualquer intervenção associada a este estudo, não há plano de monitoramento de eventos adversos.

Durante a cirurgia, quando a glândula tireoide e o tumor estiverem expostos, o cirurgião realizará um BNF do tumor dominante (ou seja: a lesão identificada no pré-operatório), sob visão direta. Isto simula mais de perto as condições in vivo de um BNF pré-operatório, mas limita potenciais falhas técnicas de uma biópsia percutânea (por exemplo: direcionamento inadequado da lesão).

Sob a orientação de um patologista colaborador, um pedaço do tumor será removido e congelado, e um pedaço adjacente será levado para fixação em formalina e inclusão em parafina. O tecido será liberado para pesquisa apenas quando for coletado tecido suficiente para uso diagnóstico e clínico.