Överensstämmelse mellan molekylär klassificering baserad på finnålsbiopsi (FNB) och kirurgiska prover

BAKGRUNDSINFORMATION Sköldkörtelcancer är den 8:e vanligaste cancerformen efter prevalens, och incidensen har ökat med >6 % per år sedan 1992. Papillär sköldkörtelcancer (PTC) står för de flesta sköldkörtelcancer, och den ökande förekomsten av sköldkörtelcancer kan nästan helt tillskrivas en ökad upptäckt av små PTC (1). PTC har vanligtvis en gynnsam prognos med höga botningsfrekvenser. Emellertid uppvisar cirka 10-15 % av PTC ett mer aggressivt beteende och är ofta resistenta mot konventionella adjuvanta terapier såsom radioaktivt jod (2,3). Med tanke på det ökande antalet PTC-fall (och den potentiella bördan på sjukvårdskostnader) blir korrekt prognostisering allt viktigare. Noggranna uppskattningar av prognos och risk för återfall kommer att undvika onödigt omfattande operationer, utredningar och uppföljningar hos individer med god prognos, och kommer att rikta mer omfattande operationer, adjuvanta terapier och förlängda uppföljningar till de som behöver det.

American Thyroid Association (ATA) Risk Stratification System Beslut om behandling är informerade av American Thyroid Association (ATA) Risk Stratification System, som uppskattar risken för att sjukdomen ska återkomma baserat på kliniska och patologiska faktorer. Även om detta system har validerats i efterhand av ett antal studier, är andelen förklarad varians suboptimal och sträcker sig från 19%-34% (4, 5). ATA-systemets oförmåga att helt förutsäga återfall kan vara relaterad till detta systems misslyckande att på ett adekvat sätt integrera risken förknippad med en tumörs molekylära profil. Endast en molekylär markör, BRAFV600E, är för närvarande inkorporerad i ATA Risk Stratification System. En annan begränsning av ATA Risk Stratification System är att det endast kan implementeras fullt ut efter operation, när alla kliniska och patologiska data som krävs för att uppskatta risken är tillgängliga. Vid den tidpunkten har betydande behandlingsbeslut redan fattats och effekten av operationen har redan insetts av patienten.

Uppskattning av risk före behandling: Den nuvarande vårdstandarden 2015 rapporterade ATA om kriterier som skulle kunna användas för att välja patienter för mer konservativa operationer som sköldkörtellobektomi. Enligt 2015 års ATA-riktlinjer anses patienter med följande preoperativa kriterier vara låg risk: tumörstorlek 1 - 4 cm, kliniskt nodnegativ, ingen extratyreoidal spridning, ingen familjehistoria av sköldkörtelcancer och ingen historia av strålbehandling mot nacken ( 6). Dessa patienter kunde initialt behandlas med en sköldkörtellobektomi (i motsats till en total tyreoidektomi). Emellertid kommer 40 - 60% att kräva en komplett tyreoidektomi eftersom den postoperativa riskstratifieringen (med användning av all klinisk och patologisk information tillgänglig efter operationen) klassificerade dem som en högre risk än vad som ursprungligen uppskattades (7-11). I en nyligen genomförd studie krävde 51 % av patienterna övergång till en komplett tyreoidektomi eftersom ytterligare riskfaktorer upptäcktes under operationen eller efter att den slutliga patologin var tillgänglig (12). Detta visar begränsningarna för de kliniska preoperativa riskuppskattningarna och behovet av en förbättrad metod för preoperativ riskuppskattning. Därför skulle sköldkörtelcancerkirurger och patienter dra nytta av ytterligare information som skulle förfina beslutet att utföra lobektomi hos lämpliga patienter och samtidigt minimera behovet av fullständig tyreoidektomi.

Thyroid GuidePx®: Ett nytt molekylärriskstratifieringssystem Bristerna i ATA Risk Stratification System för att tillförlitligt fastställa prognos har åtgärdats med hjälp av ett nytt molekylärriskstratifieringssystem som omfattar Thyroid GuidePx®-gensignaturen. Med hjälp av en datorprogramvarualgoritm identifierades transkript (mRNA) associerade med återfall och transkript associerade med frånvaro av återfall i en träningsuppsättning av 335 patienter med PTC, och validerades sedan i en valideringsuppsättning av 167 patienter. Tumörer inkluderade i datasetet var nyfrysta.

Det fanns tre molekylära subtyper som identifierades baserat på uttrycksmönstret för prognostiska gener. Dessa kallades typ 1, typ 2 och typ 3. Typ 3 PTC hade den mest aggressiva biologin och den högsta frekvensen av återfall. Den validerades därefter i 124 PTC-patienter från Korea samt 167 patienter från Edmonton.

De molekylära subtyperna betraktades i samband med tumörstadiet. Specifikt analyserades tumörer som mätte 1 - 4 cm i frånvaro av lymfkörtelsjukdom (som omfattar patienter som skulle vara potentiella kandidater för sköldkörtellobektomi) separat från patienter med mer avancerad sjukdom. Intressant nog hade typ 3 PTC en hög återfallsfrekvens oavsett tumörstadium. Lobektomikandidater med typ 1 och typ 2 PTC hade en återfallsfrekvens på <3 % (Figur 1A, B, se Protocol_Calgary_July 11, 2023.docx bifogad).

Testprestanda Det NGS-baserade testet som identifierade den molekylära subtypen av PTC kallades Thyroid GuidePx®. Den kombinerade molekylära och kliniska underklassificeringen av PTC med Thyroid GuidePx® jämfördes med ATA Risk Stratification System. ATA-riskstratifieringsgrupper bestämdes av två praktiserande läkare för varje fall. För att beräkna tidsberoende area under mottagarens funktionskarakteristikkurva (AUROC) användes en binär klassificering: låg risk kontra medel/hög risk. AUROC beräknades baserat på återfallsresultat från TCGA-upptäcktskohorten och Edmonton-kohorten. Den bästa riskstratifieringsprestandan uppnåddes med Thyroid GuidePx®-testet i kombination med kliniska egenskaper (d.v.s. tumörstorlek och lymfkörtelpåverkan). Med smoothROCtime-paketet var 5-års AUROC 0,80 för Thyroid GuidePx® när man beaktade tumörstorlek och lymfkörtelstatus, och 0,51 för ATA-riskstratifieringssystemet (Figur 2, se Protocol_Calgary_July 11, 2023.docx bifogad).

Thyroid GuidePx®: Analysbeskrivning Thyroid GuidePx®-testet är en analys baserad på målinriktad hybridinfångningsberikande RNA-sekvensering (RNA-Seq). Testinmatningen är RNA isolerat från formalinfixerad paraffininbäddad (FFPE) vävnad eller finnålsbiopsi (FNB) papillär sköldkörtelcancerprover. Biblioteksförberedelser innebär att specifikt amplifiera målområdena för var och en av generna i Thyroid GuidePx®-panelen. Panelen består av 82 gener. De resulterande provbiblioteken överförs till en MiSeq/MiSeqDx-reagenspatron som innehåller alla reagenser för sekvensering. Real-Time Analysis (RTA) programvara, som är en komponent i MiSeq/MiSeqDx sequencer, tillhandahåller basanrop och tillhörande kvalitetsresultat under sekvenseringskörningen. FASTQ-filer genereras som innehåller sekvenserings- och kvalitetsinformation. FASTQ-filen är ett allmänt använt textbaserat filformat för att lagra nukleotidsekvenser för varje amplikon och dess motsvarande kvalitetspoäng. FASTQ-filerna fungerar som indata för sekvensanpassningsalgoritmer. Justerade läsningar skrivs till filer i BAM-format som sedan konverteras till läsvärden och uttrycksvärden. Genuttrycksnivåer skickas sedan till algoritmen för att klassificera riskkategorier.

Programvaran klassificerar risk baserat på uttrycksmönstret för grupper av gener inom 82-genen Thyroid GuidePx®-panelen. Tre molekylära klasser har definierats baserat på en studie med 502 patientprover som associerar mönstret för genuttryck med återfallsfri överlevnad vid 5 år. En högriskgrupp berikad med BRAFV600E-mutationer; och två molekylära undergrupper med lägre risk identifierades.

Clinical Utility

Den mer exakta prognosen som tillhandahålls av Thyroid GuidePx® kan påverka läkares behandlingsbeslut. Följande är exempel på hur läkare kan tillämpa den nya informationen från Thyroid GuidePx®:

1. PTC med låg risk kan potentiellt behandlas med en partiell tyreoidektomi (t.ex. lobektomi) eller till och med aktiv övervakning, snarare än en total tyreoidektomi. Detta har två stora fördelar förutom tids- och kostnadsbesparingar. För det första finns det en minskning av det potentiella behovet av livslång ersättning av sköldkörtelhormon efter en lobektomi. För det andra finns det praktiskt taget ingen risk för de potentiellt förödande komplikationerna av en total tyreoidektomi, såsom bilateral återkommande skada på larynxnerven eller permanent hypoparatyreos.
2. Att noggrant identifiera lågrisk-PTC skulle också öka lämpligheten av adjuvant radioaktivt jod (RAI). RAI-behandling kan resultera i både övergående och långvariga biverkningar som spottkörteldysfunktion, äggstocks- och testikeldysfunktion och benmärgssuppression. RAI-terapi har också en teoretisk risk för sekundär malignitet: en uppskattning är att 100mCi 131I inducerar 56 maligniteter per 10 000 behandlade patienter (15). Det är också kostnadseffektivt att begränsa RAI-terapi till de patienter som skulle få förbättringar i total eller sjukdomsfri överlevnad.
3. Övervakning av PTC kan belasta patienter och vårdorganisationer av två skäl: PTC diagnostiseras oftast i medelåldern och patienter överlever ofta under långa perioder efter diagnosen. Det innebär att regelbunden undersökning och utredningar för tidig upptäckt av återfall kan pågå i många år. Uppföljning innebär vanligtvis årlig fysisk undersökning, serummätning av sköldkörtelstimulerande hormon och tyreoglobulin och periodiskt nackeultraljud. Lågriskpatienter kan få ökade intervall mellan uppföljningsundersökningar och utredningar och kan eventuellt skrivas ut från övervakning.
4. Att noggrant identifiera patienter med hög risk för återfall är också viktigt. ATA Risk Stratification System är känt för att vara felaktigt när det gäller att förutsäga återfall. Hos patienter som klassificeras som "låg risk" med 2015 års ATA Risk Stratification System, utvecklar 16 % av patienterna så småningom återkommande sjukdom (16). Dessa patienter kan vara underbehandlade som ett resultat av denna riskklassificering. Hos patienter där en mer exakt tilldelning av hög risk finns tillgänglig, kan mer aggressiva behandlingar (d.v.s. total tyreoidektomi och RAI) eller inskrivning i kliniska prövningar övervägas.

Thyroid GuidePx® från Fine Needle Biopsi Våra studier har hittills gjorts med kirurgiska prover, och en kommersiellt tillgänglig analys har tagits fram i detta format. En nyligen genomförd studie av Institute of Health Economics har dock fastställt att ökad kostnadseffektivitet för Thyroid GuidePx® skulle uppnås genom att utföra testet före operationen. Att genomföra ett test preoperativt skulle kräva att testet fungerar bra med prover som härrör från en finnålsbiopsi (FNB).

Sköldkörtel FNB lagras rutinmässigt i CytoLyt, ett metanolbaserat buffrat flytande konserveringsmedel, i upp till 7 dagar innan cellerna överförs till en ThinPrep för cytologisk utvärdering. Vi och andra (17-21) har tidigare bestämt att kvalitets-DNA och RNA kan härledas från celler i CytoLyt. Vår nyligen genomförda genomförbarhetsstudie bestående av 12 patienter med PTC visade att det är möjligt att utföra Thyroid GuidePx®-analysen på FNB. Hittills har den tekniska framgångsfrekvensen varit 100 % och gennivåöverensstämmelsen med kirurgiska prover överstiger 0,9. Men beroende på en begränsad FNB för karakterisering av molekylär sjukdom innebär att provet är representativt för hela tumören. Genomisk och transkriptomisk heterogenitet har beskrivits i primära tumörer och metastaser (23). Därför kommer det att vara viktigt att dokumentera överensstämmelsen mellan prover som förvärvats av FNB och kirurgiska prover.

FÖRSÖKSMÅL OCH SYFTE Det allmänna syftet med studien är att fastställa om det mer begränsade provet från en finnålsbiopsi är tillräckligt representativt för den större tumören för att fastställa en giltig molekylär klassificering med hjälp av Thyroid GuidePx®-testet.

Primärt mål 1. För att bestämma överensstämmelsen mellan Thyroid GuidePx® molekylära klassificeringar som erhållits från FNAs och matchade kirurgiska prover.

Sekundära mål

1. För att jämföra den tekniska framgångsfrekvensen för att slutföra en giltig Thyroid GuidePx® med hjälp av FNAs och kirurgiska prover.
2. För att jämföra återfallsresultat med ATA-riskstratifieringssystemet jämfört med patienter klassificerade av Thyroid GuidePx® med hjälp av kirurgiska prover.
3. För att jämföra återfallsutfall med ATA-riskstratifieringssystemet jämfört med patienter klassificerade av Thyroid GuidePx® med FNA-prover.

PROVDESIGN Provschema (se Protocol_Calgary_11 juli 2023.docx bifogad)

Provtagning och analys Patienter kommer att bjudas in att delta om de har en preoperativ vävnadsdiagnos av PTC (Bethesda VI) eller misstänkta för PTC (Bethesda V), och de är berättigade till partiell eller total tyreoidektomi, enligt beskrivningen i inklusions- och uteslutningskriterierna . Efter medgivande kommer patienter att genomgå operation som planerat av sin kirurg. Demografiska, kliniska och patologiska data kommer att inhämtas från alla deltagare.

Under operationen, när sköldkörteln och tumören exponeras, kommer kirurgen att utföra en FNB av den dominerande tumören (dvs. lesionen identifierad preoperativt), under direkt syn. Detta simulerar närmast in vivo-förhållandena för en preoperativ FNB men begränsar ändå potentiella tekniska nedgångar av en perkutan biopsi (t.ex. otillräcklig inriktning av lesionen). Det cellulära materialet som härrör från FNB kommer omedelbart att placeras i transportmediet (CytoLyt) och sedan kylas. Prover kommer att skickas varje vecka till centrallaboratoriet för RNA-isolering och RNASeq. Samtidigt kommer FNB-prover att undersökas för förekomst av tumörceller av en utbildad cytopatolog.

Om mer än en knöl finns, kommer FNB-knölen att markeras av patologens kirurg. Under ledning av en samarbetande patolog kommer en bit av tumören att tas bort och snäppfrysas, och en intilliggande bit kommer att tas för formalinfixering och paraffininbäddning (FFPE). Ett H & E-objektglas från FFPE-provet som ska färgas för H & E, och 3 - 6 ofärgade sektioner kommer att förberedas och skickas sedan till det centrala laboratoriet för mikrodissektion, RNA-isolering och RNASeq. Denna process kommer att följa rutinmässiga provbearbetningsprotokoll och kommer inte att störa standardmetoder för patologisk diagnos.

Om patienter har undertecknat det valfria formuläret för informerat samtycke för biobanking, om det finns tillräckligt med fryst prov kvar, kommer provet att behållas i syfte att testa om (om det behövs) eller för att stödja ytterligare studier såsom analys av hela transkriptom och mutationsanalys. Användning av dessa prover för dessa ändamål skulle kräva ytterligare etiska godkännanden.

En förstudie bestående av 12 patienter har redan genomförts. Den tekniska framgångsfrekvensen för att ta prover och utföra analysen var 100 %, RNA-kvantitet och -kvalitet var utmärkt i FNB och det fanns utmärkt gennivåöverensstämmelse i analyser utförda på FNB:er och kirurgiska prover.

RNASeq for Thyroid GuidePx® kommer att utföras på OncoHelix, ett kliniskt laboratorium med expertis inom precisionsonkologi beläget vid Cumming School of Medicine, University of Calgary. Om testning inte kan göras i tid hos OncoHelix, kommer prover att testas på Protean BioDiagnostics, ett CAP/CLIA-certifierat labb i Orlando, FL som för närvarande utför testet kommersiellt. Riskklasser kommer att tilldelas av programvara designad av Qualisure Diagnostics med hjälp av data som genereras av RNASeq.

Slutpunkter

Primär slutpunkt:

1. Överensstämmelse, molekylär riskklassificering av papillär sköldkörtelcancer FNB och matchade frysta kirurgiska prover

Sekundära slutpunkter:

1. Teknisk framgångsgrad för att fylla i en giltig Thyroid GuidePx® med FNB
2. Teknisk framgångsfrekvens för att fylla i en giltig Thyroid GuidePx® i FFPE kirurgiska prover.
3. Biokemisk återfallsfrekvens vid 5 år (tyroglobulin ≥ 1 ng/ml, endast för patienter som genomgått en total tyreoidektomi)
4. Strukturell återfallsfrekvens vid 5 år

5. Testprestanda som ett prognostiskt test, Thyroid GuidePx®: FNB och kirurgiska prover

   1. Specificitet: andelen patienter utan strukturellt återfall som förutsägs av testet
   2. Sensitivitet: testets förmåga att identifiera individer vars sjukdom kommer att återkomma inom 5 år (proportion av strukturella återfall som förutspås)
   3. AUROC
   4. Positivt prediktivt värde
   5. Negativt prediktivt värde

6. Prestanda, ATA-riskstratifiering

   1. Specificitet: andelen patienter utan strukturellt återfall som förutsägs av testet
   2. Sensitivitet: testets förmåga att identifiera individer vars sjukdom kommer att återkomma inom 5 år (proportion av strukturella återfall som förutspås)
   3. AUROC
   4. Positivt prediktivt värde
   5. Negativt prediktivt värde

Blindning och begränsning av bias Endast prover med tillräcklig RNA-kvalitet (DV200>30) kommer att inkluderas i analysen. Endast FNB som innehåller tumörceller ("cytologipositiva") kommer att inkluderas i konkordansberäkningen. RNASeq kommer att utföras av en tekniker som är blind för alla kliniska detaljer. Teknikern kommer specifikt inte att kunna identifiera matchade prover från kirurgiska prover och FNB. Molekylär klassificering kommer att utföras på ett förblindat sätt. Data kommer att övervakas av en oberoende dataövervakningskommitté. Dataövervakningskommittén, som består av minst tre personer inklusive en statistiker, kommer att övervaka dataanalys.

Stoppregler I våra kirurgiska prover hade repetitioner mellan batch och intra-batch konsekvent en gennivåöverensstämmelse på >0,9. Gennivåöverensstämmelse mellan cytologipositiv FNB och frysta kirurgiska prov ("guldstandarden") kommer att övervakas för varje batch om 24 patienter. Om R<0,9 pausar vi för att omvärdera det analytiska arbetsflödet och instrumenteringen. Om konkordansen ständigt är under 0,9 efter 72 patienter kommer vi att sluta utvärdera FNB, men vi kommer att fortsätta att testa kirurgiska prover. Eftersom detta inte är en högriskstudie avser vi inte att avsluta prövningen i förtid. Även om det finns låg överensstämmelse mellan FNB och kirurgiska prover, kommer data som härrör från studieresultat i relation till molekylär klassificering (i kirurgiska prover) att vara användbara.

URVAL OCH ÅTERKALLANDE AV ÄMNEN Inklusionskriterier

1. Ålder ≥ 18 år
2. En diagnos av papillär sköldkörtelcancer baserad på en finnålsbiopsi (FNB) tolkad som en Bethesda V- eller VI-cytologi
3. Tumörstorlek > 1 cm i maximal diameter
4. Patienten är en operativ kandidat
5. Patienten har lämnat samtycke

Exklusions kriterier

1. Familjehistoria av sköldkörtelcancer
2. Historik om strålning mot nacken
3. Kan eller vill inte göra en finnålsbiopsi
4. Ovillig att genomgå tyreoidektomi
5. Slutlig patologi visar inte papillär sköldkörtelcancer
6. Fall där det inte finns någon tydlig dominant knöl
7. Fall där det finns flera knölar som utesluter provtagning av en definierad knöl

Kriterier för återkallelse av försökspersoner. Försökspersoner kan när som helst avbryta sitt deltagande genom att meddela en av utredarna eller forskningspersonalen. Data som inhämtats före återkallelsen kommer att användas för analys, men ingen ytterligare data kommer att samlas in efter återkallelsen. På försökspersonens begäran kan prover tas ut före testning. Försökspersoner kommer att ersättas om prover inte har testats av RNASeq (Thyroid GuidePx®).

BEHANDLING AV ämnen Den molekylära klassificeringen och risken för återfall som bestäms av Thyroid GuidePx® kommer att avslöjas för läkaren och för patienten. Återfallsrisken baseras på kumulativa valideringsdata inklusive fall från Alberta och Australien. Endast resultaten av det frusna kirurgiska provet ("guldstandarden") kommer att avslöjas. Som vanligt kommer behandlingsbeslut fattas av läkaren i samarbete med patienten, baserat på en syntes av all tillgänglig klinisk information. Denna kliniska prövning definierar ingen behandlingsväg. Uppföljningsfrekvens och varaktighet kommer inte att ordineras enligt protokoll och kommer att bestämmas av den behandlande läkaren. Detta är en icke-interventionsstudie, så efterlevnaden kommer inte att övervakas.

BEDÖMNING AV EFFEKTIVITET Ett sekundärt resultat är testprestanda för att stratifiera återfallsrisken. Testprestanda kommer att jämföras i prover som förvärvats av FNB och kirurgiska prover, och sedan jämföras med den nuvarande standarden för vård (ATA-riskstratifieringssystemet). Tiden till återfall kommer att mätas från tidpunkten för fullständig initial behandling. Hos patienter med mikroskopisk sjukdom kvar efter operationen kommer tiden till återfall att mätas från avslutad terapeutisk dos av radioaktivt jod. Återkommande händelser kommer att definieras baserat på 2016 års riktlinjer för American Thyroid Association.

Följande kriterier kommer att beteckna en sjukdomsfri status efter terapi: (i) inga kliniska bevis på tumör; (ii) inga tecken på tumör på radioaktiv jodavbildning och/eller cervikalt ultraljud; (iii) för post-total tyreoidektomi, ostimulerat serumtyroglobulin (Tg) <0,2 ng/ml; för post-lobektomi, ostimulerad Tg<30. Ett obestämt svar på terapi kommer att definieras som: (i) inga kliniska bevis på tumör; (ii) inga tecken på tumör på radioaktiv jodavbildning och/eller cervikalt ultraljud; (iii) för post-total tyreoidektomi, ostimulerad Tg 0,2 - 1; för post-lobektomi, Tg>30. Efter en total tyreoidektomi definieras ett biokemiskt ofullständigt svar som Tg>1 i frånvaro av strukturell sjukdom. Tg-värden är endast tillförlitliga i frånvaro av interfererande antikroppar (TgAb) (6).

Sjukdom kommer att definieras som ett verkligt återfall om en patient tidigare haft ett odetekterbart Tg i frånvaro av TgAb och en negativ nacke-ultraljudsundersökning inom 1 år efter föregående operation. Ihållande sjukdom kommer att definieras som Tg högre än ovanstående tröskelvärden, ett onormalt halsultraljud, ihållande ökade nivåer av TgAb eller närvaro av fjärrmetastaser.

Patienter med ihållande sjukdom och/eller metastaserande sjukdom (icke-kurativ resektion) kommer inte att inkluderas i beräkningen av återfallsfri överlevnad.

BEDÖMNING AV SÄKERHET Den enda avvikelsen från vanlig klinisk vård är FNB:s intraoperativa provtagning. Men i jämförelse med det planerade kirurgiska ingreppet är denna risk liten. Den största risken är en liten risk för kliniskt signifikant blödning, uppskattad till <1 %. Eftersom det inte kommer att finnas någon intervention i samband med denna studie, finns det ingen plan för övervakning av biverkningar.

STATISTIK Optimering av RNASeq-förhållanden för prover i CytoLyt RNA kommer att isoleras från FNBs i CytoLyt enligt SOP. RNA-kvantitet kommer att bedömas av NanoDrop och och kvalitet kommer att kvantifieras av DV200. RNASeq kommer att utföras i CytoLyt-prover och matchade frysta prover på varierande avläsningsdjup. I parade CytoLyt- och FFPE-vävnader kommer analysmått att utvärderas som en funktion av indatavävnadslagringsmetod, RNA-kvalitet (DV200) och lagringstid. Genuttryck kommer att jämföras i parade CytoLyt och frusna vävnader, sedan korreleras mellan tillstånden. Det viktigaste resultatet, molekylär klasstilldelning, kommer att jämföras i parade prover.

Följande prestandamått kommer att utvärderas för varje experiment, baserat på College of American Pathologists (CAP) checklista med krav som är specifika för nästa generations sekvensering:

Analysmått

a) RNASeq-mått: (i) Läsvärden (totalt antal avläsningar, unika avläsningar, dubbla avläsningar, rRNA-avläsningar, strängspecificitet); (ii) Täckning (antal läsningar som täcker en given genomisk position): medeltäckning, medelvariationskoefficient, 5'/3' täckning, luckor i täckning, GC-bias (iii) Uttryckskorrelation (uppmätta uttrycksnivåer kontra kända nivåer av ERCCs interna standarder) b) Individuell gendetektion: (i) Analytisk känslighet: bråkdel av fall där varje gen i ERCC:s interna standard är korrekt identifierad.

(ii) Analytisk specificitet: förmåga att identifiera frånvaron av generna som utgör den interna standarden för ERCC (iii) Noggrannhet: sensitivitet + specificitet

Jämförelse av molekylär riskstratifiering (Tyroid GuidePx®) fastställd i FNB-prover och i kirurgiska prover Patienter med en slutlig patologi som inte visar papillär sköldkörtelcancer kommer att uteslutas från konkordansanalys. På liknande sätt kommer FNB-prover som är cytologinegativa att uteslutas från konkordansanalys. Den molekylära klasstilldelningen kommer att jämföras mellan prover erhållna av FNB och matchade frysta kirurgiska prover. Kirurgiska prover kommer att betraktas som guldstandarden. Kappa-statistiken kommer att användas för att bestämma signifikansen av överensstämmelse mellan de två provtyperna.

Riskskikt kommer att tilldelas på ett förblindat sätt med hjälp av Thyroid GuidePx® och ATA Risk Stratification System. Strukturella och biokemiska återfallsfrekvenser efter 5 år kommer att jämföras för varje riskklass. Ett binärt testresultat, beroende på sjukdomsstatus (strukturellt återfall), kommer att användas för att bedöma testnoggrannheten. Strukturellt återfall representerar guldmyntfoten. Ett 2-sidigt McNemar-test för två beroende proportioner kommer att användas för att utvärdera känsligheten och specificiteten för varje metod för riskstratifiering, med Holms justering för multiplicitet för att bedöma varje noggrannhetsmått separat.

Prestanda för Thyroid GuidePx®

Från studierna som beskrivs ovan kommer prestandan hos Thyroid GuidePx® att bedömas separat i FNB-prover och kirurgiska prover. Prestandaegenskaperna kommer att bedömas enligt följande:

1. Tidsberoende AUROC (area under mottagarens operatörskurva) (24). För beräkningarnas syfte är tröskelnivån för ett positivt test en beteckning på medel- eller högrisk (eftersom det förväntas att en tilldelning av mellanliggande risk skulle resultera i väsentligt olika kliniska beslut).
2. Känslighet: beräknad som kumulativ känslighet vid 5 år, enligt beskrivning av Kamarudin och Kolamunnage-Dona (24)
3. Specificitet: beräknas som dynamisk specificitet, enligt beskrivning av Kamarudin och Kolamunnage-Dona (24)

Beräkning av provstorlek Vi kommer att jämföra den molekylära risktilldelningen från kirurgiska prover och matchade FNB från 109 patienter. En miniminivå av överensstämmelse som är kliniskt acceptabel är 80 %. Provstorleksberäkningar baserades på Lin's Kappa-statistik för överensstämmelse mellan de två måtten för tre molekylära undergrupper (25). En dubbelsidig hypotes applicerades med en signifikansnivå på 0,05 och kraften fastställdes till 90 %. Molekylära subgruppstorlekar fixerades till 23 % (typ 1), 49 % (typ 2) och 28 % (typ 3). Om nollhypotesen är att nivån av överensstämmelse mellan FNB och kirurgiska prover är 0,6, då skulle vi kunna detektera en nivå av överensstämmelse på 0,8 eller högre med 109 patienter. En överensstämmelse på 0,90 skulle kunna detekteras med 40 patienter som antar samma nollnivå av överensstämmelse.

Cirka 25 % av patienterna med Bethesda V-cytologi och cirka 5 % av patienterna med Bethesda VI-cytologi kommer att ha benign sjukdom. Dessutom, i cirka 5 % av fallen, är RNASeq-kvaliteten otillräcklig i FFPE-prover. Utifrån detta planerar vi ett bortfall på 20 %. Därför är försöket utformat för att omfatta 130 patienter.

DIREKT ÅTKOMST TILL KÄLLDATA/DOKUMENT Den kliniska prövningsplatsen kommer att tillåta prövningsrelaterad övervakning, revisioner, REB-granskning och myndighetsinspektion(er), vilket ger direkt tillgång till källdata/dokument.

Revisioner av kliniska prövningar utförs för att säkerställa att patienters rättigheter, säkerhet och välbefinnande är ordentligt skyddade, för att bedöma efterlevnad av protokoll, processer och avtal, ICH Good Clinical Practice-standarder och tillämpliga regulatoriska krav, och för att bedöma kvaliteten på data.

Alla nationella tillsynsmyndigheter kan komma när som helst för att granska eller inspektera studieplatsen. Denna revision består av intervjuer med huvudutredaren och studiegruppen, granskning av dokumentation och praxis, granskning av anläggningar, utrustning och verifiering av källdata.

Utredaren kommer att ge alla nationella tillsynsmyndigheter direkt tillgång till pappers- och/eller elektronisk dokumentation som hänför sig till den kliniska studien (t. CRF, källdokument som sjukhuspatientdiagram och utredares studiefiler). Alla platsanläggningar relaterade till studiens genomförande kunde besökas under en revision (t.ex. laboratorium, öppenvårdsavdelning). Utredaren samtycker till att samarbeta och ge assistans vid rimliga tider och platser med avseende på all revisionsverksamhet.

KVALITETSKONTROLL OCH KVALITETSSÄKRING Huvudutredaren kommer att se till att alla studiemedlemmar följer protokollet och följer föreskrifter och standarder för god klinisk praxis. Alla kliniska prövningsplatser kommer att tillåta prövningsrelaterad övervakning, revisioner, REB-granskning och myndighetsinspektion(er), vilket ger direkt tillgång till källdata/dokument.

Dataövervakningskommittén (DMC) kommer att sammanträda under genomförandet av rättegången enligt följande: 1. Vid försöksinitiering för att slutföra DMC-stadgan; 2. Efter att 24 deltagare har registrerats; 3. Efter att 72 deltagare har anmälts; och 4. efter avslutad inskrivning.

ETIK Den ansvariga utredaren kommer att se till att denna studie genomförs i enlighet med Helsingforsdeklarationen. Denna studie kommer att genomföras enligt kanadensiska och internationella standarder för god klinisk praxis för alla studier inklusive ICHs harmoniserade trepartsriktlinje om god klinisk praxis. Tillämpliga statliga föreskrifter, riktlinjer för kliniska prövningar från NNHPD och forskningspolicyer och procedurer för Alberta Health Services kommer också att följas.

Detta protokoll och eventuella ändringar kommer att skickas till HREBA-CC för formellt godkännande för att genomföra studien. HREBA-CC:s beslut om genomförandet av studien kommer att fattas skriftligen till utredaren.

Avslöjande av molekylär riskklassificering från kirurgiska prover ("guldstandarden") är motiverat, eftersom det finns betydande resultatdata från kirurgiska prover. Dessutom, när denna test lanseras, kommer testet att vara kommersiellt tillgängligt som ett Laboratory Developed Test (LDT).

DATAHANTERING OCH REGISTRERING När studien är klar kommer all data för denna studie att lagras i 15 år, lagrad enligt protokollet vid Calgary Center for Clinical Research.

FINANSIERING OCH FÖRSÄKRING Försöket kommer att finansieras av Qualisure Diagnostics, Inc., kompletterat med referentgranskade anslag. Försäkring kommer att tillhandahållas av University of Calgary och Alberta Health Services, samt Qualisure Diagnostics.

PUBLIKATIONSPOLICY Resultaten från denna kliniska studie kommer att publiceras i en peer-reviewed tidskrift med alla namngivna utredare som medförfattare. Alla finansieringskällor kommer att bekräftas.

6.0 Beskriv procedurer, behandling eller aktiviteter som ligger över eller utöver standardpraxis: .

Den enda avvikelsen från vanlig klinisk vård är FNB:s intraoperativa provtagning. Men i jämförelse med det planerade kirurgiska ingreppet är denna risk liten. Den största risken är en liten risk för kliniskt signifikant blödning, uppskattad till <1 %. Eftersom det inte kommer att finnas någon intervention i samband med denna studie, finns det ingen plan för övervakning av biverkningar.

Under operationen, när sköldkörteln och tumören exponeras, kommer kirurgen att utföra en FNB av den dominerande tumören (dvs. lesionen identifierad preoperativt), under direkt syn. Detta simulerar närmast in vivo-förhållandena för en preoperativ FNB men begränsar ändå potentiella tekniska nedgångar av en perkutan biopsi (t.ex. otillräcklig inriktning av lesionen).

Under ledning av en samverkande patolog kommer en bit av tumören att tas bort och snäppfrysas, och en intilliggande bit kommer att tas för formalinfixering och paraffininbäddning. Vävnad kommer att släppas för forskning först när tillräckligt med vävnad har tagits för diagnostisk och klinisk användning.