Konkordans av molekylær klassifisering basert på finnålsbiopsi (FNB) og kirurgiske prøver

BAKGRUNNSINFORMASJON Skjoldbruskkjertelkreft er den 8. vanligste kreftformen etter prevalens, og forekomsten har økt med >6 % per år siden 1992. Papillær skjoldbruskkjertelkreft (PTC) står for de fleste kreft i skjoldbruskkjertelen, og den økende forekomsten av skjoldbruskkjertelkreft kan nesten utelukkende tilskrives økt påvisning av små PTC (1). PTC har vanligvis en gunstig prognose med høye helbredelsesrater. Imidlertid viser omtrent 10-15 % av PTC en mer aggressiv atferd og er ofte resistente mot konvensjonelle adjuvante terapier som radioaktivt jod (2,3). Gitt det økende antallet PTC-tilfeller (og den potensielle belastningen på helsekostnader), blir nøyaktig prognose stadig viktigere. Nøyaktige estimeringer av prognose og risiko for residiv vil unngå unødvendig omfattende operasjoner, undersøkelser og oppfølging hos personer med god prognose, og vil rette mer omfattende kirurgi, adjuvante terapier og langvarig oppfølging til de som trenger det.

American Thyroid Association (ATA) Risk Stratification System Beslutninger om behandling er informert av American Thyroid Association (ATA) Risk Stratification System, som estimerer risikoen for tilbakefall av sykdom basert på kliniske og patologiske faktorer. Selv om dette systemet er retrospektivt validert av en rekke studier, er andelen av varians forklart suboptimal og varierer fra 19 %-34 % (4, 5). At ATA-systemets manglende evne til å forutsi tilbakefall fullt ut kan være relatert til at dette systemet ikke har tilstrekkelig integrert risikoen forbundet med en svulsts molekylære profil. Bare én molekylær markør, BRAFV600E, er for tiden integrert i ATA Risk Stratification System. En annen begrensning ved ATA Risk Stratification System er at det bare kan implementeres fullt ut etter operasjon, når alle de kliniske og patologiske dataene som kreves for å estimere risiko er tilgjengelige. På det tidspunktet er det allerede tatt betydelige behandlingsbeslutninger og virkningen av kirurgi er allerede innsett av pasienten.

Estimering av risiko før behandling: Den nåværende omsorgsstandarden I 2015 rapporterte ATA om kriterier som kan brukes til å velge pasienter for mer konservative operasjoner som skjoldbruskkjertellobektomi. I henhold til ATA-retningslinjene for 2015 anses pasienter med følgende preoperative kriterier som lav risiko: tumorstørrelse 1 - 4 cm, klinisk node negativ, ingen ekstrathyroidal spredning, ingen familiehistorie med skjoldbruskkjertelkreft og ingen historie med strålebehandling mot nakken ( 6). Disse pasientene kan i utgangspunktet behandles med en skjoldbrusk-lobektomi (i motsetning til en total tyreoidektomi). Imidlertid vil 40 - 60 % kreve en komplett tyreoidektomi fordi den postoperative risikostratifiseringen (ved bruk av all klinisk og patologisk informasjon tilgjengelig etter operasjonen) klassifiserte dem som en høyere risiko enn først anslått (7-11). I en nylig studie krevde 51 % av pasientene konvertering til en komplett tyreoidektomi fordi ytterligere risikofaktorer ble gjenkjent under operasjonen eller etter at endelig patologi var tilgjengelig (12). Dette demonstrerer begrensningene ved de kliniske preoperative risikoestimeringene, og behovet for en forbedret metode for preoperativ risikoestimering. Derfor vil skjoldbruskkjertelkreftkirurger og pasienter dra nytte av tilleggsinformasjon som vil avgrense beslutningen om å utføre lobektomi hos passende pasienter, samtidig som behovet for fullført tyreoidektomi minimeres.

Thyroid GuidePx®: Et nytt molekylært risikostratifiseringssystem Manglene ved ATA Risk Stratification System for pålitelig å bestemme prognose har blitt løst ved å bruke et nytt molekylært risikostratifiseringssystem som omfatter Thyroid GuidePx®-gensignaturen. Ved hjelp av en dataprogramvarealgoritme ble transkripsjoner (mRNA) assosiert med residiv og transkripsjoner assosiert med fravær av tilbakefall identifisert i et treningssett med 335 pasienter med PTC, deretter validert i et valideringssett med 167 pasienter. Tumorer inkludert i datasettet var ferskfrosne.

Det ble identifisert tre molekylære subtyper basert på uttrykksmønsteret til prognostiske gener. Disse ble kalt Type 1, Type 2 og Type 3. Type 3 PTC-er hadde den mest aggressive biologien og den høyeste frekvensen av tilbakefall. Den ble deretter validert i 124 PTC-pasienter fra Korea samt 167 pasienter fra Edmonton.

De molekylære subtypene ble vurdert i sammenheng med tumorstadiet. Spesifikt ble svulster som målte 1 - 4 cm i fravær av lymfeknutesykdom (som omfatter pasienter som ville være potensielle kandidater for thyreoidealobektomi) analysert separat fra pasienter med mer avansert sykdom. Interessant nok hadde type 3 PTC en høy tilbakefallsrate uavhengig av tumorstadiet. Lobektomikandidater med type 1 og type 2 PTC hadde en gjentakelsesrate på <3 % (Figur 1A, B, se Protocol_Calgary_11. juli 2023.docx vedlagte).

Testytelse Den NGS-baserte testen som identifiserte den molekylære subtypen av PTC ble kalt Thyroid GuidePx®. Den kombinerte molekylære og kliniske underklassifiseringen av PTC ved bruk av Thyroid GuidePx® ble sammenlignet med ATA Risk Stratification System. ATA-risikostratifiseringsgrupper ble bestemt av to praktiserende klinikere for hvert tilfelle. For å beregne tidsavhengig areal under mottakerens driftskarakteristiske kurve (AUROC), ble det brukt en binær klassifisering: lav risiko versus middels/høy risiko. AUROC ble beregnet basert på tilbakefallsresultater fra TCGA-oppdagelseskohorten og Edmonton-kohorten. Den beste risikostratifiseringsytelsen ble oppnådd ved Thyroid GuidePx®-testen i forbindelse med kliniske egenskaper (dvs. tumorstørrelse og lymfeknutepåvirkning). Ved bruk av smoothROCtime-pakken var 5-års AUROC 0,80 for Thyroid GuidePx® når man vurderer tumorstørrelse og lymfeknutestatus, og 0,51 for ATA-risikostratifiseringssystemet (Figur 2, se Protocol_Calgary_11. juli 2023.docx vedlagte).

Thyroid GuidePx®: Analysebeskrivelse Thyroid GuidePx®-testen er en analyse basert på målrettet hybrid-fangst berikende RNA-sekvensering (RNA-Seq). Testinndata er RNA isolert fra formalinfiksert parafininnstøpt (FFPE) vev eller finnålsbiopsi (FNB) papillær skjoldbruskkreftprøver. Bibliotekforberedelse innebærer spesifikt amplifisering av målregionene til hvert av genene i Thyroid GuidePx®-panelet. Panelet består av 82 gener. De resulterende prøvebibliotekene overføres til en MiSeq/MiSeqDx-reagenskassett som inneholder alle reagensene for sekvensering. Sanntidsanalyse-programvare (RTA), som er en komponent i MiSeq/MiSeqDx-sequenceren, gir basisanrop og tilhørende kvalitetspoeng under sekvenseringskjøringen. FASTQ-filer genereres som inneholder sekvenserings- og kvalitetsinformasjon. FASTQ-filen er et mye brukt tekstbasert filformat for lagring av nukleotidsekvens for hvert amplikon og dets tilsvarende kvalitetspoeng. FASTQ-filene fungerer som input for sekvensjusteringsalgoritmer. Justerte lesninger skrives til filer i BAM-format som deretter konverteres til lesetellinger og uttrykksverdier. Genekspresjonsnivåer sendes deretter til algoritmen for å klassifisere risikokategorier.

Programvaren klassifiserer risiko basert på uttrykksmønsteret til grupper av gener i 82-gen Thyroid GuidePx®-panelet. Tre molekylære klasser er definert basert på en studie med 502 pasientprøver som assosierer mønsteret av genuttrykk med residivfri overlevelse ved 5 år. En høyrisikogruppe beriket med BRAFV600E-mutasjoner; og to molekylære undergrupper med lavere risiko ble identifisert.

Klinisk verktøy

Den mer nøyaktige prognosen gitt av Thyroid GuidePx® kan påvirke klinikeres behandlingsbeslutninger. Følgende er eksempler på hvordan klinikere kan bruke den nye informasjonen hentet fra Thyroid GuidePx®:

1. PTC med lav risiko kan potensielt behandles med en delvis tyreoidektomi (f.eks. lobektomi) eller til og med aktiv overvåking, i stedet for en total tyreoidektomi. Dette har to store fordeler i tillegg til tids- og kostnadsbesparelser. For det første er det en reduksjon i det potensielle behovet for livslang erstatning av skjoldbruskkjertelhormon etter en lobektomi. For det andre er det praktisk talt ingen risiko for potensielt ødeleggende komplikasjoner ved en total tyreoidektomi som bilateral tilbakevendende larynxnerveskade eller permanent hypoparathyroidisme.
2. Nøyaktig identifisering av lavrisiko-PTC vil også øke hensiktsmessigheten av adjuvant radioaktivt jod (RAI). RAI-behandling kan resultere i både forbigående og langsiktige bivirkninger som spyttkjerteldysfunksjon, ovarie- og testikkeldysfunksjon og benmargssuppresjon. RAI-terapi har også en teoretisk risiko for sekundær malignitet: et estimat er at 100mCi 131I induserer 56 maligniteter per 10 000 behandlede pasienter (15). Det er også kostnadseffektivt å begrense RAI-terapi til de pasientene som vil oppnå forbedring i total eller sykdomsfri overlevelse.
3. Overvåking av PTC kan legge en belastning på pasienter og helseorganisasjoner av to årsaker: PTC diagnostiseres oftest i middelalder, og pasienter overlever ofte i lange perioder etter diagnosen. Det betyr at regelmessig undersøkelse og undersøkelser for tidlig oppdagelse av residiv kan pågå i mange år. Oppfølging omfatter typisk årlig fysisk undersøkelse, serummåling av thyreoideastimulerende hormon og tyroglobulin, og periodisk nakkeultralyd. Pasienter med lav risiko kan ha økte intervaller mellom oppfølgingsundersøkelser og undersøkelser, og kan potensielt bli utskrevet fra overvåking.
4. Det er også viktig å nøyaktig identifisere pasienter med høy risiko for tilbakefall. ATA Risk Stratification System er kjent for å være unøyaktig når det gjelder å forutsi gjentakelse. Hos pasienter klassifisert som «lav risiko» ved bruk av ATA Risk Stratification System fra 2015, utvikler 16 % av pasientene til slutt tilbakevendende sykdom (16). Disse pasientene kan bli underbehandlet som følge av denne risikoklassifiseringen. Hos pasienter der en mer nøyaktig tildeling av høy risiko er tilgjengelig, kan mer aggressive behandlinger (dvs. total tyreoidektomi og RAI) eller deltakelse i kliniske studier vurderes.

Thyroid GuidePx® av Fine Needle Biopsi Våre studier har så langt blitt utført med kirurgiske prøver, og en kommersielt tilgjengelig analyse er produsert i dette formatet. Imidlertid har en fersk studie fra Institute of Health Economics fastslått at økt kostnadseffektivitet av Thyroid GuidePx® ville oppnås ved å utføre testen før operasjonen. Implementering av en test preoperativt vil kreve at testen gir gode resultater ved å bruke prøver avledet fra en finnålsbiopsi (FNB).

Skjoldbrusk FNB-er lagres rutinemessig i CytoLyt, et metanolbasert bufret flytende konserveringsmiddel, i opptil 7 dager før overføring av celler til en ThinPrep for cytologisk evaluering. Vi og andre (17-21) har tidligere fastslått at kvalitets-DNA og RNA kan utledes fra celler i CytoLyt. Vår nylige mulighetsstudie bestående av 12 pasienter med PTC viste at det er mulig å utføre Thyroid GuidePx®-analysen på FNB. Så langt har den tekniske suksessraten vært 100 %, og gennivåkonkordansen med kirurgiske prøver overstiger 0,9. Imidlertid innebærer avhengighet av en begrenset FNB for karakterisering av molekylær sykdom at prøven er representativ for hele svulsten. Genomisk og transkriptomisk heterogenitet er beskrevet i primærtumorer og metastaser (23). Derfor vil det være viktig å dokumentere samsvar mellom prøver innhentet av FNB og kirurgiske prøver.

FORSØKSMÅL OG FORMÅL Den generelle hensikten med studien er å bestemme om den mer begrensede prøven fra en finnålsbiopsi er tilstrekkelig representativ for den større svulsten til å bestemme en gyldig molekylær klassifisering ved å bruke Thyroid GuidePx®-testen.

Primært mål 1. For å bestemme samsvaret mellom Thyroid GuidePx® molekylære klassifikasjoner innhentet fra FNAer og samsvarende kirurgiske prøver.

Sekundære mål

1. For å sammenligne den tekniske suksessraten for å fullføre en gyldig Thyroid GuidePx® ved bruk av FNA-er og kirurgiske prøver.
2. For å sammenligne residivutfall ved bruk av ATA-risikostratifiseringssystemet vs. pasienter klassifisert av Thyroid GuidePx® ved bruk av kirurgiske prøver.
3. For å sammenligne residivutfall ved bruk av ATA-risikostratifiseringssystemet vs. pasienter klassifisert av Thyroid GuidePx® ved bruk av FNA-prøver.

PRØVEDESIGN Prøveskjema (se Protocol_Calgary_11. juli 2023.docx vedlagte)

Prøveinnsamling og -analyse Pasienter vil bli invitert til å delta hvis de har en preoperativ vevsdiagnose av PTC (Bethesda VI) eller mistenkelig for PTC (Bethesda V), og de er kvalifisert for delvis eller total tyreoidektomi, som beskrevet i inklusjons- og eksklusjonskriteriene . Etter samtykke vil pasienter gjennomgå kirurgi som planlagt av kirurgen. Demografiske, kliniske og patologiske data vil bli innhentet fra alle deltakere.

Under operasjonen, når skjoldbruskkjertelen og svulsten er eksponert, vil kirurgen utføre en FNB av den dominerende svulsten (dvs.: lesjonen identifisert preoperativt), under direkte syn. Dette simulerer nærmest in vivo-forholdene til en preoperativ FNB, men begrenser likevel potensielle tekniske fall av en perkutan biopsi (f.eks. utilstrekkelig målretting av lesjonen). Det cellulære materialet avledet fra FNB vil umiddelbart bli lagt i transportmediet (CytoLyt), og deretter nedkjølt. Prøver vil bli sendt ukentlig til sentrallaboratoriet for RNA-isolering og RNAseq. Samtidig vil FNB-prøver undersøkes for tilstedeværelse av tumorceller av en utdannet cytopatolog.

Hvis mer enn én knute er tilstede, vil FNB-knuten merkes av kirurgen for patologen. Under ledelse av en samarbeidende patolog vil en del av svulsten bli fjernet og hurtigfryst, og en tilstøtende del vil bli tatt for formalinfiksering og parafininnstøping (FFPE). Ett H & E-objektglass fra FFPE-prøven som skal farges for H & E, og 3 - 6 ufargede seksjoner vil bli klargjort, og deretter sendt til sentrallaboratoriet for mikrodisseksjon, RNA-isolering og RNAseq. Denne prosessen vil følge rutinemessige prøvebehandlingsprotokoller og vil ikke forstyrre standard metoder for patologisk diagnose.

Hvis pasienter har signert det valgfrie informerte samtykkeskjemaet for biobanking, hvis det er nok gjenværende frosset prøve, vil prøven bli beholdt med det formål å teste på nytt (hvis nødvendig) eller for å støtte ytterligere studier som hel transkriptomanalyse og mutasjonsanalyse. Bruk av disse prøvene til disse formålene vil kreve ytterligere etikkgodkjenninger.

En mulighetsstudie bestående av 12 pasienter er allerede gjennomført. Teknisk suksessrate i å innhente prøver og utføre analysen var 100 %, RNA-mengde og -kvalitet var utmerket i FNB-er, og det var utmerket gennivåkonkordans i analyser utført på FNB-er og kirurgiske prøver.

RNASeq for Thyroid GuidePx® vil bli utført ved OncoHelix, et klinisk laboratorium med ekspertise innen presisjonsonkologi lokalisert ved Cumming School of Medicine, University of Calgary. Hvis testing ikke kan utføres i tide hos OncoHelix, vil prøvene bli testet ved Protean BioDiagnostics, et CAP/CLIA-sertifisert laboratorium i Orlando, FL som for tiden utfører testen kommersielt. Risikoklasser vil bli tildelt av programvare utviklet av Qualisure Diagnostics ved å bruke dataene generert av RNASeq.

Endepunkter

Primært endepunkt:

1. Konkordans, molekylær risikoklassifisering av papillær skjoldbruskkjertelkreft FNB og matchede frosne kirurgiske prøver

Sekundære endepunkter:

1. Teknisk suksessrate i å fullføre en gyldig Thyroid GuidePx® ved bruk av FNB-er
2. Teknisk suksessrate i å fullføre en gyldig Thyroid GuidePx® i FFPE kirurgiske prøver.
3. Biokjemisk residivrate ved 5 år (tyreoglobulin ≥ 1 ng/ml, kun for pasienter som hadde total tyreoidektomi)
4. Strukturell gjentakelsesrate ved 5 år

5. Testytelse som en prognostisk test, Thyroid GuidePx®: FNB og kirurgiske prøver

   1. Spesifisitet: andelen pasienter uten strukturelt residiv forutsagt av testen
   2. Sensitivitet: testens evne til å identifisere individer hvis sykdom vil gjenta seg innen 5 år (andel av strukturelle tilbakefall spådd)
   3. AUROC
   4. Positiv prediktiv verdi
   5. Negativ prediktiv verdi

6. Ytelse, ATA-risikostratifisering

   1. Spesifisitet: andelen pasienter uten strukturelt residiv forutsagt av testen
   2. Sensitivitet: testens evne til å identifisere individer hvis sykdom vil gjenta seg innen 5 år (andel av strukturelle tilbakefall spådd)
   3. AUROC
   4. Positiv prediktiv verdi
   5. Negativ prediktiv verdi

Blinding og begrensning av skjevhet Kun prøver med tilstrekkelig RNA-kvalitet (DV200>30) vil bli inkludert i analysen. Kun FNB-er som inneholder tumorceller ("cytologipositive") vil bli inkludert i konkordansberegningen. RNASeq vil bli utført av en tekniker som er blindet for eventuelle kliniske detaljer. Teknikeren vil spesifikt ikke kunne identifisere samsvarende prøver fra kirurgiske prøver og FNB-er. Molekylær klassifisering vil bli utført på en blind måte. Data vil bli overvåket av en uavhengig dataovervåkingskomité. Dataovervåkingsutvalget, som består av minst tre personer inkludert en statistiker, vil overvåke dataanalysen.

Stopperegler I våre kirurgiske prøver hadde gjentakelser mellom batch og intra-batch konsekvent en gennivåkonkordans på >0,9. Gennivåkonkordans mellom cytologipositiv FNB og frosne kirurgiske prøver ("gullstandarden") vil bli overvåket for hver batch på 24 pasienter. Hvis R<0,9, vil vi ta en pause for å revurdere den analytiske arbeidsflyten og instrumenteringen. Hvis konkordansen er vedvarende under 0,9 etter 72 pasienter, vil vi slutte å evaluere FNB, men vi vil fortsette å teste kirurgiske prøver. Siden dette ikke er en høyrisikostudie, har vi ikke til hensikt å avslutte forsøket for tidlig. Selv om det er lav samsvar mellom FNB og kirurgiske prøver, vil data som stammer fra å studere utfall i forhold til molekylær klassifisering (i kirurgiske prøver) være nyttige.

UTVALG OG TILBAKETREKNING AV EMNER Inklusjonskriterier

1. Alder ≥ 18 år
2. En diagnose av papillær skjoldbruskkjertelkreft basert på en finnålsbiopsi (FNB) tolket som en Bethesda V- eller VI-cytologi
3. Tumorstørrelse > 1 cm i maksimal diameter
4. Pasienten er en operativ kandidat
5. Pasienten har gitt samtykke

Eksklusjonskriterier

1. Familiehistorie med kreft i skjoldbruskkjertelen
2. Historie om stråling til nakken
3. Kan ikke eller vil ikke ta en finnålsbiopsi
4. Uvillig til å gjennomgå tyreoidektomi
5. Endelig patologi viser ikke papillær kreft i skjoldbruskkjertelen
6. Tilfeller der det ikke er en klar dominant knute
7. Tilfeller der det er flere knuter som utelukker prøvetaking av en definert knute

Kriterier for tilbaketrekking av forsøkspersoner. Emner kan avbryte deltakelsen når som helst ved å varsle en av etterforskerne eller forskningsstaben. Data innhentet før tilbaketrekking vil bli brukt til analyse, men ingen ytterligere data vil bli samlet inn etter tilbaketrekking. På forespørsel fra forsøkspersonen kan prøver trekkes tilbake før testing. Emner vil bli erstattet hvis prøver ikke er testet av RNASeq (Thyroid GuidePx®).

BEHANDLING AV PERSONER Den molekylære klassifiseringen og tilbakefallsrisikoen bestemt av Thyroid GuidePx® vil bli avslørt til legen og til pasienten. Gjentakelsesrisiko er basert på kumulative valideringsdata inkludert tilfeller fra Alberta og Australia. Kun resultatene av den frosne kirurgiske prøven ("gullstandarden") vil bli offentliggjort. Som vanlig standard vil behandlingsbeslutninger tas av legen i samarbeid med pasienten, basert på en syntese av all tilgjengelig klinisk informasjon. Denne kliniske studien definerer ikke en behandlingsvei. Oppfølgingsfrekvens og varighet vil ikke bli foreskrevet av protokoll og vil bli bestemt av behandlende lege. Dette er en ikke-intervensjonsstudie, og etterlevelse vil derfor ikke bli overvåket.

VURDERING AV EFFEKTIVITET Et sekundært resultat er testytelse for å stratifisere tilbakefallsrisiko. Testytelsen vil bli sammenlignet i prøver anskaffet av FNB og kirurgiske prøver, deretter sammenlignet med gjeldende standard for omsorg (ATA-risikostratifiseringssystemet). Tid til tilbakefall vil bli målt fra tidspunktet for fullstendig første behandling. Hos pasienter med mikroskopisk sykdom som gjenstår etter operasjonen, vil tiden til tilbakefall bli målt fra fullføringen av den terapeutiske dosen av radioaktivt jod. Gjentakende hendelser vil bli definert basert på retningslinjene fra American Thyroid Association fra 2016.

Følgende kriterier vil bety en sykdomsfri status etter terapi: (i) ingen klinisk bevis på svulst; (ii) ingen tegn på svulst på radioaktiv jodavbildning og/eller cervikal ultralyd; (iii) for post-total tyreoidektomi, ustimulert serumtyroglobulin (Tg) <0,2 ng/ml; for post-lobektomi, ustimulert Tg<30. En ubestemt respons på terapi vil bli definert som: (i) ingen klinisk bevis på tumor; (ii) ingen tegn på svulst på radioaktiv jodavbildning og/eller cervikal ultralyd; (iii) for post-total tyreoidektomi, ustimulert Tg 0,2 - 1; for post-lobektomi, Tg>30. Etter en total tyreoidektomi, er en biokjemisk ufullstendig respons definert som Tg>1 i fravær av strukturell sykdom. Tg-verdier er kun pålitelige i fravær av interfererende antistoffer (TgAb) (6).

Sykdom vil bli definert som et reelt residiv dersom en pasient tidligere hadde en upåviselig Tg i fravær av TgAb og en negativ nakke-ultralydundersøkelse innen 1 år etter forrige operasjon. Vedvarende sykdom vil bli definert som Tg større enn terskelverdiene ovenfor, unormal nakke-ultralyd, vedvarende økte nivåer av TgAb eller tilstedeværelse av fjernmetastaser.

Pasienter med vedvarende sykdom og/eller metastatisk sykdom (ikke-kurativ reseksjon) vil ikke inkluderes i beregning av residivfri overlevelse.

VURDERING AV SIKKERHET Den eneste avviket fra standard klinisk behandling er den intraoperative prøveanskaffelsen av FNB. Men i forhold til det planlagte kirurgiske inngrepet er denne risikoen liten. Hovedrisikoen er en liten risiko for klinisk signifikant blødning, estimert til <1 %. Siden det ikke vil være noen intervensjon knyttet til denne studien, er det ingen plan for overvåking av uønskede hendelser.

STATISTIKK Optimalisering av RNASeq-betingelser for prøver i CytoLyt RNA vil bli isolert fra FNB-er i CytoLyt i henhold til SOP. RNA-kvantitet vil bli vurdert av NanoDrop og og kvalitet vil bli kvantifisert av DV200. RNASeq vil bli utført i CytoLyt-prøver og matchede frosne prøver ved varierende lesedybder. I parede CytoLyt- og FFPE-vev vil analyseberegninger bli evaluert som en funksjon av inndatavevslagringsmetode, RNA-kvalitet (DV200) og lagringstid. Genuttrykk vil bli sammenlignet i paret CytoLyt og frosset vev, deretter korrelert mellom forholdene. Det viktigste utfallet, molekylær klasseoppgave, vil bli sammenlignet i parvise prøver.

Følgende ytelsesberegninger vil bli evaluert for hvert eksperiment, basert på College of American Pathologists (CAP) sjekkliste over krav som er spesifikke for neste generasjons sekvensering:

Analyseberegninger

a) RNASeq-målinger: (i) Lest antall (totalt avlesning, unike avlesninger, duplikatavlesninger, rRNA-avlesninger, strengspesifisitet); (ii) Dekning (antall lesninger som dekker en gitt genomisk posisjon): gjennomsnittlig dekning, gjennomsnittlig variasjonskoeffisient, 5'/3' dekning, gap i dekning, GC-bias (iii) Ekspresjonskorrelasjon (målte uttrykksnivåer vs. kjente nivåer av ERCC interne standarder) b) Individuell gendeteksjon: (i) Analytisk sensitivitet: brøkdel av tilfeller der hvert gen i den interne ERCC-standarden er korrekt identifisert.

(ii) Analytisk spesifisitet: evne til å identifisere fraværet av genene som utgjør den interne ERCC-standarden (iii) Nøyaktighet: sensitivitet + spesifisitet

Sammenligning av molekylær risikostratifisering (Thyroid GuidePx®) bestemt i FNB-prøver og i kirurgiske prøver Pasienter med en endelig patologi som ikke viser papillær skjoldbruskkjertelkreft vil bli ekskludert fra konkordansanalyse. Tilsvarende vil FNB-prøver som er cytologinegative bli ekskludert fra konkordansanalyse. Den molekylære klassetilordningen vil bli sammenlignet mellom prøver innhentet av FNB og matchede frosne kirurgiske prøver. Kirurgiske prøver vil bli ansett som gullstandarden. Kappa-statistikken vil bli brukt til å bestemme betydningen av samsvar mellom de to prøvetypene.

Risikolag vil bli tildelt på en blind måte ved hjelp av Thyroid GuidePx® og ATA Risk Stratification System. Strukturelle og biokjemiske residivrater ved 5 år vil bli sammenlignet for hver risikoklasse. Et binært testresultat, betinget av sykdomsstatus (strukturelt residiv), vil bli brukt for å vurdere testnøyaktigheten. Strukturell tilbakefall representerer gullstandarden. En 2-sidig McNemar-test for to avhengige proporsjoner vil bli brukt for å evaluere sensitiviteten og spesifisiteten til hver metode for risikostratifisering, med Holms justering for multiplisitet for å vurdere hvert nøyaktighetsmål separat.

Ytelsen til Thyroid GuidePx®

Fra studiene beskrevet ovenfor vil ytelsen til Thyroid GuidePx® bli vurdert separat i FNB-prøver og kirurgiske prøver. Ytelsesegenskapene vil bli vurdert som følger:

1. Tidsavhengig AUROC (areal under mottakeroperatørkurven) (24). For formålet med beregningene er terskelnivået for en positiv test en betegnelse på middels eller høy risiko (siden det er forventet at en mellomrisikotilordning vil resultere i vesentlig forskjellige kliniske avgjørelser).
2. Sensitivitet: beregnet som kumulativ sensitivitet ved 5 år, som beskrevet av Kamarudin og Kolamunnage-Dona (24)
3. Spesifisitet: beregnet som dynamisk spesifisitet, som beskrevet av Kamarudin og Kolamunnage-Dona (24)

Beregning av prøvestørrelse Vi vil sammenligne den molekylære risikotilordningen fra kirurgiske prøver og matchede FNB-er fra 109 pasienter. Et minimumsnivå av konkordans som er klinisk akseptabelt er 80 %. Prøvestørrelsesberegninger var basert på Lin's Kappa-statistikken for samsvar mellom de to målene for tre molekylære undergrupper (25). En tosidig hypotese ble brukt med et signifikansnivå på 0,05, og kraft ble fastsatt til 90 %. Molekylære undergruppestørrelser ble fastsatt til 23 % (type 1), 49 % (type 2) og 28 % (type 3). Hvis nullhypotesen er at samsvarsnivået mellom FNB og kirurgiske prøver er 0,6, vil vi kunne påvise et samsvarsnivå på 0,8 eller høyere med 109 pasienter. En konkordans på 0,90 ville være påviselig med 40 pasienter som antar samme nullnivå av enighet.

Omtrent 25 % av pasientene med Bethesda V-cytologi og omtrent 5 % av pasientene med Bethesda VI-cytologien vil ha benign sykdom. I tillegg, i omtrent 5 % av tilfellene, er RNASeq-kvaliteten utilstrekkelig i FFPE-prøver. På bakgrunn av dette legger vi opp til et frafall på 20 %. Derfor er forsøket designet for å omfatte 130 pasienter.

DIREKTE TILGANG TIL KILDEDATA/DOKUMENT Det kliniske utprøvingsstedet vil tillate utprøvingsrelatert overvåking, revisjoner, REB-gjennomgang og regulatoriske inspeksjon(er), som gir direkte tilgang til kildedata/dokumenter.

Kliniske utprøvingsrevisjoner utføres for å gi forsikring om at rettighetene, sikkerheten og velværet til pasienter er forsvarlig beskyttet, for å vurdere samsvar med protokollen, prosesser og avtaler, ICH Good Clinical Practice-standarder og gjeldende regulatoriske krav, og for å vurdere kvaliteten på data.

Ethvert nasjonalt tilsynsorgan kan komme når som helst for å revidere eller inspisere studiestedet. Denne revisjonen består av intervjuer med hovedetterforsker og studieteam, gjennomgang av dokumentasjon og praksis, gjennomgang av fasiliteter, utstyr og verifisering av kildedata.

Etterforskeren vil gi ethvert nasjonalt tilsynsorgan direkte tilgang til papir- og/eller elektronisk dokumentasjon knyttet til den kliniske studien (f.eks. CRF-er, kildedokumenter som sykehuspasientdiagrammer og etterforskerstudiefiler). Alle anleggsfasiliteter knyttet til studieoppføringen kan besøkes under en revisjon (f.eks. laboratorium, poliklinikk). Etterforskeren samtykker i å samarbeide og gi bistand til rimelige tider og steder med hensyn til revisjonsaktivitet.

KVALITETSKONTROLL OG KVALITETSSIKRING Hovedetterforskeren vil sørge for at alle studiemedlemmer følger protokollen og overholder regulatoriske standarder og standarder for god klinisk praksis. Alle kliniske utprøvingssteder vil tillate utprøvingsrelatert overvåking, revisjoner, REB-gjennomgang og regulatoriske inspeksjon(er), og gir direkte tilgang til kildedata/dokumenter.

Dataovervåkingskomiteen (DMC) vil møtes under gjennomføringen av rettssaken som følger: 1. Ved initiering av forsøk for å fullføre DMC Charter; 2. Etter at 24 deltakere er påmeldt; 3. Etter at 72 deltakere er påmeldt; og 4. etter fullført påmelding.

ETIKK Ansvarlig etterforsker vil sørge for at denne studien gjennomføres i samsvar med Helsinki-erklæringen. Denne studien vil bli utført i henhold til kanadiske og internasjonale standarder for god klinisk praksis for alle studier, inkludert ICH Harmonized Tripartite Guideline on Good Clinical Practice. Gjeldende myndighetsbestemmelser, retningslinjer for kliniske studier fra NNHPD og forskningsretningslinjer og prosedyrer for Alberta Health Services vil også bli fulgt.

Denne protokollen og eventuelle endringer vil bli sendt til HREBA-CC for formell godkjenning for å gjennomføre studien. Avgjørelsen fra HREBA-CC angående gjennomføringen av studien vil bli gjort skriftlig til etterforskeren.

Avsløring av molekylær risikoklassifisering fra kirurgiske prøver ("gullstandarden") er forsvarlig, siden det er betydelige utfallsdata fra kirurgiske prøver. Dessuten, når denne prøven lanseres, vil testen være kommersielt tilgjengelig som en Laboratory Developed Test (LDT).

DATAHÅNDTERING OG REGISTRERING Når studien er fullført, vil alle data for denne studien bli oppbevart i 15 år, lagret i henhold til protokollen ved Calgary Center for Clinical Research.

FINANSIERING OG FORSIKRING Forsøket vil bli finansiert av Qualisure Diagnostics, Inc., supplert med fagfellevurderte tilskudd. Forsikring vil bli gitt av University of Calgary og Alberta Health Services, samt Qualisure Diagnostics.

PUBLIKASJONSPOLITIK Funnene fra denne kliniske studien vil bli publisert i et fagfellevurdert tidsskrift med alle navngitte etterforskere som medforfattere. Alle finansieringskilder vil bli bekreftet.

6.0 Beskriv prosedyrer, behandling eller aktiviteter som er over eller i tillegg til standard praksis: .

Det eneste avviket fra standard klinisk behandling er den intraoperative anskaffelsen av prøve fra FNB. Men i forhold til det planlagte kirurgiske inngrepet er denne risikoen liten. Hovedrisikoen er en liten risiko for klinisk signifikant blødning, estimert til <1 %. Siden det ikke vil være noen intervensjon knyttet til denne studien, er det ingen plan for overvåking av uønskede hendelser.

Under operasjonen, når skjoldbruskkjertelen og svulsten er eksponert, vil kirurgen utføre en FNB av den dominerende svulsten (dvs.: lesjonen identifisert preoperativt), under direkte syn. Dette simulerer nærmest in vivo-forholdene til en preoperativ FNB, men begrenser likevel potensielle tekniske fall av en perkutan biopsi (f.eks. utilstrekkelig målretting av lesjonen).

Under ledelse av en samarbeidende patolog vil en del av svulsten bli fjernet og hurtigfryst, og en tilstøtende del vil bli tatt for formalinfiksering og parafininnstøping. Vev vil bli frigitt for forskning først når tilstrekkelig vev er tatt for diagnostisk og klinisk bruk.