Overensstemmelse mellem molekylær klassificering baseret på finnålsbiopsi (FNB) og kirurgiske prøver

BAGGRUNDSINFORMATION Kræft i skjoldbruskkirtlen er den 8. mest almindelige kræftform efter prævalens, og forekomsten er steget med >6 % om året siden 1992. Papillær skjoldbruskkirtelkræft (PTC) tegner sig for de fleste thyreoideacancer, og den stigende forekomst af skjoldbruskkirtelkræft kan næsten udelukkende tilskrives en øget påvisning af små PTC'er (1). PTC har normalt en gunstig prognose med høje helbredelsesrater. Imidlertid udviser ca. 10-15% af PTC'er en mere aggressiv adfærd og er ofte resistente over for konventionelle adjuverende terapier såsom radioaktivt jod (2,3). I betragtning af det stigende antal PTC-tilfælde (og den potentielle byrde på sundhedsomkostninger), bliver nøjagtig prognose stadig vigtigere. Nøjagtige estimeringer af prognose og risiko for recidiv vil undgå unødvendigt omfattende operationer, undersøgelser og opfølgning hos personer med en god prognose, og vil rette mere omfattende operationer, adjuverende behandlinger og længerevarende opfølgninger til dem, der har behov for det.

American Thyroid Association (ATA) Risk Stratification System Beslutninger om behandling er informeret af American Thyroid Association (ATA) Risk Stratification System, som estimerer risikoen for sygdomsgentagelse baseret på kliniske og patologiske faktorer. Selvom dette system er blevet retrospektivt valideret af en række undersøgelser, er andelen af ​​forklaret varians suboptimal og varierer fra 19%-34% (4, 5). ATA-systemets manglende evne til fuldt ud at forudsige tilbagefald kan være relateret til dette systems manglende evne til tilstrækkeligt at integrere risikoen forbundet med en tumors molekylære profil. Kun én molekylær markør, BRAFV600E, er i øjeblikket inkorporeret i ATA Risk Stratification System. En anden begrænsning ved ATA Risk Stratification System er, at det kun kan implementeres fuldt ud efter operationen, når alle de kliniske og patologiske data, der er nødvendige for at estimere risikoen, er tilgængelige. På det tidspunkt er der allerede truffet væsentlige behandlingsbeslutninger, og virkningen af ​​operationen er allerede blevet indset af patienten.

Estimering af risiko før behandling: Den nuværende standard for pleje I 2015 rapporterede ATA om kriterier, der kunne bruges til at udvælge patienter til mere konservative operationer såsom thyroidea-lobektomi. Ifølge 2015 ATA-retningslinjerne anses patienter med følgende præoperative kriterier for lav risiko: tumorstørrelse 1 - 4 cm, klinisk node negativ, ingen ekstrathyroidal spredning, ingen familiehistorie med skjoldbruskkirtelkræft og ingen historie med strålebehandling til nakken ( 6). Disse patienter kunne initialt behandles med en thyreoidea-lobektomi (i modsætning til en total thyreoidektomi). Imidlertid vil 40 - 60 % kræve en fuldstændig thyreoidektomi, fordi den postoperative risikostratificering (ved anvendelse af al klinisk og patologisk information tilgængelig efter operationen) klassificerede dem som en højere risiko end oprindeligt estimeret (7-11). I en nylig undersøgelse krævede 51 % af patienterne konvertering til en komplet thyreoidektomi, fordi yderligere risikofaktorer blev genkendt under operationen eller efter den endelige patologi var tilgængelig (12). Dette viser begrænsningerne af de kliniske præoperative risikoestimeringer og behovet for en forbedret metode til præoperativ risikoestimering. Derfor vil skjoldbruskkirtlens cancerkirurger og patienter drage fordel af yderligere information, som vil forfine beslutningen om at udføre lobektomi hos passende patienter, samtidig med at behovet for afsluttet thyreoidektomi minimeres.

Thyroid GuidePx®: Et nyt molekylært risikostratificeringssystem Manglerne ved ATA Risk Stratification System til pålidelig bestemmelse af prognose er blevet rettet ved hjælp af et nyt molekylært risikostratificeringssystem, der omfatter Thyroid GuidePx®-gensignaturen. Ved hjælp af en computersoftwarealgoritme blev transkriptioner (mRNA) forbundet med recidiv og transkripter forbundet med fravær af recidiv identificeret i et træningssæt på 335 patienter med PTC, og derefter valideret i et valideringssæt på 167 patienter. Tumorer inkluderet i datasættet var friskfrosne.

Der var tre molekylære undertyper identificeret baseret på mønsteret for ekspression af prognostiske gener. Disse blev kaldt Type 1, Type 2 og Type 3. Type 3 PTC'er havde den mest aggressive biologi og den højeste forekomst af tilbagefald. Det blev efterfølgende valideret i 124 PTC-patienter fra Korea samt 167 patienter fra Edmonton.

De molekylære undertyper blev betragtet i sammenhæng med tumorstadiet. Specifikt blev tumorer, der måler 1-4 cm i fravær af lymfeknudesygdom (som omfatter patienter, der ville være potentielle kandidater til thyreoidea-lobektomi) separat analyseret fra patienter med mere fremskreden sygdom. Interessant nok havde type 3 PTC'er en høj gentagelsesrate uanset tumorstadiet. Lobektomikandidater med Type 1 og Type 2 PTC'er havde en gentagelsesrate på <3 % (Figur 1A, B, se venligst Protocol_Calgary_July 11, 2023.docx vedhæftet).

Testydelse Den NGS-baserede test, der identificerede den molekylære undertype af PTC, blev kaldt Thyroid GuidePx®. Den kombinerede molekylære og kliniske underklassificering af PTC ved hjælp af Thyroid GuidePx® blev sammenlignet med ATA Risk Stratification System. ATA-risikostratificeringsgrupper blev bestemt af to praktiserende klinikere for hvert tilfælde. For at beregne tidsafhængigt areal under modtagerens driftskarakteristikkurve (AUROC) blev der anvendt en binær klassifikation: lav risiko versus mellem/høj risiko. AUROC blev beregnet baseret på gentagelsesresultater fra TCGA-opdagelseskohorten og Edmonton-kohorten. Den bedste risikostratificeringsydelse blev opnået ved Thyroid GuidePx®-testen i forbindelse med kliniske træk (dvs. tumorstørrelse og lymfeknudepåvirkning). Ved at bruge smoothROCtime-pakken var den 5-årige AUROC 0,80 for Thyroid GuidePx®, når man overvejede tumorstørrelse og lymfeknudestatus, og 0,51 for ATA-risikostratifikationssystemet (Figur 2, se venligst Protocol_Calgary_July 11, 2023.docx vedhæftet).

Thyroid GuidePx®: Assaybeskrivelse Thyroid GuidePx®-testen er en analyse baseret på målrettet hybrid-capture berigelse RNA-sekventering (RNA-Seq). Testinputtet er RNA isoleret fra formalinfikseret paraffinindlejret (FFPE) væv eller finnålsbiopsi (FNB) papillært skjoldbruskkirtelcancerprøver. Biblioteksforberedelse involverer specifik amplifikation af de målrettede regioner af hvert af generne i Thyroid GuidePx®-panelet. Panelet består af 82 gener. De resulterende prøvebiblioteker overføres til en MiSeq/MiSeqDx-reagenspatron, som indeholder alle reagenserne til sekventering. Real-Time Analysis (RTA)-software, som er en komponent i MiSeq/MiSeqDx-sequenceren, giver basisopkald og tilhørende kvalitetsresultater under sekventeringskørslen. FASTQ-filer genereres, der indeholder sekventerings- og kvalitetsoplysninger. FASTQ-filen er et meget brugt tekstbaseret filformat til lagring af nukleotidsekvens for hvert amplikon og dets tilsvarende kvalitetsscore. FASTQ-filerne tjener som input til sekvensjusteringsalgoritmer. Justerede læsninger skrives til filer i BAM-format, som efterfølgende konverteres til læsetællinger og udtryksværdier. Genekspressionsniveauer sendes derefter til algoritmen for at klassificere risikokategorier.

Softwaren klassificerer risiko baseret på ekspressionsmønsteret af grupper af gener i 82-gen Thyroid GuidePx® panelet. Tre molekylære klasser er blevet defineret baseret på en undersøgelse med 502 patientprøver, der forbinder genekspressionsmønsteret med tilbagefaldsfri overlevelse efter 5 år. En højrisikogruppe beriget med BRAFV600E-mutationer; og to molekylære undergrupper med lavere risiko blev identificeret.

Klinisk nytte

Den mere nøjagtige prognosticering fra Thyroid GuidePx® kan påvirke klinikernes behandlingsbeslutninger. Følgende er eksempler på, hvordan klinikere kan anvende de nye oplysninger, der stammer fra Thyroid GuidePx®:

1. PTC med lav risiko kan potentielt behandles med en delvis thyreoidektomi (f.eks. lobektomi) eller endda aktiv overvågning snarere end en total thyreoidektomi. Dette har to store fordele ud over tids- og omkostningsbesparelser. For det første er der en reduktion i det potentielle behov for livslang udskiftning af skjoldbruskkirtelhormon efter en lobektomi. For det andet er der praktisk talt ingen risiko for de potentielt ødelæggende komplikationer ved en total thyreoidektomi, såsom bilateral tilbagevendende larynxnerveskade eller permanent hypoparathyroidisme.
2. Nøjagtig identifikation af lavrisiko-PTC ville også øge egnetheden af ​​adjuverende radioaktivt jod (RAI). RAI-behandling kan resultere i både forbigående og langsigtede bivirkninger såsom spytkirteldysfunktion, ovarie- og testikeldysfunktion og knoglemarvssuppression. RAI-terapi har også en teoretisk risiko for sekundær malignitet: Et estimat er, at 100mCi 131I inducerer 56 maligniteter pr. 10.000 behandlede patienter (15). Det er også omkostningseffektivt at begrænse RAI-terapi til de patienter, der ville opnå forbedringer i den samlede eller sygdomsfrie overlevelse.
3. Overvågning af PTC kan belaste patienter og sundhedsorganisationer af to årsager: PTC diagnosticeres oftest i middelalderen, og patienter overlever ofte i lange perioder efter deres diagnose. Det betyder, at regelmæssige undersøgelser og undersøgelser til tidlig opdagelse af recidiv kan vare i mange år. Opfølgningen omfatter typisk årlig fysisk undersøgelse, serummåling af thyreoideastimulerende hormon og thyroglobulin og periodisk nakke-ultralyd. Patienter med lav risiko kan have øgede intervaller mellem opfølgende undersøgelser og undersøgelser og kan potentielt blive udskrevet fra overvågning.
4. Det er også vigtigt at identificere patienter med høj risiko for tilbagefald nøjagtigt. ATA Risk Stratification System er kendt for at være unøjagtig til at forudsige gentagelse. Hos patienter, der er klassificeret som "lav risiko" ved brug af 2015 ATA Risk Stratification System, udvikler 16% af patienterne til sidst tilbagevendende sygdom (16). Disse patienter kan blive underbehandlet som følge af denne risikoklassificering. Hos patienter, hvor en mere præcis tildeling af høj risiko er tilgængelig, kan mere aggressive behandlinger (dvs. total thyreoidektomi og RAI) eller tilmelding til kliniske forsøg overvejes.

Thyroid GuidePx® af Fine Needle Biopsi Vores undersøgelser er indtil videre blevet udført med kirurgiske prøver, og en kommercielt tilgængelig analyse er blevet fremstillet i dette format. En nylig undersøgelse fra Institute of Health Economics har imidlertid fastslået, at øget omkostningseffektivitet af Thyroid GuidePx® ville blive opnået ved at udføre testen før operationen. Implementering af en test præoperativt vil kræve, at testen fungerer godt ved at bruge prøver afledt af en finnålsbiopsi (FNB).

Skjoldbruskkirtel FNB'er opbevares rutinemæssigt i CytoLyt, et methanolbaseret bufret flydende konserveringsmiddel, i op til 7 dage før overførsel af celler til en ThinPrep til cytologisk evaluering. Vi og andre (17-21) har tidligere fastslået, at kvalitets-DNA og RNA kan udledes fra celler i CytoLyt. Vores nylige feasibility-undersøgelse bestående af 12 patienter med PTC viste, at det er muligt at udføre Thyroid GuidePx® assayet på FNB'er. Hidtil har den tekniske succesrate været 100%, og genniveauoverensstemmelse med kirurgiske prøver overstiger 0,9. Tillid til en begrænset FNB til karakterisering af molekylær sygdom indebærer imidlertid, at prøven er repræsentativ for hele tumoren. Genomisk og transkriptomisk heterogenitet er blevet beskrevet i primære tumorer og metastaser (23). Derfor vil det være vigtigt at dokumentere overensstemmelsen mellem prøver erhvervet af FNB og kirurgiske prøver.

FORSØGSMÅL OG FORMÅL Det generelle formål med undersøgelsen er at bestemme, om den mere begrænsede prøve fra en finnålsbiopsi er tilstrækkelig repræsentativ for den større tumor til at bestemme en gyldig molekylær klassifikation ved hjælp af Thyroid GuidePx®-testen.

Primært mål 1. For at bestemme overensstemmelsen mellem Thyroid GuidePx® molekylære klassifikationer erhvervet fra FNA'er og matchede kirurgiske prøver.

Sekundære mål

1. At sammenligne den tekniske succesrate i at udfylde en gyldig Thyroid GuidePx® ved hjælp af FNA'er og kirurgiske prøver.
2. For at sammenligne udfald af tilbagefald ved brug af ATA-risikostratifikationssystemet i forhold til patienter klassificeret af Thyroid GuidePx® ved hjælp af kirurgiske prøver.
3. For at sammenligne udfald af tilbagefald ved hjælp af ATA-risikostratifikationssystemet vs. patienter klassificeret af Thyroid GuidePx® ved hjælp af FNA-prøver.

PRØVEDESIGN Prøveskema (se venligst Protocol_Calgary_11. juli 2023.docx vedhæftet)

Prøveindsamling og -analyse Patienter vil blive inviteret til at deltage, hvis de har en præoperativ vævsdiagnose af PTC (Bethesda VI) eller mistænkelig for PTC (Bethesda V), og de er berettiget til delvis eller total thyreoidektomi, som beskrevet i inklusions- og eksklusionskriterierne . Efter samtykke vil patienter blive opereret som planlagt af deres kirurg. Demografiske, kliniske og patologiske data vil blive indhentet fra alle deltagere.

Under operationen, når skjoldbruskkirtlen og tumoren blotlægges, vil kirurgen udføre en FNB af den dominerende tumor (dvs.: læsionen identificeret præoperativt) under direkte syn. Dette simulerer tættest in vivo-betingelserne for en præoperativ FNB, men begrænser dog potentielle tekniske fald ved en perkutan biopsi (f.eks. utilstrækkelig målretning af læsionen). Det cellulære materiale afledt af FNB'en vil straks blive lagt i transportmediet (CytoLyt) og derefter nedkølet. Prøver vil blive sendt ugentligt til det centrale laboratorium for RNA-isolering og RNASeq. Samtidig vil FNB-prøver blive undersøgt for tilstedeværelse af tumorceller af en uddannet cytopatolog.

Hvis der er mere end én knude til stede, vil FNB-knuden blive markeret af patologens kirurg. Under ledelse af en samarbejdende patolog vil et stykke af tumoren blive fjernet og snapfrosset, og et tilstødende stykke vil blive taget til formalinfiksering og paraffinindlejring (FFPE). Et H & E-objektglas fra FFPE-prøven skal farves for H & E, og 3 - 6 ufarvede sektioner vil blive forberedt, derefter sendt til det centrale laboratorium for mikrodissektion, RNA-isolering og RNAseq. Denne proces vil følge rutinemæssige prøvebehandlingsprotokoller og vil ikke forstyrre standardmetoder til patologisk diagnose.

Hvis patienter har underskrevet den valgfrie informerede samtykkeformular til biobanking, og hvis der er tilstrækkelig tilbage frosne prøve, vil prøven blive opbevaret med henblik på gentestning (hvis nødvendigt) eller for at understøtte yderligere undersøgelser såsom hel transkriptomanalyse og mutationsanalyse. Brug af disse prøver til disse formål vil kræve yderligere etiske godkendelser.

En forundersøgelse bestående af 12 patienter er allerede afsluttet. Teknisk succesrate med at erhverve prøver og udføre assayet var 100 %, RNA-kvantitet og -kvalitet var fremragende i FNB'er, og der var fremragende genniveaukonkordans i assays udført på FNB'er og kirurgiske prøver.

RNASeq for Thyroid GuidePx® vil blive udført på OncoHelix, et klinisk laboratorium med ekspertise inden for præcision onkologi placeret på Cumming School of Medicine, University of Calgary. Hvis testning ikke kan udføres rettidigt hos OncoHelix, vil prøver blive testet hos Protean BioDiagnostics, et CAP/CLIA-certificeret laboratorium i Orlando, FL, som i øjeblikket udfører testen kommercielt. Risikoklasser vil blive tildelt af software designet af Qualisure Diagnostics ved hjælp af data genereret af RNASeq.

Slutpunkter

Primært slutpunkt:

1. Overensstemmelse, molekylær risikoklassificering af papillær skjoldbruskkirtelkræft FNB'er og matchede frosne kirurgiske prøver

Sekundære endepunkter:

1. Teknisk succesrate i at udfylde en gyldig Thyroid GuidePx® ved hjælp af FNB'er
2. Teknisk succesrate i at udfylde en gyldig Thyroid GuidePx® i FFPE kirurgiske prøver.
3. Biokemisk gentagelsesrate efter 5 år (thyroglobulin ≥ 1 ng/ml, for patienter, som kun havde foretaget en total thyreoidektomi)
4. Strukturel gentagelsesrate ved 5 år

5. Test ydeevne som en prognostisk test, Thyroid GuidePx®: FNB og kirurgiske prøver

   1. Specificitet: andelen af ​​patienter uden strukturelt recidiv forudsagt af testen
   2. Sensitivitet: testens evne til at identificere individer, hvis sygdom vil gentage sig inden for 5 år (andel af forudsagte strukturelle gentagelser)
   3. AUROC
   4. Positiv prædiktiv værdi
   5. Negativ forudsigelsesværdi

6. Ydeevne, ATA Risk Stratification

   1. Specificitet: andelen af ​​patienter uden strukturelt recidiv forudsagt af testen
   2. Sensitivitet: testens evne til at identificere individer, hvis sygdom vil gentage sig inden for 5 år (andel af forudsagte strukturelle gentagelser)
   3. AUROC
   4. Positiv prædiktiv værdi
   5. Negativ forudsigelsesværdi

Blindning og begrænsning af bias Kun prøver med tilstrækkelig RNA-kvalitet (DV200>30) vil blive inkluderet i analysen. Kun FNB'er indeholdende tumorceller ("cytologipositive") vil blive inkluderet i konkordansberegningen. RNASeq vil blive udført af en tekniker, der er blindet for eventuelle kliniske detaljer. Teknikeren vil specifikt ikke være i stand til at identificere matchede prøver fra kirurgiske prøver og FNB'er. Molekylær klassificering vil blive udført på en blind måde. Data vil blive overvåget af et uafhængigt dataovervågningsudvalg. Dataovervågningsudvalget, der består af mindst tre personer inklusive en statistiker, vil overvåge dataanalysen.

Stopregler I vores kirurgiske prøver havde inter-batch- og intra-batch-gentagelser konsekvent en genniveaukonkordans på >0,9. Genniveauoverensstemmelse mellem cytologipositiv FNB og frosne kirurgiske prøver ("guldstandarden") vil blive overvåget for hver batch på 24 patienter. Hvis R<0,9, holder vi pause for at revurdere den analytiske arbejdsgang og instrumentering. Hvis konkordansen er vedvarende under 0,9 efter 72 patienter, stopper vi med at evaluere FNB'er, men vi vil fortsætte med at teste kirurgiske prøver. Da dette ikke er en højrisikoundersøgelse, har vi ikke til hensigt at afslutte forsøget før tid. Selvom der er lav overensstemmelse mellem FNB og kirurgiske prøver, vil data fra undersøgelse af resultater i relation til molekylær klassificering (i kirurgiske prøver) være nyttige.

UDVÆLGELSE OG TILBAGETRÆKNING AF EMNE Inklusionskriterier

1. Alder ≥ 18 år
2. En diagnose af papillær skjoldbruskkirtelkræft baseret på en finnålsbiopsi (FNB) fortolket som en Bethesda V- eller VI-cytologi
3. Tumorstørrelse > 1 cm i maksimal diameter
4. Patienten er en operativ kandidat
5. Patienten har givet samtykke

Eksklusionskriterier

1. Familiehistorie med skjoldbruskkirtelkræft
2. Historie om stråling til nakken
3. Ude af stand til eller vil ikke have en finnålsbiopsi
4. Uvillig til at gennemgå thyreoidektomi
5. Endelig patologi viser ikke papillær skjoldbruskkirtelkræft
6. Tilfælde, hvor der ikke er en klar dominerende knude
7. Tilfælde, hvor der er flere knuder, der udelukker prøveudtagning af en defineret knude

Kriterier for tilbagetrækning af forsøgspersoner. Emner kan til enhver tid afbryde deltagelse ved at underrette en af ​​efterforskerne eller forskningspersonalet. Data indsamlet før tilbagetrækning vil blive brugt til analyse, men der vil ikke blive indsamlet yderligere data efter tilbagetrækning. Efter anmodning fra forsøgspersonen kan prøver udtages inden testning. Emner vil blive erstattet, hvis prøverne ikke er blevet testet af RNASeq (Thyroid GuidePx®).

BEHANDLING AF EMNE Den molekylære klassificering og gentagelsesrisiko bestemt af Thyroid GuidePx® vil blive oplyst til lægen og til patienten. Gentagelsesrisiko er baseret på kumulative valideringsdata, herunder tilfælde fra Alberta og Australien. Kun resultaterne af den frosne kirurgiske prøve ("guldstandarden") vil blive afsløret. Som det er sædvanlig standard, vil behandlingsbeslutninger blive truffet af lægen i samarbejde med patienten, baseret på en syntese af al tilgængelig klinisk information. Dette kliniske forsøg definerer ikke en behandlingsvej. Opfølgningsfrekvens og varighed vil ikke blive ordineret i henhold til protokol og vil blive bestemt af den behandlende læge. Dette er en ikke-interventionsundersøgelse, og derfor vil overholdelsen ikke blive overvåget.

VURDERING AF EFFEKTIVITET Et sekundært resultat er testpræstation for at stratificere risikoen for gentagelse. Testydeevne vil blive sammenlignet i prøver erhvervet af FNB og kirurgiske prøver, derefter sammenlignet med den nuværende standard for pleje (ATA-risikostratificeringssystemet). Tiden til tilbagefald vil blive målt fra tidspunktet for fuldstændig indledende behandling. Hos patienter med mikroskopisk sygdom, der er tilbage efter operationen, vil tiden til tilbagefald blive målt fra afslutningen af ​​den terapeutiske dosis af radioaktivt jod. Tilbagevendende hændelser vil blive defineret baseret på 2016 American Thyroid Association retningslinjer.

Følgende kriterier vil betegne en sygdomsfri status efter terapi: (i) ingen klinisk tegn på tumor; (ii) ingen tegn på tumor på radioaktiv jod-billeddannelse og/eller cervikal ultralyd; (iii) for post-total thyreoidektomi, ustimuleret serum-thyroglobulin (Tg) <0,2 ng/ml; for post-lobektomi, ustimuleret Tg<30. Et ubestemt respons på terapi vil blive defineret som: (i) ingen klinisk tegn på tumor; (ii) ingen tegn på tumor på radioaktiv jod-billeddannelse og/eller cervikal ultralyd; (iii) for post-total thyreoidektomi, ustimuleret Tg 0,2 - 1; for post-lobektomi, Tg>30. Efter en total thyreoidektomi defineres en biokemisk ufuldstændig respons som Tg>1 i fravær af strukturel sygdom. Tg-værdier er kun pålidelige i fravær af interfererende antistoffer (TgAb) (6).

Sygdom vil blive defineret som et sandt recidiv, hvis en patient tidligere har haft et upåviselig Tg i fravær af TgAb og en negativ nakke-ultralydsundersøgelse inden for 1 år efter den tidligere operation. Vedvarende sygdom vil blive defineret som Tg større end ovennævnte tærskler, en unormal nakke-ultralyd, vedvarende forhøjede niveauer af TgAb eller tilstedeværelse af fjernmetastaser.

Patienter med vedvarende sygdom og/eller metastatisk sygdom (ikke-kurativ resektion) vil ikke indgå i beregningen af ​​recidivfri overlevelse.

VURDERING AF SIKKERHED Den eneste afvigelse fra standard klinisk behandling er FNB's intraoperative udtagning af prøve. Men i forhold til det planlagte kirurgiske indgreb er denne risiko lille. Den største risiko er en lille risiko for klinisk signifikant blødning, estimeret til <1 %. Da der ikke vil være nogen intervention forbundet med denne undersøgelse, er der ingen plan for overvågning af bivirkninger.

STATISTIK Optimering af RNASeq-betingelser for prøver i CytoLyt RNA vil blive isoleret fra FNB'er i CytoLyt i henhold til SOP. RNA-mængden vil blive vurderet af NanoDrop, og kvaliteten vil blive kvantificeret af DV200. RNASeq vil blive udført i CytoLyt prøver og matchede frosne prøver ved varierende læsedybder. I parrede CytoLyt- og FFPE-væv vil assay-metrikker blive evalueret som en funktion af input-vævsopbevaringsmetode, RNA-kvalitet (DV200) og opbevaringstid. Genekspression vil blive sammenlignet i parret CytoLyt og frosne væv, derefter korreleret mellem betingelser. Det vigtigste resultat, molekylær klassetildeling, vil blive sammenlignet i parvise prøver.

Følgende præstationsmålinger vil blive evalueret for hvert eksperiment, baseret på College of American Pathologists (CAP) tjekliste over krav, der er specifikke for næste generations sekvensering:

Assay-metrik

a) RNASeq-målinger: (i) Læst tællinger (total læsninger, unikke læsninger, duplikatlæsninger, rRNA-læsninger, strengspecificitet); (ii) Dækning (antal aflæsninger, der dækker en given genomisk position): gennemsnitlig dækning, gennemsnitlig variationskoefficient, 5'/3' dækning, huller i dækning, GC bias (iii) Ekspressionskorrelation (målte ekspressionsniveauer vs. kendte niveauer af ERCC interne standarder) b) Individuel gendetektion: (i) Analytisk sensitivitet: brøkdel af tilfælde, hvor hvert gen i den interne ERCC-standard er korrekt identificeret.

(ii) Analytisk specificitet: evne til at identificere fraværet af generne, der omfatter den interne ERCC-standard (iii) Nøjagtighed: sensitivitet + specificitet

Sammenligning af molekylær risikostratificering (Thyroid GuidePx®) bestemt i FNB-prøver og i kirurgiske prøver. Patienter med en endelig patologi, som ikke viser papillær thyreoideacancer, vil blive udelukket fra konkordansanalyse. Tilsvarende vil FNB-prøver, der er cytologinegative, blive udelukket fra konkordansanalyse. Den molekylære klassetildeling vil blive sammenlignet mellem prøver opnået af FNB og matchede frosne kirurgiske prøver. Kirurgiske prøver vil blive betragtet som guldstandarden. Kappa-statistikken vil blive brugt til at bestemme signifikansen af ​​overensstemmelse mellem de to prøvetyper.

Risikolag vil blive tildelt på en blind måde ved hjælp af Thyroid GuidePx® og ATA Risk Stratification System. Strukturelle og biokemiske gentagelsesrater efter 5 år vil blive sammenlignet for hver risikoklasse. Et binært testresultat, betinget af sygdomsstatus (strukturelt tilbagefald), vil blive brugt til at vurdere testens nøjagtighed. Strukturel gentagelse repræsenterer guldstandarden. En 2-sidet McNemar-test for to afhængige proportioner vil blive brugt til at evaluere følsomheden og specificiteten af ​​hver metode til risikostratificering, med Holms justering for multiplicitet for at vurdere hver enkelt nøjagtighedsmål separat.

Ydeevne af Thyroid GuidePx®

Ud fra undersøgelserne beskrevet ovenfor vil ydeevnen af ​​Thyroid GuidePx® blive vurderet separat i FNB-prøver og kirurgiske prøver. Ydeevneegenskaberne vil blive vurderet som følger:

1. Tidsafhængig AUROC (areal under modtagerens operatørkurve) (24). Med henblik på beregningerne er tærskelniveauet for en positiv test en betegnelse for mellem- eller højrisiko (da det forventes, at en mellemrisikotildeling vil resultere i væsentligt forskellige kliniske beslutninger).
2. Sensitivitet: beregnet som kumulativ følsomhed efter 5 år, som beskrevet af Kamarudin og Kolamunnage-Dona (24)
3. Specificitet: beregnet som dynamisk specificitet, som beskrevet af Kamarudin og Kolamunnage-Dona (24)

Prøvestørrelsesberegning Vi vil sammenligne den molekylære risikotildeling fra kirurgiske prøver og matchede FNB'er fra 109 patienter. Et minimumsniveau af konkordans, der er klinisk acceptabelt, er 80%. Prøvestørrelsesberegninger var baseret på Lin's Kappa-statistikken for overensstemmelse mellem de to mål for tre molekylære undergrupper (25). En tosidet hypotese blev anvendt med et signifikansniveau på 0,05, og effekt blev fastsat til 90%. Molekylære undergruppestørrelser blev fastsat til 23 % (Type 1), 49 % (Type 2) og 28 % (Type 3). Hvis nulhypotesen er, at niveauet af overensstemmelse mellem FNB og kirurgiske prøver er 0,6, så ville vi være i stand til at detektere et niveau af overensstemmelse på 0,8 eller højere med 109 patienter. En konkordans på 0,90 ville være påviselig med 40 patienter, der antager det samme nulniveau for enighed.

Omkring 25 % af patienterne med Bethesda V-cytologi og omkring 5 % af patienterne med en Bethesda VI-cytologi vil have benign sygdom. Derudover er RNASeq-kvaliteten i ca. 5 % af tilfældene utilstrækkelig i FFPE-prøver. Ud fra dette planlægger vi et frafald på 20 %. Derfor er forsøget designet til at omfatte 130 patienter.

DIREKTE ADGANG TIL KILDEDATA/DOKUMENTER Det kliniske forsøgssted vil tillade forsøgsrelateret overvågning, audits, REB-gennemgang og reguleringsinspektion(er), hvilket giver direkte adgang til kildedata/dokumenter.

Kliniske forsøgsaudits udføres for at give sikkerhed for, at patienternes rettigheder, sikkerhed og velvære er ordentligt beskyttet, for at vurdere overholdelse af protokollen, processerne og aftalerne, ICH Good Clinical Practice-standarder og gældende lovkrav og for at vurdere kvaliteten af ​​data.

Ethvert nationalt tilsynsorgan kan til enhver tid komme for at auditere eller inspicere undersøgelsesstedet. Denne revision består af interviews med hovedefterforskeren og undersøgelsesteamet, gennemgang af dokumentation og praksis, gennemgang af faciliteter, udstyr og verifikation af kildedata.

Investigatoren vil give ethvert nationalt tilsynsorgan direkte adgang til papir- og/eller elektronisk dokumentation vedrørende det kliniske studie (f.eks. CRF'er, kildedokumenter såsom hospitalspatientdiagrammer og investigator-undersøgelsesfiler). Alle faciliteter på stedet, der er relateret til undersøgelsens gennemførelse, kunne besøges under en audit (f.eks. laboratorium, ambulatorium). Efterforskeren indvilliger i at samarbejde og yde assistance på rimelige tidspunkter og steder med hensyn til enhver revisionsaktivitet.

KVALITETSKONTROL OG KVALITETSSIKRING Den primære investigator vil sikre, at alle undersøgelsesmedlemmer følger protokollen og overholder regulatoriske standarder og standarder for god klinisk praksis. Alle kliniske forsøgssteder vil tillade forsøgsrelateret overvågning, audits, REB-gennemgang og reguleringsinspektion(er), hvilket giver direkte adgang til kildedata/dokumenter.

Dataovervågningsudvalget (DMC) vil mødes under gennemførelsen af ​​forsøget som følger: 1. Ved forsøgsinitiering at færdiggøre DMC-chartret; 2. Efter at 24 deltagere er blevet tilmeldt; 3. Efter 72 deltagere er blevet tilmeldt; og 4. efter afslutning af indskrivning.

ETIK Den ansvarlige efterforsker vil sikre, at denne undersøgelse udføres i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen. Denne undersøgelse vil blive udført i henhold til canadiske og internationale standarder for god klinisk praksis for alle undersøgelser, herunder ICH's harmoniserede trepartsretningslinjer for god klinisk praksis. Gældende regeringsbestemmelser, NNHPD retningslinjer for kliniske forsøg og Alberta Health Services forskningspolitikker og procedurer vil også blive fulgt.

Denne protokol og eventuelle ændringer vil blive indsendt til HREBA-CC til formel godkendelse til at udføre undersøgelsen. HREBA-CC's beslutning om gennemførelsen af ​​undersøgelsen vil blive truffet skriftligt til investigator.

Afsløring af molekylær risikoklassificering fra kirurgiske prøver ("guldstandarden") er berettiget, da der er betydelige udfaldsdata fra kirurgiske prøver. Når dette forsøg lanceres, vil testen desuden være kommercielt tilgængelig som en Laboratory Developed Test (LDT).

DATAHÅNDTERING OG REGISTRERING Når undersøgelsen er afsluttet, vil alle data for denne undersøgelse blive opbevaret i 15 år, gemt i henhold til protokollen på Calgary Center for Clinical Research.

FINANSIERING OG FORSIKRING Forsøget vil blive finansieret af Qualisure Diagnostics, Inc., suppleret med peer-reviewede bevillinger. Forsikring vil blive leveret af University of Calgary og Alberta Health Services, samt Qualisure Diagnostics.

PUBLIKATIONSPOLITIK Resultaterne fra dette kliniske studie vil blive offentliggjort i et peer-reviewed tidsskrift med alle navngivne efterforskere som medforfattere. Alle finansieringskilder vil blive anerkendt.

6.0 Beskriv procedurer, behandling eller aktiviteter, der ligger over eller ud over standardpraksis: .

Den eneste afvigelse fra standard klinisk behandling er FNB's intraoperative udtagning af prøve. Men i forhold til det planlagte kirurgiske indgreb er denne risiko lille. Den største risiko er en lille risiko for klinisk signifikant blødning, estimeret til <1 %. Da der ikke vil være nogen intervention forbundet med denne undersøgelse, er der ingen plan for overvågning af bivirkninger.

Under operationen, når skjoldbruskkirtlen og tumoren blotlægges, vil kirurgen udføre en FNB af den dominerende tumor (dvs.: læsionen identificeret præoperativt) under direkte syn. Dette simulerer tættest in vivo-betingelserne for en præoperativ FNB, men begrænser dog potentielle tekniske fald ved en perkutan biopsi (f.eks. utilstrækkelig målretning af læsionen).

Under ledelse af en samarbejdende patolog vil et stykke af tumoren blive fjernet og snapfrosset, og et tilstødende stykke vil blive taget til formalinfiksering og paraffinindstøbning. Væv vil først blive frigivet til forskning, når der er taget tilstrækkeligt væv til diagnostisk og klinisk brug.