A finom tűs biopszián (FNB) és a műtéti mintákon alapuló molekuláris osztályozás összhangja

HÁTTÉRINFORMÁCIÓK A pajzsmirigyrák a 8. leggyakoribb rákos megbetegedések előfordulása, és az incidencia 1992 óta több mint 6%-kal nő évente. A papilláris pajzsmirigyrák (PTC) felelős a legtöbb pajzsmirigyrákért, és a pajzsmirigyrák növekvő előfordulása szinte teljes mértékben a kisméretű PTC-k fokozottabb kimutatásának tulajdonítható (1). A PTC általában kedvező prognózisú, magas gyógyulási arány mellett. Azonban a PTC-k körülbelül 10-15%-a agresszívebb viselkedést mutat, és gyakran ellenáll a hagyományos adjuváns terápiáknak, például a radioaktív jódnak (2, 3). Tekintettel a PTC esetek növekvő számára (és az egészségügyi költségek potenciális terhére), a pontos prognózis egyre fontosabbá válik. A prognózis és a kiújulás kockázatának pontos becslése elkerüli a szükségtelenül kiterjedt műtéteket, vizsgálatokat és utánkövetést a jó prognózisú egyéneknél, és kiterjedtebb műtéteket, adjuváns terápiákat és hosszan tartó nyomon követést irányít azokra, akiknek szükségük van rá.

Az American Thyroid Association (ATA) kockázati rétegződési rendszere A kezelési döntéseket az American Thyroid Association (ATA) kockázati rétegződési rendszere határozza meg, amely klinikai és kóros tényezők alapján becsüli meg a betegség kiújulásának kockázatát. Bár ezt a rendszert számos tanulmány visszamenőlegesen validálta, a variancia magyarázott aránya nem optimális, és 19–34% között mozog (4, 5). Az, hogy az ATA-rendszer nem képes teljes mértékben megjósolni a kiújulást, összefügghet azzal, hogy ez a rendszer nem képes megfelelően integrálni a tumor molekuláris profiljához kapcsolódó kockázatot. Jelenleg csak egy molekuláris marker, a BRAFV600E szerepel az ATA kockázati rétegződési rendszerében. Az ATA Risk Stratification System másik korlátja, hogy csak műtét után lehet teljes mértékben bevezetni, amikor a kockázatbecsléshez szükséges összes klinikai és patológiai adat rendelkezésre áll. Ekkor már jelentős kezelési döntések születtek, és a műtét hatását a páciens már felismerte.

Kockázatbecslés a kezelés előtt: Az ellátás jelenlegi standardja 2015-ben az ATA beszámolt azokról a kritériumokról, amelyek alapján a betegeket konzervatívabb műtétekre, például pajzsmirigy-lobectomiára lehet kiválasztani. Az ATA 2015-ös irányelvei szerint a következő preoperatív kritériumokkal rendelkező betegek alacsony kockázatúnak minősülnek: 1-4 cm-es daganatméret, klinikailag csomó negatív, nincs extrathyreoidális terjedés, a családban nem fordult elő pajzsmirigyrák, és nincs a kórelőzményében nyaki sugárkezelés ( 6). Ezeket a betegeket kezdetben pajzsmirigy-lobektómiával lehetett kezelni (a teljes pajzsmirigyeltávolítással szemben). 40-60%-uk azonban befejezett pajzsmirigyeltávolítást tesz szükségessé, mivel a posztoperatív kockázati rétegződés (a műtét után rendelkezésre álló összes klinikai és patológiai információ felhasználásával) magasabb kockázatúnak minősítette őket, mint az eredetileg becsülték (7-11). Egy közelmúltban végzett vizsgálatban a betegek 51%-ánál át kellett térni egy befejezett pajzsmirigy-eltávolításra, mert további kockázati tényezőket ismertek fel a műtét során vagy a végleges patológia rendelkezésre állása után (12). Ez jól mutatja a klinikai preoperatív kockázatbecslés korlátait, és egy jobb preoperatív kockázatbecslési módszer szükségességét. Ezért a pajzsmirigyrákos sebészek és betegek számára hasznosak lennének olyan további információk, amelyek pontosítanák a lobectomia megfelelő betegeknél történő elvégzésére vonatkozó döntést, miközben minimálisra csökkentik a befejezett pajzsmirigyeltávolítás szükségességét.

Pajzsmirigy GuidePx®: Új molekuláris kockázati rétegződési rendszer Az ATA kockázati rétegződési rendszernek a prognózis megbízható meghatározására vonatkozó hiányosságait egy új molekuláris kockázati rétegződési rendszerrel orvosolták, amely a Thyroid GuidePx® génaláírást tartalmazza. Számítógépes szoftveralgoritmus segítségével a kiújulással kapcsolatos átiratokat (mRNS) és a kiújulás hiányához kapcsolódó átiratokat azonosították egy 335 PTC-s betegből álló képzési csoportban, majd egy 167 betegből álló validációs sorozatban validálták. Az adatkészletben szereplő daganatok frissen fagyasztottak.

A prognosztikai gének expressziós mintázata alapján három molekuláris altípust azonosítottak. Ezeket 1-es, 2-es és 3-as típusúnak nevezték. A 3-as típusú PTC-knek volt a legagresszívabb a biológiája és a legmagasabb a kiújulási aránya. Ezt követően 124 koreai PTC-betegnél és 167 edmontoni betegnél validálták.

A molekuláris altípusokat a tumor stádiumának összefüggésében vettük figyelembe. Pontosabban, a nyirokcsomó-betegség hiányában 1-4 cm-es daganatokat (amelyek olyan betegeket foglalnak magukban, akik potenciális jelöltek lennének pajzsmirigy-lobektómiára) az előrehaladottabb betegségben szenvedő betegektől külön elemezték. Érdekes módon a 3-as típusú PTC-k nagy kiújulási arányt mutattak, függetlenül a tumor stádiumától. Az 1-es és 2-es típusú PTC-vel rendelkező lobectomiás jelöltek kiújulási aránya <3% volt (1A, B ábra, lásd: Protocol_Calgary_July 11, 2023.docx csatolt).

A teszt teljesítménye A PTC molekuláris altípusát azonosító NGS-alapú teszt a Thyroid GuidePx® nevet kapta. A PTC Thyroid GuidePx® használatával kombinált molekuláris és klinikai alosztályozását összehasonlították az ATA Risk Stratification System rendszerrel. Az ATA kockázati rétegződési csoportokat minden esetben két gyakorló klinikus határozta meg. A vevő működési jelleggörbe (AUROC) alatti időfüggő terület kiszámításához bináris osztályozást alkalmaztunk: alacsony kockázat versus közepes/magas kockázat. Az AUROC kiszámítása a TCGA felfedezési kohorsz és az edmontoni kohorsz ismétlődési eredményei alapján történt. A legjobb kockázati rétegződési teljesítményt a Thyroid GuidePx® teszt érte el a klinikai jellemzőkkel (azaz a tumor méretével és a nyirokcsomók érintettségével) összefüggésben. A smoothROCtime csomagot használva az 5 éves AUROC a Thyroid GuidePx® esetében 0,80 volt a tumor méretét és a nyirokcsomók állapotát figyelembe véve, és 0,51 az ATA kockázati rétegződési rendszer esetében (2. ábra, lásd: Protocol_Calgary_July 11, 2023.docx csatolt).

Pajzsmirigy GuidePx®: Vizsgálat leírása A Thyroid GuidePx® teszt egy célzott hibrid-capture dúsító RNS-szekvenáláson (RNA-Seq) alapuló vizsgálat. A teszt bemenete a formalinnal rögzített paraffinba ágyazott (FFPE) szövetből vagy papilláris pajzsmirigyrák mintákból izolált RNS vagy finom tű biopsziás (FNB). A könyvtár előkészítése magában foglalja a Thyroid GuidePx® panel egyes génjei megcélzott régióinak specifikus amplifikálását. A panel 82 génből áll. Az eredményül kapott mintakönyvtárakat egy MiSeq/MiSeqDx reagens kazettába helyezzük át, amely tartalmazza a szekvenáláshoz szükséges összes reagenst. A Real-Time Analysis (RTA) szoftver, amely a MiSeq/MiSeqDx szekvenszer összetevője, biztosítja az alaphívásokat és a kapcsolódó minőségi pontszámokat a szekvenálás során. FASTQ fájlok jönnek létre, amelyek tartalmazzák a sorrendi és minőségi információkat. A FASTQ fájl egy széles körben használt szövegalapú fájlformátum az egyes amplikonokhoz tartozó nukleotidszekvenciák és a megfelelő minőségi pontszámok tárolására. A FASTQ fájlok bemenetként szolgálnak a szekvencia-illesztési algoritmusokhoz. Az igazított beolvasások BAM formátumú fájlba íródnak, amelyeket ezt követően olvasási számokká és kifejezésértékekké alakítanak át. A génexpressziós szinteket ezután az algoritmusnak vetik alá a kockázati kategóriák osztályozása érdekében.

A szoftver a 82 génből álló Thyroid GuidePx® panelen belüli géncsoportok expressziós mintázata alapján osztályozza a kockázatot. Három molekuláris osztályt határoztak meg egy 502 betegmintával végzett vizsgálat alapján, amely a génexpressziós mintázatot és az 5 éves recidívamentes túlélést társította. BRAFV600E mutációkkal dúsított magas kockázatú csoport; és két alacsonyabb kockázatú molekuláris alcsoportot azonosítottak.

Klinikai segédprogram

A Thyroid GuidePx® által biztosított pontosabb prognózis befolyásolhatja a klinikusok kezelési döntéseit. A következő példák arra mutatnak, hogyan alkalmazhatják a klinikusok a Thyroid GuidePx®-ből származó új információkat:

1. Az alacsony kockázatú PTC potenciálisan részleges pajzsmirigyeltávolítással (például lobectomiával) vagy akár aktív megfigyeléssel is kezelhető, nem pedig teljes pajzsmirigyeltávolítással. Ennek két fő előnye van az idő- és költségmegtakarítás mellett. Először is, csökken a pajzsmirigyhormon egész életen át tartó pótlásának szükségessége lobectomiát követően. Másodszor, gyakorlatilag nincs kockázata a teljes pajzsmirigyeltávolítás potenciálisan pusztító szövődményeinek, mint például a kétoldali visszatérő gégeideg-sérülés vagy a tartós hypoparathyreosis.
2. Az alacsony kockázatú PTC pontos azonosítása növelné az adjuváns radioaktív jód (RAI) megfelelőségét is. A RAI-terápia átmeneti és hosszú távú mellékhatásokat is eredményezhet, mint például a nyálmirigy-működési zavar, a petefészek és a here diszfunkciója, valamint a csontvelő-szuppresszió. A RAI-terápia a másodlagos rosszindulatú daganatok elméleti kockázatával is jár: az egyik becslés szerint 100 mCi 131I 10 000 kezelt betegenként 56 rosszindulatú daganatot indukál (15). Az is költséghatékony, ha a RAI-terápiát azokra a betegekre korlátozzák, akiknél javulna az általános vagy betegségmentes túlélés.
3. A PTC felügyelete két okból is megterhelheti a betegeket és az egészségügyi szervezeteket: a PTC-t leggyakrabban középkorban diagnosztizálják, és a betegek gyakran hosszú ideig túlélik a diagnózist. Ez azt jelenti, hogy a rendszeres kivizsgálás és kivizsgálás a kiújulás korai felismerésére akár évekig is eltarthat. A nyomon követés jellemzően éves fizikális vizsgálat, pajzsmirigy-stimuláló hormon és tiroglobulin szérum mérése, valamint időszakos nyaki ultrahangvizsgálat. Az alacsony kockázatú betegeknél megnövekedhet a nyomon követési vizsgálatok és vizsgálatok közötti intervallum, és esetleg elbocsáthatók a felügyelet alól.
4. Szintén fontos a nagy kiújulási kockázattal rendelkező betegek pontos azonosítása. Az ATA kockázati rétegződési rendszerről ismert, hogy pontatlan az ismétlődés előrejelzésében. A 2015-ös ATA Risk Stratification System alapján „alacsony kockázatúnak” minősített betegeknél a betegek 16%-ánál végül visszatérő betegség alakul ki (16). E kockázati besorolás következtében ezek a betegek alulkezeltek lehetnek. Azoknál a betegeknél, akiknél a magas kockázat pontosabb besorolása elérhető, agresszívabb kezelések (azaz teljes pajzsmirigyeltávolítás és RAI) vagy klinikai vizsgálatokba való bevonás mérlegelhető.

Pajzsmirigy GuidePx® finom tűs biopsziával Vizsgálatainkat eddig sebészeti minták felhasználásával végeztük, és egy kereskedelmi forgalomban kapható tesztet készítettek ebben a formátumban. Az Institute of Health Economics által végzett közelmúltbeli tanulmány azonban megállapította, hogy a Thyroid GuidePx® költséghatékonysága növelhető a műtét előtti teszt elvégzésével. A műtét előtti vizsgálat megköveteli, hogy a teszt jól teljesítsen finom tű biopsziából (FNB) származó minták felhasználásával.

A pajzsmirigy-FNB-ket rutinszerűen CytoLyt-ben, egy metanol alapú pufferolt folyékony tartósítószerben tárolják legfeljebb 7 napig, mielőtt a sejteket ThinPrep-be citológiai értékelés céljából átvisszük. Mi és mások (17-21) korábban megállapítottuk, hogy minőségi DNS és RNS származtatható a CytoLyt sejtjeiből. A közelmúltban végzett megvalósíthatósági tanulmányunk, amely 12 PTC-ben szenvedő betegből állt, bebizonyította, hogy a pajzsmirigy GuidePx® assay FNB-ken történő végrehajtása megvalósítható. A technikai sikeresség eddig 100%-os volt, a génszintű konkordencia a műtéti mintákkal meghaladja a 0,9-et. A molekuláris betegségek jellemzésének korlátozott FNB-jére való támaszkodás azonban azt jelenti, hogy a minta a daganat egészét reprezentálja. Genomikus és transzkriptomikus heterogenitást írtak le primer tumorokban és metasztázisokban (23). Ezért fontos lesz dokumentálni az FNB által vett minták és a műtéti minták közötti összhangot.

A VIZSGÁLAT CÉLKITŰZÉSEI ÉS CÉLJA A vizsgálat általános célja annak megállapítása, hogy a finom tűs biopsziából származó korlátozottabb minta kellően reprezentatív-e a nagyobb daganatra nézve ahhoz, hogy a Pajzsmirigy GuidePx® teszt segítségével meghatározzuk az érvényes molekuláris osztályozást.

1. elsődleges cél. Az FNA-kból nyert Thyroid GuidePx® molekuláris osztályozások és a megfelelő műtéti minták közötti összhang meghatározása.

Másodlagos célok

1. A technikai sikerarány összehasonlítása az érvényes Thyroid GuidePx® kitöltésében FNA-k és műtéti minták használatával.
2. A kiújulás kimenetelének összehasonlítása az ATA kockázati rétegződési rendszerrel a Thyroid GuidePx® által besorolt ​​betegekkel, műtéti minták használatával.
3. A kiújulás kimenetelének összehasonlítása az ATA kockázati rétegződési rendszerrel a Thyroid GuidePx® által FNA mintákat használó betegekkel.

PRÓBATERVEZÉS Próbavázlat (lásd: Protocol_Calgary_2023. július 11.docx csatolt)

Mintavételi és -elemzési betegeket hívunk meg a részvételre, ha preoperatív szövetdiagnózisuk van PTC-ről (Bethesda VI) vagy PTC-re gyanús (Bethesda V), és jogosultak részleges vagy teljes pajzsmirigy-eltávolításra, a felvételi és kizárási kritériumok szerint. . A beleegyezés után a betegeket sebészük által tervezett műtétnek vetik alá. A demográfiai, klinikai és patológiai adatokat minden résztvevőtől beszerezzük.

A műtét során, amikor a pajzsmirigy és a daganat szabaddá válik, a sebész közvetlen látás mellett elvégzi a domináns daganat (azaz: a műtét előtt azonosított elváltozás) FNB-jét. Ez a legpontosabban szimulálja a preoperatív FNB in ​​vivo körülményeit, ugyanakkor korlátozza a perkután biopszia lehetséges technikai bukását (pl.: a lézió nem megfelelő célba vétele). Az FNB-ből származó sejtes anyagot azonnal a szállítóközegbe (CytoLyt) helyezik, majd lehűtik. A mintákat hetente küldik el a központi laboratóriumba RNS izolálás és RNASeq vizsgálat céljából. Ezzel egyidejűleg az FNB-mintákat egy képzett citopatológus megvizsgálja daganatos sejtek jelenlétére.

Ha egynél több csomó van jelen, az FNB csomót a sebész megjelöli a patológus számára. Egy együttműködő patológus irányításával a daganat egy darabját eltávolítják és gyorsan lefagyasztják, egy szomszédos darabot pedig formalin rögzítéshez és paraffin beágyazáshoz (FFPE) vesznek. Az FFPE mintából egy H&E tárgylemezt, amelyet meg kell festeni H&E-re, és 3-6 festetlen metszetet készítenek, majd elküldik a központi laboratóriumba mikrodisszekció, RNS izolálás és RNASeq vizsgálat céljából. Ez a folyamat a rutin mintafeldolgozási protokollokat követi, és nem zavarja a patológiás diagnózis szokásos módszereit.

Ha a betegek aláírták a biobank használatához szükséges, választható tájékoztatáson alapuló beleegyezési űrlapot, és elegendő mennyiségű fagyasztott minta áll rendelkezésre, a mintát megőrzik újbóli tesztelés céljából (ha szükséges), vagy további vizsgálatok, például teljes transzkriptomelemzés és mutációs elemzés támogatása céljából. E minták ilyen célra történő felhasználása további etikai jóváhagyásokat igényel.

Egy 12 betegből álló megvalósíthatósági tanulmány már elkészült. A mintavétel és az assay technikai sikeressége 100%, az RNS mennyisége és minősége kiváló volt az FNB-kben, valamint kiváló génszintű konkordancia volt az FNB-ken és a műtéti mintákon végzett vizsgálatokban.

Az RNASeq for Thyroid GuidePx® vizsgálatát az OncoHelix klinikai laboratóriumában végzik el, amely a Calgaryi Egyetem Cumming Orvostudományi Karának precíziós onkológiájában szakértelemmel rendelkezik. Ha a vizsgálatot nem lehet időben elvégezni az OncoHelixnél, a mintákat a Protean BioDiagnostics-ban, egy CAP/CLIA tanúsítvánnyal rendelkező laboratóriumban vizsgálják meg Orlandóban (FL), amely jelenleg kereskedelmi forgalomban végzi a tesztet. A kockázati osztályokat a Qualisure Diagnostics által az RNASeq által generált adatok felhasználásával tervezett szoftver határozza meg.

Végpontok

Elsődleges végpont:

1. Papilláris pajzsmirigyrák FNB-k és illesztett fagyasztott műtéti minták összhangja, molekuláris kockázati osztályozása

Másodlagos végpontok:

1. Technikai sikerarány az érvényes Thyroid GuidePx® kitöltésében FNB-k használatával
2. Technikai sikerarány az érvényes Thyroid GuidePx® kitöltésében az FFPE sebészeti mintákban.
3. Biokémiai kiújulási arány 5 év után (tireoglobulin ≥ 1 ng/ml, csak teljes pajzsmirigyeltávolításon átesett betegeknél)
4. Strukturális megismétlődési arány 5 év után

5. A teszt teljesítménye prognosztikai tesztként, Pajzsmirigy GuidePx®: FNB és sebészeti minták

   1. Specificitás: a vizsgálat által előre jelzett strukturális recidíva nélküli betegek aránya
   2. Érzékenység: a teszt azon képessége, hogy azonosítani tudja azokat az egyéneket, akiknek a betegsége 5 éven belül kiújul (a strukturális kiújulások előre jelzett aránya)
   3. AUROC
   4. Pozitív prediktív érték
   5. Negatív prediktív érték

6. Teljesítmény, ATA kockázati rétegződés

   1. Specificitás: a vizsgálat által előre jelzett strukturális recidíva nélküli betegek aránya
   2. Érzékenység: a teszt azon képessége, hogy azonosítani tudja azokat az egyéneket, akiknek a betegsége 5 éven belül kiújul (a strukturális kiújulások előre jelzett aránya)
   3. AUROC
   4. Pozitív prediktív érték
   5. Negatív prediktív érték

Vakítás és a torzítás korlátozása Csak a megfelelő RNS-minőségű (DV200>30) minták kerülnek bele az elemzésbe. Csak a tumorsejteket tartalmazó ("citológiailag pozitív") FNB-k kerülnek bele a konkordanciaszámításba. Az RNASeq-et olyan technikus fogja elvégezni, aki nem ismeri a klinikai részleteket. A technikus kifejezetten nem tudja azonosítani a megfelelő mintákat a sebészeti mintákból és az FNB-kből. A molekuláris osztályozás vak módszerrel történik. Az adatokat egy független Adatfelügyeleti Bizottság fogja felügyelni. Az adatelemzést a legalább három főből álló Adatfelügyeleti Bizottság, köztük egy statisztikus is ellenőrzi.

Leállítási szabályok Sebészeti mintáinkban a sorozatok közötti és a tételen belüli ismétlések következetesen >0,9 génszintű konkordanciát mutattak. A citológiailag pozitív FNB és a fagyasztott sebészeti minták közötti génszintű összhangot (az "arany standard") minden 24 betegből álló tételnél ellenőrizni fogják. Ha R<0,9, szünetet tartunk, hogy újraértékeljük az analitikai munkafolyamatot és a műszerezettséget. Ha a konkordancia 72 beteg után tartósan 0,9 alatt van, akkor az FNB-k értékelését leállítjuk, de folytatjuk a műtéti minták vizsgálatát. Mivel ez nem egy magas kockázatú vizsgálat, nem áll szándékunkban idő előtt befejezni a vizsgálatot. Még ha alacsony az összhang is az FNB és a műtéti minták között, a molekuláris osztályozással kapcsolatos eredmények tanulmányozásából származó adatok (műtéti mintákban) hasznosak lesznek.

TÁRGYAK KIVÁLASZTÁSA ÉS VISSZAVONÁSA Bevételi kritériumok

1. Életkor ≥ 18 év
2. A papilláris pajzsmirigyrák diagnózisa finom tűs biopszián (FNB) alapul, amelyet Bethesda V vagy VI citológiaként értelmeznek
3. A tumor mérete > 1 cm a maximális átmérőben
4. A páciens operatív jelölt
5. A beteg beleegyezését adta

Kizárási kritériumok

1. Pajzsmirigyrák előfordulása a családban
2. A nyak sugárzásának története
3. Nem tud vagy nem hajlandó finom tűs biopsziára
4. Nem hajlandó pajzsmirigy-eltávolítani
5. A végső patológia nem mutat papilláris pajzsmirigyrákot
6. Olyan esetek, amikor nincs egyértelmű domináns csomó
7. Olyan esetek, amikor több csomó van, amely kizárja a mintavételt egy meghatározott csomóból

Az alany visszavonásának feltételei Az alanyok bármikor megszakíthatják a részvételt a vizsgálók vagy a kutatószemélyzet értesítésével. A visszavonás előtt szerzett adatokat elemzésre használjuk fel, de a visszavonást követően további adatgyűjtésre nem kerül sor. Az alany kérésére a vizsgálat előtt mintát lehet venni. Az alanyokat lecseréljük, ha a mintákat nem tesztelték az RNASeq (Thyroid GuidePx®) segítségével.

A TÉNYEK KEZELÉSE A Thyroid GuidePx® által meghatározott molekuláris besorolást és a kiújulás kockázatát az orvos és a beteg tudomására hozzuk. A megismétlődés kockázata kumulatív validációs adatokon alapul, beleértve az Albertából és Ausztráliából származó eseteket is. Csak a fagyasztott műtéti minta (az "arany standard") eredményeit teszik közzé. A szokásos szabványnak megfelelően a kezeléssel kapcsolatos döntéseket az orvos hozza meg a pácienssel együttműködve, az összes rendelkezésre álló klinikai információ szintézise alapján. Ez a klinikai vizsgálat nem határoz meg kezelési utat. A nyomon követés gyakoriságát és időtartamát nem írja elő a protokoll, és azt a kezelőorvos határozza meg. Ez egy beavatkozás nélküli vizsgálat, így a megfelelést nem fogják ellenőrizni.

A HATÉKONYSÁG ÉRTÉKELÉSE A másodlagos eredmény a tesztteljesítmény a kiújulás kockázatának rétegezésére. A tesztek teljesítményét az FNB által vett mintákban és a műtéti mintákban hasonlítják össze, majd összehasonlítják a jelenlegi ellátási színvonallal (az ATA kockázati rétegződési rendszerrel). A kiújulásig eltelt időt a teljes kezdeti kezeléstől számítjuk. A műtét után fennmaradó mikroszkopikus betegségben szenvedő betegeknél a kiújulásig eltelt időt a radioaktív jód terápiás dózisának befejezésétől számítják. Az ismétlődő eseményeket az American Thyroid Association 2016. évi irányelvei alapján határozzák meg.

A következő kritériumok jelentik a betegségtől mentes állapotot a terápia után: (i) nincs klinikai bizonyíték a daganatra; ii. a radioaktív jóddal végzett képalkotás és/vagy a méhnyak ultrahangvizsgálata nem mutat daganatot; (iii) totális pajzsmirigyeltávolítás után, nem stimulált szérum tiroglobulin (Tg) <0,2 ng/ml; posztlobectomiához, stimulálatlan Tg<30. A terápiára adott határozatlan válasz a következőképpen definiálható: (i) nincs klinikai bizonyíték a tumorra; ii. a radioaktív jóddal végzett képalkotás és/vagy a méhnyak ultrahangvizsgálata nem mutat daganatot; (iii) teljes pajzsmirigyeltávolítás után, stimulálatlan Tg 0,2-1; posztlobectomiánál Tg>30. A teljes pajzsmirigy-eltávolítást követően a biokémiailag nem teljes választ Tg>1-ként határozzák meg szerkezeti betegség hiányában. A Tg értékek csak interferáló antitestek (TgAb) hiányában megbízhatóak (6).

Valódi kiújulásnak minősül a betegség, ha a betegnek korábban TgAb hiányában nem volt kimutatható Tg-je, és az előző műtétet követő 1 éven belül negatív nyaki ultrahangvizsgálat történt. Tartós betegségnek minősül a fenti küszöbértékeknél nagyobb Tg, rendellenes nyaki ultrahang, tartósan emelkedett TgAb-szint vagy távoli áttétek jelenléte.

A tartós betegségben és/vagy áttétes betegségben (nem gyógyító reszekció) szenvedő betegek nem számítanak bele a kiújulásmentes túlélés kiszámításába.

A BIZTONSÁG ÉRTÉKELÉSE Az egyetlen eltérés a szokásos klinikai ellátástól az FNB által végzett intraoperatív mintavétel. A tervezett műtéti beavatkozáshoz képest azonban ez a kockázat kicsi. A fő kockázat a klinikailag jelentős vérzés csekély kockázata, becslések szerint <1%. Mivel a tanulmányhoz semmilyen beavatkozás nem kapcsolódik, nincs terv a nemkívánatos események nyomon követésére.

STATISZTIKA Az RNASeq-körülmények optimalizálása a CytoLyt-ben lévő mintákhoz Az RNS-t a CytoLyt-ben lévő FNB-kből izoláljuk az SOP szerint. Az RNS mennyiségét a NanoDrop, a minőséget pedig a DV200 méri. Az RNASeq-et a CytoLyt mintákban és az illesztett fagyasztott mintákban hajtják végre, különböző olvasási mélységekkel. A párosított CytoLyt és FFPE szövetekben a vizsgálati mutatókat a bevitt szövettárolási módszer, az RNS minőség (DV200) és a tárolási idő függvényében értékelik. A génexpressziót páros CytoLyt és fagyasztott szövetekben hasonlítjuk össze, majd korreláljuk a körülmények között. A legfontosabb eredményt, a molekuláris osztály-hozzárendelést páros mintákban hasonlítjuk össze.

A következő teljesítménymutatók kerülnek értékelésre minden kísérletnél, a College of American Pathologists (CAP) ellenőrző listája alapján, amely a következő generációs szekvenálásra vonatkozó követelményeket tartalmazza:

Vizsgálati metrikák

a) RNASeq metrikák: (i) olvasási számok (összes leolvasás, egyedi leolvasás, duplikált leolvasás, rRNS leolvasás, szálspecifitás); (ii) Lefedettség (egy adott genomiális pozíciót lefedő leolvasások száma): átlagos lefedettség, átlagos variációs koefficiens, 5'/3' lefedettség, lefedettségi rések, GC torzítás (iii) Expressziós korreláció (mért expressziós szintek és ismert szintek b) Egyedi géndetektálás: (i) Analitikai érzékenység: azon esetek töredéke, amikor az ERCC belső standardban szereplő egyes géneket helyesen azonosították.

(ii) Analitikai specificitás: az ERCC belső standardot tartalmazó gének hiányának azonosításának képessége (iii) Pontosság: érzékenység + specificitás

Az FNB-mintákban és a sebészeti mintákban meghatározott molekuláris kockázati rétegződés (Pajzsmirigy GuidePx®) összehasonlítása Azokat a betegeket, akiknek végső patológiája nem mutat papilláris pajzsmirigyrákot, kizárják a konkordanciaanalízisből. Hasonlóképpen, a citológiailag negatív FNB-minták ki lesznek zárva a konkordanciaanalízisből. A molekuláris osztályhoz való hozzárendelést az FNB által vett minták és a megfelelő fagyasztott sebészeti minták között hasonlítják össze. A sebészeti minták aranystandardnak számítanak. A kappa statisztikát a két mintatípus közötti konkordancia szignifikanciájának meghatározására fogjuk használni.

A kockázati rétegek vak módszerrel kerülnek kiosztásra a Thyroid GuidePx® és az ATA Risk Stratification System segítségével. A strukturális és biokémiai kiújulási arányokat 5 év után minden kockázati osztályban összehasonlítják. A betegség állapotától (strukturális kiújulás) függő bináris vizsgálati eredményt használnak a teszt pontosságának értékelésére. A strukturális ismétlődés az aranystandardot képviseli. Az egyes kockázati rétegződési módszerek érzékenységének és specifitásának értékelésére két függő arányú, kétoldalú McNemar-tesztet használnak, a Holm-féle multiplicitás-korrekcióval az egyes pontossági mértékek külön-külön történő értékeléséhez.

A Pajzsmirigy GuidePx® teljesítménye

A fent leírt vizsgálatok közül a Pajzsmirigy GuidePx® teljesítményét külön-külön értékelik az FNB-mintákban és a műtéti mintákban. A teljesítményjellemzők értékelése a következőképpen történik:

1. Időfüggő AUROC (a vevő kezelői görbe alatti terület) (24). A számítások szempontjából a pozitív teszt küszöbértéke a közepes vagy magas kockázat megjelölése (mivel előreláthatólag egy közepes kockázatú hozzárendelés jelentősen eltérő klinikai döntéseket eredményezne).
2. Érzékenység: kumulatív érzékenységként számítva 5 év után, Kamarudin és Kolamunnage-Dona leírása szerint (24)
3. Specificitás: dinamikus specificitásként számítva, Kamarudin és Kolamunnage-Dona leírása szerint (24)

A minta méretének kiszámítása Összehasonlítjuk 109 beteg műtéti mintáiból és a megfelelő FNB-kből származó molekuláris kockázat hozzárendelését. A klinikailag elfogadható minimális összhang 80%. A mintaméret számításai a Lin-féle Kappa statisztikán alapultak, hogy a két mérőszám megegyezzen három molekuláris alcsoportban (25). Kétoldalú hipotézist alkalmaztunk 0,05-ös szignifikanciaszinttel, és a teljesítményt 90%-ban rögzítettük. A molekuláris alcsoportok méretét 23%-ban (1. típus), 49%-ban (2. típus) és 28%-ban (3. típus) rögzítették. Ha a nullhipotézis az, hogy az FNB és a műtéti minták közötti egyezési szint 0,6, akkor 109 betegnél 0,8 vagy annál magasabb egyezési szintet tudnánk kimutatni. 0,90-es konkordancia lenne kimutatható, ha 40 beteg azonos nulla szintű egyetértést feltételez.

A Bethesda V citológiával rendelkező betegek körülbelül 25%-a és a Bethesda VI citológiával rendelkező betegek körülbelül 5%-a jóindulatú betegségben szenved. Ezenkívül az esetek körülbelül 5%-ában az RNASeq minősége nem megfelelő az FFPE mintákban. Ez alapján 20%-os lemorzsolódást tervezünk. Ezért a vizsgálatot 130 beteg bevonására tervezték.

KÖZVETLEN HOZZÁFÉRÉS A FORRÁSADATOKHOZ/DOKUMENTUMOKHOZ A klinikai vizsgálat helyszíne lehetővé teszi a vizsgálattal kapcsolatos monitorozást, auditokat, REB felülvizsgálatot és hatósági ellenőrzés(eke)t, közvetlen hozzáférést biztosítva a forrásadatokhoz/dokumentumokhoz.

Klinikai vizsgálati auditokat végeznek annak biztosítására, hogy a betegek jogai, biztonsága és jóléte megfelelő védelmet élvezzenek, értékeljék a protokollnak, folyamatoknak és megállapodásoknak való megfelelést, az ICH Good Clinical Practice szabványait és a vonatkozó szabályozási követelményeket, valamint értékeljék az adatok minőségét.

Bármely hazai szabályozó ügynökség bármikor bejöhet a vizsgálati helyszín ellenőrzésére vagy ellenőrzésére. Ez az audit a vezető kutatóval és a vizsgálati csoporttal folytatott interjúkból, a dokumentáció és a gyakorlat áttekintéséből, a létesítmények, berendezések és a forrásadatok ellenőrzéséből áll.

A vizsgáló bármely hazai szabályozó ügynökségnek közvetlen hozzáférést biztosít a klinikai vizsgálattal kapcsolatos papíralapú és/vagy elektronikus dokumentációhoz (pl. CRF-ek, forrásdokumentumok, például kórházi betegtáblázatok és vizsgálói vizsgálati fájlok). Az audit során minden, a vizsgálat lefolytatásához kapcsolódó helyszíni létesítmény megtekinthető (pl. laboratórium, járóbeteg osztály). A vizsgáló vállalja, hogy az ésszerű időpontokban és helyeken együttműködik és segítséget nyújt bármely ellenőrzési tevékenységgel kapcsolatban.

MINŐSÉGELLENŐRZÉS ÉS MINŐSÉGBIZTOSÍTÁS A vizsgálóvezető gondoskodik arról, hogy a vizsgálat minden tagja betartsa a protokollt, és megfeleljen a szabályozási és a helyes klinikai gyakorlat előírásainak. Valamennyi klinikai vizsgálati helyszín lehetővé teszi a vizsgálatokkal kapcsolatos megfigyelést, auditot, REB-felülvizsgálatot és hatósági ellenőrzés(eke)t, közvetlen hozzáférést biztosítva a forrásadatokhoz/dokumentumokhoz.

Az Adatfelügyeleti Bizottság (DMC) a vizsgálat lefolytatása során az alábbiak szerint ülésezik: 1. A próba megkezdésekor a DMC Charta véglegesítése; 2. 24 résztvevő beiratkozása után; 3. 72 résztvevő beiratkozása után; és 4. a beiratkozás befejezése után.

ETIKA A felelős vizsgáló gondoskodik arról, hogy ez a vizsgálat a Helsinki Nyilatkozattal összhangban történjen. Ezt a vizsgálatot a jó klinikai gyakorlat kanadai és nemzetközi szabványai szerint végzik el minden vizsgálatra vonatkozóan, beleértve az ICH Harmonized Tripartite Guideline on Good Clinical Practice-t. A vonatkozó kormányzati előírásokat, az NNHPD klinikai vizsgálati irányelveit és az Alberta Health Services kutatási irányelveit és eljárásait is követik.

Ezt a protokollt és minden módosítását benyújtják a HREBA-CC-hez hivatalos jóváhagyásra a vizsgálat elvégzéséhez. A HREBA-CC a vizsgálat lefolytatására vonatkozó döntését írásban hozza meg a vizsgálónak.

A sebészeti minták molekuláris kockázati besorolásának közzététele (az "arany standard") indokolt, mivel a sebészeti mintákból jelentős eredmények állnak rendelkezésre. Ezen túlmenően, amikor ez a próba elindul, a teszt Laboratory Developed Test (LDT) néven lesz kereskedelmi forgalomban.

ADATKEZELÉS ÉS NYILVÁNTARTÁS A vizsgálat befejezése után a tanulmányhoz tartozó összes adatot 15 évig megőrzik a Calgary Center for Clinical Research protokollja szerint.

FINANSZÍROZÁS ÉS BIZTOSÍTÁS A kísérletet a Qualisure Diagnostics, Inc. finanszírozza, szakértői támogatásokkal kiegészítve. A biztosítást a University of Calgary and Alberta Health Services, valamint a Qualisure Diagnostics biztosítja.

KÖZZÉTÉTELI SZABÁLYZAT A klinikai tanulmány eredményeit egy lektorált folyóiratban tesszük közzé, amelyben az összes megnevezett kutató társszerzőként szerepel. Minden finanszírozási forrást elismerünk.

6.0 Ismertesse meg azokat az eljárásokat, kezeléseket vagy tevékenységeket, amelyek felülmúlják vagy kiegészítik a szokásos gyakorlatokat: .

Az egyetlen eltérés a szokásos klinikai ellátástól az FNB intraoperatív mintavétele. A tervezett műtéti beavatkozáshoz képest azonban ez a kockázat kicsi. A fő kockázat a klinikailag jelentős vérzés csekély kockázata, becslések szerint <1%. Mivel a tanulmányhoz semmilyen beavatkozás nem kapcsolódik, nincs terv a nemkívánatos események nyomon követésére.

A műtét során, amikor a pajzsmirigy és a daganat szabaddá válik, a sebész közvetlen látás mellett elvégzi a domináns daganat (azaz: a műtét előtt azonosított elváltozás) FNB-jét. Ez a legpontosabban szimulálja a preoperatív FNB in ​​vivo körülményeit, ugyanakkor korlátozza a perkután biopszia lehetséges technikai bukását (pl.: a lézió nem megfelelő célba vétele).

Egy együttműködő patológus irányításával a daganat egy darabját eltávolítják és gyorsan lefagyasztják, egy szomszédos darabot pedig formalin rögzítéshez és paraffin beágyazáshoz. A szövetet csak akkor bocsátják kutatásra, ha elegendő szövetet vettek diagnosztikai és klinikai felhasználásra.