Zgodność klasyfikacji molekularnej na podstawie biopsji cienkoigłowej (FNB) i próbek chirurgicznych

WSTĘP Rak tarczycy jest ósmym nowotworem pod względem częstości występowania, a od 1992 r. zapadalność na niego wzrasta o >6% rocznie. Rak brodawkowaty tarczycy (PTC) jest przyczyną większości nowotworów tarczycy, a rosnącą częstość występowania raka tarczycy można prawie całkowicie przypisać zwiększonej wykrywalności małych PTC (1). PTC ma zwykle korzystne rokowanie i wysoki odsetek wyleczeń. Jednakże około 10-15% PTC wykazuje bardziej agresywne zachowanie i często jest opornych na konwencjonalne terapie uzupełniające, takie jak radioaktywny jod (2,3). Biorąc pod uwagę rosnącą liczbę przypadków PTC (i potencjalne obciążenie kosztów opieki zdrowotnej), dokładne prognozowanie staje się coraz ważniejsze. Dokładne oszacowanie rokowania i ryzyka nawrotu pozwoli uniknąć niepotrzebnie rozległych operacji, badań i kontroli u osób z dobrym rokowaniem oraz umożliwi skierowanie bardziej rozległych operacji, terapii uzupełniających i długotrwałych obserwacji do tych, którzy tego potrzebują.

System stratyfikacji ryzyka Amerykańskiego Towarzystwa Tarczycowego (ATA) Decyzje dotyczące leczenia są podejmowane na podstawie Systemu Stratyfikacji Ryzyka Amerykańskiego Towarzystwa Tarczycowego (ATA), który szacuje ryzyko nawrotu choroby na podstawie czynników klinicznych i patologicznych. Chociaż system ten został retrospektywnie zweryfikowany w szeregu badań, proporcja wyjaśnionej wariancji jest suboptymalna i waha się w granicach 19–34% (4, 5). Niezdolność systemu ATA do pełnego przewidywania nawrotu może być związana z niepowodzeniem tego systemu w odpowiedniej integracji ryzyka związanego z profilem molekularnym nowotworu. Tylko jeden marker molekularny, BRAFV600E, jest obecnie włączony do systemu stratyfikacji ryzyka ATA. Kolejnym ograniczeniem Systemu Stratyfikacji Ryzyka ATA jest to, że można go w pełni wdrożyć dopiero po operacji, gdy dostępne są wszystkie dane kliniczne i patologiczne wymagane do oszacowania ryzyka. W tym czasie zostały już podjęte istotne decyzje dotyczące leczenia i pacjent zdał sobie sprawę ze skutków operacji.

Oszacowanie ryzyka przed leczeniem: aktualny standard opieki W 2015 r. ATA przedstawiło kryteria, które można zastosować przy selekcji pacjentów do bardziej zachowawczych operacji, takich jak lobektomia tarczycy. Zgodnie z wytycznymi ATA 2015, za niskiego ryzyka uważa się pacjentów, którzy spełniają następujące kryteria przedoperacyjne: wielkość guza 1–4 cm, klinicznie brak węzłów chłonnych, brak rozsiewu pozatarczycowego, brak raka tarczycy w rodzinie oraz radioterapia szyi ( 6). U tych pacjentów można początkowo zastosować lobektomię tarczycy (w przeciwieństwie do całkowitej tyreoidektomii). Jednakże 40–60% przypadków będzie wymagało całkowitej resekcji tarczycy, ponieważ stratyfikacja ryzyka pooperacyjnego (na podstawie wszystkich informacji klinicznych i patologicznych dostępnych po operacji) sklasyfikowała je jako grupy ryzyka wyższego niż początkowo szacowano (7-11). W niedawnym badaniu 51% pacjentów wymagało konwersji do całkowitej tyreoidektomii, ponieważ rozpoznano dodatkowe czynniki ryzyka podczas operacji lub po uzyskaniu ostatecznej patologii (12). Wskazuje to na ograniczenia klinicznej oceny ryzyka przedoperacyjnego i potrzebę udoskonalenia metody szacowania ryzyka przedoperacyjnego. Dlatego też chirurdzy i pacjenci zajmujący się rakiem tarczycy odnieśliby korzyść z dodatkowych informacji, które ułatwiłyby podjęcie decyzji o wykonaniu lobektomii u odpowiednich pacjentów, minimalizując jednocześnie potrzebę wykonania tyreoidektomii.

Thyroid GuidePx®: nowy system stratyfikacji ryzyka molekularnego Niedociągnięcia systemu stratyfikacji ryzyka ATA umożliwiającego wiarygodne określanie rokowania zostały usunięte przy użyciu nowego systemu stratyfikacji ryzyka molekularnego, który obejmuje sygnaturę genową Thyroid GuidePx®. Za pomocą algorytmu oprogramowania komputerowego zidentyfikowano transkrypty (mRNA) związane z nawrotem i transkrypty związane z brakiem nawrotu w grupie szkoleniowej 335 pacjentów z PTC, a następnie zweryfikowano w grupie walidacyjnej obejmującej 167 pacjentów. Guzy uwzględnione w zbiorze danych były świeżo mrożone.

Na podstawie wzoru ekspresji genów prognostycznych zidentyfikowano trzy podtypy molekularne. Nazywano je typem 1, typem 2 i typem 3. PTC typu 3 charakteryzowały się najbardziej agresywną biologią i najwyższym wskaźnikiem nawrotów. Następnie przeprowadzono walidację u 124 pacjentów z PTC z Korei i 167 pacjentów z Edmonton.

Podtypy molekularne rozważano w kontekście stadium nowotworu. W szczególności guzy o średnicy 1–4 cm przy braku choroby węzłów chłonnych (do których zaliczają się pacjenci, którzy byliby potencjalnymi kandydatami do lobektomii tarczycy) analizowano oddzielnie od pacjentów z bardziej zaawansowaną chorobą. Co ciekawe, PTC typu 3 charakteryzowały się wysokim wskaźnikiem nawrotów, niezależnie od stadium nowotworu. U kandydatów do lobektomii z PTC typu 1 i 2 odsetek nawrotów wynosił <3% (ryc. 1A, B, patrz Protocol_Calgary_11 lipca 2023.docx przyłączony).

Wydajność testu Test oparty na NGS, który zidentyfikował podtyp molekularny PTC, nazwano Thyroid GuidePx®. Połączoną molekularną i kliniczną podklasyfikację PTC przy użyciu Thyroid GuidePx® porównano z systemem stratyfikacji ryzyka ATA. Grupy stratyfikacji ryzyka ATA zostały określone dla każdego przypadku przez dwóch praktykujących klinicystów. Do obliczenia zależnego od czasu obszaru pod krzywą charakterystyki pracy odbiornika (AUROC) zastosowano klasyfikację binarną: ryzyko niskie w porównaniu do ryzyka średniego/wysokiego. AUROC obliczono na podstawie wyników nawrotów z kohorty odkrywającej TCGA i kohorty z Edmonton. Najlepszą skuteczność stratyfikacji ryzyka uzyskano za pomocą testu Thyroid GuidePx® w połączeniu z cechami klinicznymi (tj. wielkością guza i zajęciem węzłów chłonnych). Korzystając z pakietu smoothROCtime, 5-letni AUROC wyniósł 0,80 dla Thyroid GuidePx®, biorąc pod uwagę wielkość guza i stan węzłów chłonnych, oraz 0,51 dla systemu stratyfikacji ryzyka ATA (Rysunek 2, patrz Protocol_Calgary_11 lipca 2023.docx przyłączony).

Thyroid GuidePx®: Opis testu Test Thyroid GuidePx® jest testem opartym na sekwencjonowaniu RNA ze wzbogaconym wychwytem hybrydowym (RNA-Seq). Danem wejściowym testu jest RNA wyizolowany z próbek tkanki raka brodawkowatego tarczycy utrwalonej w formalinie i zatopionej w parafinie (FFPE) lub biopsji cienkoigłowej (FNB). Przygotowanie biblioteki obejmuje specyficzną amplifikację docelowych regionów każdego z genów w panelu Thyroid GuidePx®. Panel składa się z 82 genów. Powstałe biblioteki próbek przenosi się do kasety z odczynnikami MiSeq/MiSeqDx, która zawiera wszystkie odczynniki do sekwencjonowania. Oprogramowanie do analizy w czasie rzeczywistym (RTA), które jest składnikiem sekwencera MiSeq/MiSeqDx, zapewnia wywołania podstawowe i powiązane wyniki jakości podczas przebiegu sekwencjonowania. Generowane są pliki FASTQ zawierające informacje o kolejności i jakości. Plik FASTQ jest szeroko stosowanym formatem pliku tekstowego do przechowywania sekwencji nukleotydowej dla każdego amplikonu i odpowiadającego mu wyniku jakości. Pliki FASTQ służą jako dane wejściowe dla algorytmów dopasowywania sekwencji. Wyrównane odczyty są zapisywane w plikach w formacie BAM, które następnie są konwertowane na liczniki odczytów i wartości wyrażeń. Poziomy ekspresji genów są następnie przesyłane do algorytmu w celu klasyfikacji kategorii ryzyka.

Oprogramowanie klasyfikuje ryzyko w oparciu o wzór ekspresji grup genów w panelu Thyroid GuidePx® składającym się z 82 genów. Na podstawie badania przeprowadzonego na 502 próbkach pacjentów zdefiniowano trzy klasy molekularne, wiążące wzór ekspresji genów z przeżyciem wolnym od nawrotów po 5 latach. Grupa wysokiego ryzyka wzbogacona o mutacje BRAFV600E; i zidentyfikowano dwie podgrupy molekularne o niższym ryzyku.

Użyteczność kliniczna

Dokładniejsze prognozy zapewniane przez Thyroid GuidePx® mogą mieć wpływ na decyzje terapeutyczne podejmowane przez lekarzy. Poniżej znajdują się przykłady tego, jak lekarze mogą zastosować nowe informacje uzyskane z Thyroid GuidePx®:

1. PTC niskiego ryzyka można potencjalnie leczyć raczej częściową tyreoidektomią (np. lobektomią) lub nawet aktywnym nadzorem, niż całkowitą tyreoidektomią. Oprócz oszczędności czasu i kosztów ma to dwie główne zalety. Po pierwsze, po lobektomii zmniejsza się potencjalna potrzeba dożywotniej wymiany hormonu tarczycy. Po drugie, praktycznie nie ma ryzyka potencjalnie wyniszczających powikłań całkowitej tyreoidektomii, takich jak obustronne uszkodzenie nerwu krtaniowego nawrotowego lub trwała niedoczynność przytarczyc.
2. Dokładna identyfikacja PTC niskiego ryzyka zwiększyłaby również stosowność adiuwanta radioaktywnego jodu (RAI). Terapia RAI może powodować zarówno przejściowe, jak i długotrwałe skutki uboczne, takie jak dysfunkcja gruczołów ślinowych, dysfunkcja jajników i jąder oraz supresja szpiku kostnego. Terapia RAI wiąże się również z teoretycznym ryzykiem wtórnego nowotworu złośliwego: według szacunków 100 mCi 131I wywołuje 56 nowotworów złośliwych na 10 000 leczonych pacjentów (15). Ograniczenie terapii RAI do tych pacjentów, u których można uzyskać poprawę w zakresie przeżycia całkowitego lub przeżycia wolnego od choroby, jest również opłacalne.
3. Nadzór nad PTC może stanowić obciążenie dla pacjentów i organizacji opieki zdrowotnej z dwóch powodów: PTC jest najczęściej diagnozowana w średnim wieku, a pacjenci często przeżywają przez długi czas od postawienia diagnozy. Oznacza to, że regularne badania i badania mające na celu wczesne wykrycie nawrotu choroby mogą trwać wiele lat. Kontrola zazwyczaj obejmuje coroczne badanie fizykalne, oznaczenie w surowicy hormonu tyreotropowego i tyreoglobuliny oraz okresowe badanie USG szyi. W przypadku pacjentów niskiego ryzyka odstępy między badaniami kontrolnymi i badaniami mogą być wydłużone i mogą potencjalnie zostać wypisani z nadzoru.
4. Ważna jest również dokładna identyfikacja pacjentów z wysokim ryzykiem nawrotu. Wiadomo, że system stratyfikacji ryzyka ATA jest niedokładny w przewidywaniu nawrotu. U pacjentów sklasyfikowanych jako pacjenci „niskiego ryzyka” według Systemu Stratyfikacji Ryzyka ATA 2015 u 16% pacjentów ostatecznie rozwija się nawrót choroby (16). W wyniku tej klasyfikacji ryzyka pacjenci ci mogą być niedostatecznie leczeni. U pacjentów, u których możliwe jest dokładniejsze określenie grupy wysokiego ryzyka, można rozważyć bardziej agresywne leczenie (tj. całkowitą tyreoidektomię i RAI) lub włączenie do badań klinicznych.

Thyroid GuidePx® metodą biopsji cienkoigłowej Nasze badania przeprowadzono dotychczas z użyciem próbek chirurgicznych i w tym formacie opracowano dostępny na rynku test. Jednakże ostatnie badanie przeprowadzone przez Instytut Ekonomiki Zdrowia wykazało, że większą opłacalność Thyroid GuidePx® można osiągnąć poprzez wykonanie testu przed operacją. Wdrożenie testu przedoperacyjnego wymagałoby, aby test działał dobrze przy użyciu próbek pochodzących z biopsji cienkoigłowej (FNB).

FNB tarczycy rutynowo przechowuje się w CytoLyt, buforowanym płynnym środku konserwującym na bazie metanolu, przez maksymalnie 7 dni przed przeniesieniem komórek do ThinPrep w celu oceny cytologicznej. My i inni (17-21) ustaliliśmy wcześniej, że wysokiej jakości DNA i RNA można uzyskać z komórek w CytoLyt. Nasze ostatnie badanie wykonalności obejmujące 12 pacjentów z PTC wykazało, że wykonanie testu Thyroid GuidePx® na FNB jest wykonalne. Jak dotąd wskaźnik powodzenia technicznego wyniósł 100%, a zgodność poziomu genów z próbkami chirurgicznymi przekracza 0,9. Jednakże poleganie na ograniczonym FNB w charakterystyce choroby molekularnej oznacza, że ​​próbka jest reprezentatywna dla całego guza. W przypadku guzów pierwotnych i przerzutów opisano heterogeniczność genomową i transkryptomiczną (23). Dlatego ważne będzie udokumentowanie zgodności pomiędzy próbkami pobranymi przez FNB i próbkami chirurgicznymi.

CELE I CEL BADANIA Ogólnym celem badania jest określenie, czy bardziej ograniczona próbka z biopsji cienkoigłowej jest wystarczająco reprezentatywna dla większego guza, aby określić ważną klasyfikację molekularną za pomocą testu Thyroid GuidePx®.

Cel główny 1. Aby określić zgodność pomiędzy klasyfikacją molekularną Thyroid GuidePx® uzyskaną z FNA i dopasowanymi próbkami chirurgicznymi.

Cele drugorzędne

1. Porównanie wskaźnika powodzenia technicznego w wypełnieniu prawidłowego Thyroid GuidePx® przy użyciu FNA i próbek chirurgicznych.
2. Porównanie wyników nawrotów przy użyciu systemu stratyfikacji ryzyka ATA z pacjentami sklasyfikowanymi przez Thyroid GuidePx® przy użyciu próbek chirurgicznych.
3. Porównanie wyników nawrotów przy użyciu systemu stratyfikacji ryzyka ATA z pacjentami sklasyfikowanymi przez Thyroid GuidePx® przy użyciu próbek FNA.

PROJEKT PRÓBNY Schemat próby (proszę zapoznać się z Protocol_Calgary_11 lipca 2023.docx przyłączony)

Pobieranie i analiza próbek Pacjenci zostaną zaproszeni do udziału w badaniu, jeśli przedoperacyjna diagnoza tkanki to PTC (Bethesda VI) lub podejrzenie PTC (Bethesda V) i kwalifikują się do częściowej lub całkowitej tyreoidektomii, zgodnie z opisem w kryteriach włączenia i wykluczenia . Po wyrażeniu zgody pacjenci zostaną poddani zabiegowi chirurgicznemu zgodnie z planem chirurga. Od wszystkich uczestników zostaną zebrane dane demograficzne, kliniczne i patologiczne.

Podczas operacji, gdy tarczyca i guz zostaną odsłonięte, chirurg wykona pod bezpośrednim okiem badanie BNB guza dominującego (tj. zmiany zidentyfikowanej przed operacją). To najbardziej symuluje warunki in vivo przedoperacyjnej BNB, a jednocześnie ogranicza potencjalne wady techniczne biopsji przezskórnej (np.: nieodpowiednie ukierunkowanie na zmianę). Materiał komórkowy uzyskany z FNB zostanie natychmiast umieszczony w podłożu transportowym (CytoLyt), a następnie schłodzony. Próbki będą wysyłane co tydzień do laboratorium centralnego w celu izolacji RNA i RNASeq. W tym samym czasie próbki FNB zostaną zbadane przez przeszkolonego cytopatologa pod kątem obecności komórek nowotworowych.

Jeśli obecny jest więcej niż jeden guzek, guzek FNB zostanie oznaczony przez chirurga dla patologa. Pod kierunkiem współpracującego patologa zostanie usunięty kawałek guza i szybko zamrożony, a sąsiedni fragment zostanie pobrany w celu utrwalenia w formalinie i zatopienia w parafinie (FFPE). Zostanie przygotowany jeden szkiełko H&E z próbki FFPE wybarwionej na obecność H&E oraz 3–6 niezabarwionych skrawków, które następnie zostaną przesłane do laboratorium centralnego w celu mikrodysekcji, izolacji RNA i RNASeq. Proces ten będzie przebiegał zgodnie z rutynowymi protokołami przetwarzania próbek i nie będzie kolidował ze standardowymi metodami diagnostyki patologicznej.

Jeśli pacjenci podpisali opcjonalny formularz świadomej zgody na biobankowanie, jeśli pozostała wystarczająca ilość zamrożonej próbki, próbka zostanie zatrzymana w celu ponownego zbadania (w razie potrzeby) lub w celu wsparcia dodatkowych badań, takich jak analiza całego transkryptomu i analiza mutacji. Wykorzystanie tych próbek do tych celów wymagałoby dodatkowych zezwoleń etycznych.

Ukończono już studium wykonalności obejmujące 12 pacjentów. Wskaźnik powodzenia technicznego w zakresie pobierania próbek i przeprowadzania testu wyniósł 100%, ilość i jakość RNA w FNB były doskonałe, a poziomy genów były doskonałe w testach przeprowadzonych na FNB i próbkach chirurgicznych.

Badanie RNASeq for Thyroid GuidePx® zostanie wykonane w OncoHelix, laboratorium klinicznym specjalizującym się w onkologii precyzyjnej, mieszczącym się w Cumming School of Medicine na Uniwersytecie Calgary. Jeżeli w OncoHelix nie można przeprowadzić badania w odpowiednim czasie, próbki zostaną zbadane w Protean BioDiagnostics, laboratorium posiadającym certyfikat CAP/CLIA w Orlando na Florydzie, które obecnie wykonuje test w celach komercyjnych. Klasy ryzyka zostaną przypisane przez oprogramowanie zaprojektowane przez Qualisure Diagnostics na podstawie danych wygenerowanych przez RNASeq.

Punkty końcowe

Główny punkt końcowy:

1. Zgodność, klasyfikacja ryzyka molekularnego FNB raka brodawkowatego tarczycy i dopasowanych zamrożonych próbek chirurgicznych

Drugorzędowe punkty końcowe:

1. Wskaźnik sukcesu technicznego w wypełnieniu prawidłowego Thyroid GuidePx® przy użyciu FNB
2. Wskaźnik sukcesu technicznego w wypełnieniu prawidłowego Thyroid GuidePx® w próbkach chirurgicznych FFPE.
3. Wskaźnik nawrotów biochemicznych po 5 latach (tyreoglobulina ≥ 1 ng/ml, tylko u pacjentów, którzy przeszli całkowitą tyreoidektomię)
4. Częstość nawrotów strukturalnych po 5 latach

5. Wydajność testu jako test prognostyczny, Thyroid GuidePx®: FNB i próbki chirurgiczne

   1. Specyficzność: odsetek pacjentów bez nawrotów strukturalnych przewidywany w teście
   2. Czułość: zdolność testu do identyfikacji osób, u których choroba nawróci w ciągu 5 lat (przewidywany odsetek nawrotów strukturalnych)
   3. AUROC
   4. Dodatnia wartość predykcyjna
   5. Ujemna wartość predykcyjna

6. Wydajność, stratyfikacja ryzyka ATA

   1. Specyficzność: odsetek pacjentów bez nawrotów strukturalnych przewidywany w teście
   2. Czułość: zdolność testu do identyfikacji osób, u których choroba nawróci w ciągu 5 lat (przewidywany odsetek nawrotów strukturalnych)
   3. AUROC
   4. Dodatnia wartość predykcyjna
   5. Ujemna wartość predykcyjna

Zaślepianie i ograniczanie błędu systematycznego Do analizy zostaną włączone wyłącznie próbki o wystarczającej jakości RNA (DV200>30). Tylko FNB zawierające komórki nowotworowe („cytologiczne pozytywne”) zostaną uwzględnione w obliczeniach zgodności. RNASeq zostanie wykonane przez technika, który nie zna żadnych szczegółów klinicznych. W szczególności technik nie będzie w stanie zidentyfikować pasujących próbek z próbek chirurgicznych i FNB. Klasyfikacja molekularna zostanie przeprowadzona w sposób zaślepiony. Dane będą monitorowane przez niezależny Komitet Monitorowania Danych. Komitet Monitorowania Danych, składający się z co najmniej trzech osób, w tym statystyka, będzie monitorował analizę danych.

Zasady zatrzymywania W naszych próbkach chirurgicznych powtarzalność między partiami i wewnątrz partii konsekwentnie wykazywała zgodność poziomu genów > 0,9. Zgodność poziomu genów pomiędzy FNB z dodatnim wynikiem badania cytologicznego a zamrożonymi próbkami chirurgicznymi („złoty standard”) będzie monitorowana dla każdej partii 24 pacjentów. Jeśli R <0,9, wstrzymamy się, aby ponownie ocenić przepływ pracy analitycznej i oprzyrządowanie. Jeśli zgodność będzie stale utrzymywać się poniżej 0,9 po 72 pacjentach, zaprzestaniemy oceny FNB, ale będziemy nadal testować próbki chirurgiczne. Ponieważ nie jest to badanie wysokiego ryzyka, nie zamierzamy przedwcześnie go kończyć. Nawet jeśli zgodność między FNB a próbkami chirurgicznymi jest niska, przydatne będą dane uzyskane z wyników badań w odniesieniu do klasyfikacji molekularnej (w próbkach chirurgicznych).

WYBÓR I WYCOFANIE PRZEDMIOTÓW Kryteria włączenia

1. Wiek ≥ 18 lat
2. Rozpoznanie raka brodawkowatego tarczycy na podstawie biopsji cienkoigłowej (FNB) interpretowanej jako cytologia Bethesda V lub VI
3. Rozmiar guza > 1 cm maksymalnej średnicy
4. Pacjent jest kandydatem do operacji
5. Pacjent wyraził zgodę

Kryteria wyłączenia

1. Historia rodzinna raka tarczycy
2. Historia napromieniania szyi
3. Niemożność lub chęć wykonania biopsji cienkoigłowej
4. Nie chce poddać się usunięciu tarczycy
5. Ostateczna patologia nie wskazuje na raka brodawkowatego tarczycy
6. Przypadki, w których nie ma wyraźnie dominującego guzka
7. Przypadki, w których występuje wiele guzków, które uniemożliwiają pobranie próbki z określonego guzka

Kryteria wycofania uczestnika Uczestnicy mogą przerwać udział w badaniu w dowolnym momencie, powiadamiając o tym jednego z badaczy lub personel badawczy. Dane uzyskane przed wycofaniem zostaną wykorzystane do analizy, ale po wycofaniu nie będą zbierane żadne dodatkowe dane. Na prośbę badanego próbki mogą zostać pobrane przed badaniem. Pacjenci zostaną zastąpieni, jeśli próbki nie zostały przetestowane za pomocą RNASeq (Thyroid GuidePx®).

LECZENIE OSÓB Klasyfikacja molekularna i ryzyko nawrotu określone przez Thyroid GuidePx® zostaną ujawnione lekarzowi i pacjentowi. Ryzyko nawrotu opiera się na zbiorczych danych walidacyjnych obejmujących przypadki z Alberty i Australii. Ujawnione zostaną jedynie wyniki zamrożonej próbki chirurgicznej („złoty standard”). Jak zwykle decyzje dotyczące leczenia będą podejmowane przez lekarza we współpracy z pacjentem na podstawie syntezy wszystkich dostępnych informacji klinicznych. To badanie kliniczne nie definiuje ścieżki leczenia. Częstotliwość i czas trwania kontroli nie będą określone w protokole i zostaną określone przez lekarza prowadzącego. Jest to badanie nieinterwencyjne, dlatego przestrzeganie zaleceń nie będzie monitorowane.

OCENA SKUTECZNOŚCI Drugorzędnym wynikiem jest wykonanie testów mających na celu stratyfikację ryzyka nawrotu. Wyniki testu zostaną porównane w próbkach pobranych przez FNB i próbkach chirurgicznych, a następnie porównane z obecnym standardem opieki (system stratyfikacji ryzyka ATA). Czas do nawrotu będzie mierzony od momentu całkowitego leczenia początkowego. U pacjentów z mikroskopijną chorobą pozostałą po operacji czas do nawrotu będzie mierzony od momentu przyjęcia terapeutycznej dawki jodu radioaktywnego. Zdarzenia nawrotowe zostaną zdefiniowane w oparciu o wytyczne American Thyroid Association z 2016 roku.

Następujące kryteria będą oznaczać stan wolny od choroby po terapii: (i) brak klinicznych objawów nowotworu; (ii) brak dowodów na obecność nowotworu w obrazowaniu radioaktywnym jodem i/lub USG szyjki macicy; (iii) w przypadku tarczycy po całkowitej usunięciu tarczycy, niestymulowana tyreoglobulina (Tg) w surowicy <0,2 ng/ml; dla pacjentów po lobektomii, niestymulowana Tg<30. Nieokreśloną odpowiedź na terapię definiuje się jako: (i) brak klinicznych objawów nowotworu; (ii) brak dowodów na obecność nowotworu w obrazowaniu radioaktywnym jodem i/lub USG szyjki macicy; (iii) w przypadku tarczycy po całkowitej usunięciu tarczycy, niestymulowana Tg 0,2–1; dla po lobektomii, Tg>30. Po całkowitej wycięciu tarczycy niepełną odpowiedź biochemiczną definiuje się jako Tg>1 przy braku choroby strukturalnej. Wartości Tg są wiarygodne tylko w przypadku braku przeciwciał zakłócających (TgAb) (6).

Choroba zostanie zdefiniowana jako prawdziwy wznowa, jeśli u pacjenta wcześniej występowała niewykrywalna Tg przy braku TgAb i ujemny wynik badania USG szyi w ciągu 1 roku od poprzedniej operacji. Przetrwałą chorobę definiuje się jako Tg powyżej powyższych progów, nieprawidłowy wynik badania USG szyi, utrzymujący się podwyższony poziom TgAb lub obecność przerzutów odległych.

Pacjenci z chorobą przewlekłą i/lub chorobą z przerzutami (resekcja nieskuteczna) nie będą uwzględniani przy obliczaniu przeżycia wolnego od nawrotów.

OCENA BEZPIECZEŃSTWA Jedynym odstępstwem od standardowej opieki klinicznej jest śródoperacyjne pobranie próbki przez FNB. Jednak w porównaniu z planowanym zabiegiem chirurgicznym ryzyko to jest niewielkie. Głównym ryzykiem jest niewielkie ryzyko wystąpienia klinicznie istotnego krwawienia, szacowane na <1%. Ponieważ badanie to nie będzie wiązało się z żadną interwencją, nie planuje się monitorowania zdarzeń niepożądanych.

STATYSTYKI Optymalizacja warunków RNASeq dla próbek w CytoLyt RNA zostanie wyizolowany z FNB w CytoLyt zgodnie z SOP. Ilość RNA zostanie oceniona za pomocą NanoDrop, a jakość zostanie określona ilościowo za pomocą DV200. RNASeq zostanie wykonane w próbkach CytoLyt i dopasowanych zamrożonych próbkach przy różnej głębokości odczytu. W sparowanych tkankach CytoLyt i FFPE parametry testu zostaną ocenione jako funkcja metody przechowywania tkanki wejściowej, jakości RNA (DV200) i czasu przechowywania. Ekspresja genów zostanie porównana w sparowanych tkankach CytoLyt i zamrożonych, a następnie skorelowana między warunkami. Najważniejszy wynik, czyli przypisanie klasy molekularnej, zostanie porównany w parach próbek.

W każdym eksperymencie oceniane będą następujące wskaźniki wydajności w oparciu o listę kontrolną College of American Pathologists (CAP) zawierającą wymagania specyficzne dla sekwencjonowania nowej generacji:

Metryki testu

a) Metryki RNASeq: (i) Liczba odczytów (odczyty całkowite, odczyty unikalne, odczyty zduplikowane, odczyty rRNA, specyficzność nici); (ii) Pokrycie (liczba odczytów obejmujących daną pozycję genomową): średnie pokrycie, średni współczynnik zmienności, pokrycie 5'/3', luki w pokryciu, błąd GC (iii) Korelacja ekspresji (zmierzone poziomy ekspresji w porównaniu ze znanymi poziomami standardów wewnętrznych ERCC) b) Wykrywanie indywidualnego genu: (i) Czułość analityczna: część przypadków, w których każdy gen w standardzie wewnętrznym ERCC jest prawidłowo zidentyfikowany.

(ii) Specyficzność analityczna: zdolność do zidentyfikowania braku genów wchodzących w skład wewnętrznego standardu ERCC (iii) Dokładność: czułość + specyficzność

Porównanie stratyfikacji ryzyka molekularnego (Thyroid GuidePx®) określonej w próbkach FNB i próbkach chirurgicznych Pacjenci z ostateczną patologią, która nie wykazuje raka brodawkowatego tarczycy, zostaną wykluczeni z analizy zgodności. Podobnie próbki FNB, które dają wynik negatywny pod względem cytologicznym, zostaną wykluczone z analizy zgodności. Przypisanie klasy molekularnej zostanie porównane pomiędzy próbkami uzyskanymi przez FNB i dopasowanymi zamrożonymi próbkami chirurgicznymi. Próbki chirurgiczne będą uznawane za złoty standard. Statystyka kappa zostanie wykorzystana do określenia istotności zgodności pomiędzy dwoma typami próbek.

Warstwy ryzyka zostaną przypisane w sposób zaślepiony przy użyciu Thyroid GuidePx® i systemu stratyfikacji ryzyka ATA. Dla każdej klasy ryzyka porównane zostaną wskaźniki nawrotów strukturalnych i biochemicznych po 5 latach. Do oceny dokładności testu zostanie wykorzystany binarny wynik testu, zależny od statusu choroby (nawrót strukturalny). Powtarzalność strukturalna reprezentuje złoty standard. Do oceny czułości i swoistości każdej metody stratyfikacji ryzyka zostanie zastosowany dwustronny test McNemara dla dwóch zależnych proporcji, z korektą Holma na wielokrotność w celu oddzielnej oceny każdej miary dokładności.

Wydajność Thyroid GuidePx®

Na podstawie badań opisanych powyżej działanie Thyroid GuidePx® będzie oceniane oddzielnie w próbkach FNB i próbkach chirurgicznych. Charakterystyki wydajności będą oceniane w następujący sposób:

1. Zależny od czasu AUROC (obszar pod krzywą operatora odbiornika) (24). Na potrzeby obliczeń poziom progowy pozytywnego wyniku testu oznacza ryzyko pośrednie lub wysokie (ponieważ przewiduje się, że przypisanie ryzyka pośredniego skutkowałoby znacząco odmiennymi decyzjami klinicznymi).
2. Czułość: obliczona jako skumulowana czułość po 5 latach, zgodnie z opisem Kamarudina i Kolamunnage-Dona (24)
3. Specyficzność: obliczona jako specyficzność dynamiczna, jak opisali Kamarudin i Kolamunnage-Dona (24)

Obliczanie wielkości próbki Porównamy przypisanie ryzyka molekularnego na podstawie próbek chirurgicznych i dopasowanych FNB od 109 pacjentów. Minimalny poziom zgodności, który jest klinicznie akceptowalny, wynosi 80%. Obliczenia wielkości próby przeprowadzono w oparciu o statystykę Kappa Lina w celu sprawdzenia zgodności między dwoma miarami dla trzech podgrup molekularnych (25). Zastosowano hipotezę dwustronną z poziomem istotności 0,05, a moc ustalono na 90%. Wielkość podgrup molekularnych ustalono na 23% (typ 1), 49% (typ 2) i 28% (typ 3). Jeżeli hipoteza zerowa głosi, że poziom zgodności między FNB a próbkami chirurgicznymi wynosi 0,6, wówczas bylibyśmy w stanie wykryć poziom zgodności wynoszący 0,8 lub wyższy w przypadku 109 pacjentów. Zgodność wynosząca 0,90 byłaby wykrywalna przy 40 pacjentach przy założeniu tego samego zerowego poziomu zgodności.

Około 25% pacjentów z cytologią Bethesda V i około 5% pacjentów z cytologią Bethesda VI będzie miało chorobę łagodną. Ponadto w około 5% przypadków jakość RNASeq w próbkach FFPE jest niewystarczająca. Na tej podstawie planujemy wskaźnik rezygnacji na poziomie 20%. Dlatego badanie zaprojektowano tak, aby obejmowało 130 pacjentów.

BEZPOŚREDNI DOSTĘP DO DANYCH/DOKUMENTÓW ŹRÓDŁOWYCH Ośrodek badań klinicznych umożliwi monitorowanie związane z badaniem, audyty, przeglądy REB i inspekcje regulacyjne, zapewniając bezpośredni dostęp do danych/dokumentów źródłowych.

Audyty badań klinicznych przeprowadza się w celu zapewnienia, że ​​prawa, bezpieczeństwo i dobro pacjentów są odpowiednio chronione, w celu oceny zgodności z protokołem, procesami i umowami, standardami ICH Dobrej Praktyki Klinicznej i obowiązującymi wymogami regulacyjnymi, a także w celu oceny jakości danych.

Każda krajowa agencja regulacyjna może w dowolnym momencie przybyć w celu przeprowadzenia audytu lub inspekcji ośrodka badawczego. Audyt ten obejmuje wywiady z głównym badaczem i zespołem badawczym, przegląd dokumentacji i praktyk, przegląd obiektów, sprzętu oraz weryfikację danych źródłowych.

Badacz udzieli dowolnej krajowej agencji regulacyjnej bezpośredniego dostępu do dokumentacji papierowej i/lub elektronicznej dotyczącej badania klinicznego (np. CRF, dokumenty źródłowe, takie jak karty pacjentów szpitalnych i pliki badań badacza). Podczas audytu można odwiedzić wszystkie obiekty ośrodka związane z prowadzeniem badania (np. laboratorium, oddział ambulatoryjny). Osoba przeprowadzająca badanie zgadza się współpracować i zapewniać pomoc w rozsądnych terminach i miejscach w odniesieniu do wszelkich działań audytowych.

KONTROLA JAKOŚCI I ZAPEWNIENIE JAKOŚCI Główny badacz upewni się, że wszyscy członkowie badania przestrzegają protokołu oraz wymogów regulacyjnych i standardów Dobrej Praktyki Klinicznej. Wszystkie ośrodki prowadzące badania kliniczne umożliwią monitorowanie, audyty, przeglądy REB i inspekcje regulacyjne związane z badaniem, zapewniając bezpośredni dostęp do danych/dokumentów źródłowych.

Komitet Monitorowania Danych (DMC) będzie spotykał się podczas prowadzenia badania w następujący sposób: 1. Po rozpoczęciu badania w celu sfinalizowania Karty DMC; 2. Po zapisaniu się 24 uczestników; 3. Po zapisaniu się 72 uczestników; oraz 4. po zakończeniu rejestracji.

ETYKA Odpowiedzialny badacz dopilnuje, aby badanie zostało przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską. Badanie to zostanie przeprowadzone zgodnie z kanadyjskimi i międzynarodowymi standardami dobrej praktyki klinicznej dla wszystkich badań, w tym zharmonizowanymi trójstronnymi wytycznymi ICH dotyczącymi dobrej praktyki klinicznej. Będą również przestrzegane obowiązujące przepisy rządowe, wytyczne NNHPD dotyczące badań klinicznych oraz zasady i procedury badawcze dotyczące usług opieki zdrowotnej Alberta Health Services.

Niniejszy protokół i wszelkie poprawki zostaną przedłożone HREBA-CC w celu formalnego zatwierdzenia przeprowadzenia badania. Decyzja HREBA-CC dotycząca przeprowadzenia badania zostanie podjęta na piśmie i skierowana do badacza.

Ujawnienie klasyfikacji ryzyka molekularnego próbek chirurgicznych („złoty standard”) jest uzasadnione, ponieważ istnieją istotne dane dotyczące wyników badań próbek chirurgicznych. Co więcej, po rozpoczęciu tego badania będzie on dostępny na rynku jako test opracowany laboratoryjnie (LDT).

OBSŁUGA DANYCH I PRZECHOWYWANIE REJESTRÓW Po zakończeniu badania wszystkie dane z tego badania będą przechowywane przez 15 lat i przechowywane zgodnie z protokołem w Centrum Badań Klinicznych w Calgary.

FINANSOWANIE I UBEZPIECZENIE Badanie będzie finansowane przez Qualisure Diagnostics, Inc. i uzupełniane przez recenzowane granty. Ubezpieczenie zapewni Uniwersytet Calgary i Alberta Health Services, a także Qualisure Diagnostics.

POLITYKA PUBLIKACYJNA Wyniki tego badania klinicznego zostaną opublikowane w recenzowanym czasopiśmie, którego współautorami będą wszyscy wymienieni badacze. Wszystkie źródła finansowania zostaną potwierdzone.

6.0 Opisać procedury, leczenie lub czynności wykraczające poza standardowe praktyki lub stanowiące uzupełnienie: .

Jedynym odstępstwem od standardowej opieki klinicznej jest śródoperacyjne pobranie próbki przez FNB. Jednak w porównaniu z planowanym zabiegiem chirurgicznym ryzyko to jest niewielkie. Głównym ryzykiem jest niewielkie ryzyko wystąpienia klinicznie istotnego krwawienia, szacowane na <1%. Ponieważ badanie to nie będzie wiązało się z żadną interwencją, nie planuje się monitorowania zdarzeń niepożądanych.

Podczas operacji, gdy tarczyca i guz zostaną odsłonięte, chirurg wykona pod bezpośrednim okiem badanie BNB guza dominującego (tj. zmiany zidentyfikowanej przed operacją). To najbardziej symuluje warunki in vivo przedoperacyjnej BNB, a jednocześnie ogranicza potencjalne wady techniczne biopsji przezskórnej (np.: nieodpowiednie ukierunkowanie na zmianę).

Pod kierunkiem współpracującego patologa zostanie usunięty kawałek guza i szybko zamrożony, a sąsiedni fragment zostanie pobrany w celu utrwalenia w formalinie i zatopienia w parafinie. Tkanka zostanie udostępniona do badań dopiero po pobraniu wystarczającej ilości tkanki do użytku diagnostycznego i klinicznego.