Concordantie van moleculaire classificatie op basis van fijne naaldbiopsie (FNB) en chirurgische monsters

ACHTERGRONDINFORMATIE Schildklierkanker is qua prevalentie de 8e meest voorkomende kanker, en de incidentie is sinds 1992 met >6% per jaar toegenomen. Papillaire schildklierkanker (PTC) is verantwoordelijk voor de meeste gevallen van schildklierkanker, en de stijgende incidentie van schildklierkanker kan bijna volledig worden toegeschreven aan een verhoogde detectie van kleine PTC's (1). PTC heeft doorgaans een gunstige prognose met hoge genezingspercentages. Ongeveer 10-15% van de PTC's vertoont echter agressiever gedrag en is vaak resistent tegen conventionele adjuvante therapieën zoals radioactief jodium (2,3). Gezien het toenemende aantal PTC-gevallen (en de potentiële druk op de gezondheidszorgkosten) wordt nauwkeurige prognose steeds belangrijker. Nauwkeurige schattingen van de prognose en het risico op herhaling zullen onnodig uitgebreide operaties, onderzoeken en follow-up bij personen met een goede prognose vermijden, en zullen uitgebreidere operaties, adjuvante therapieën en langdurige follow-ups richten op degenen die deze nodig hebben.

Het risicostratificatiesysteem van de American Thyroid Association (ATA) Beslissingen over de behandeling worden gebaseerd op het risicostratificatiesysteem van de American Thyroid Association (ATA), dat het risico op herhaling van de ziekte schat op basis van klinische en pathologische factoren. Hoewel dit systeem retrospectief door een aantal onderzoeken is gevalideerd, is het verklaarde aandeel van de variantie suboptimaal en varieert van 19% tot 34% (4, 5). Het onvermogen van het ATA-systeem om herhaling volledig te voorspellen, kan verband houden met het onvermogen van dit systeem om op adequate wijze het risico te integreren dat gepaard gaat met het moleculaire profiel van een tumor. Slechts één moleculaire marker, BRAFV600E, is momenteel opgenomen in het ATA Risk Stratification System. Een andere beperking van het ATA Risk Stratification System is dat het pas volledig kan worden geïmplementeerd na een operatie, wanneer alle klinische en pathologische gegevens die nodig zijn om het risico in te schatten beschikbaar zijn. Op dat moment zijn er al belangrijke behandelbeslissingen genomen en is de impact van de operatie al door de patiënt gerealiseerd.

Risico's inschatten voorafgaand aan de behandeling: de huidige zorgstandaard In 2015 rapporteerde de ATA over criteria die gebruikt zouden kunnen worden om patiënten te selecteren voor meer conservatieve operaties zoals schildklierlobectomie. Volgens de ATA-richtlijnen van 2015 worden patiënten met de volgende preoperatieve criteria als laag risico beschouwd: tumorgrootte 1 - 4 cm, klinisch knooppunt negatief, geen extrathyroidale verspreiding, geen familiegeschiedenis van schildklierkanker en geen geschiedenis van bestralingstherapie aan de nek ( 6). Deze patiënten zouden in eerste instantie kunnen worden behandeld met een schildklierlobectomie (in tegenstelling tot een totale thyreoïdectomie). Voor 40 - 60% zal echter een voltooide thyreoïdectomie nodig zijn, omdat de postoperatieve risicostratificatie (gebruikmakend van alle klinische en pathologische informatie die na de operatie beschikbaar is) deze als een hoger risico classificeert dan aanvankelijk werd ingeschat (7-11). In een recent onderzoek had 51% van de patiënten conversie naar een voltooide thyreoïdectomie nodig omdat aanvullende risicofactoren werden onderkend tijdens de operatie of nadat de uiteindelijke pathologie beschikbaar was (12). Dit toont de beperkingen aan van de klinische preoperatieve risicoschattingen, en de behoefte aan een verbeterde methode voor preoperatieve risicoschatting. Daarom zouden chirurgen en patiënten met schildklierkanker baat hebben bij aanvullende informatie die de beslissing om lobectomie uit te voeren bij geschikte patiënten zou verfijnen, terwijl de noodzaak voor voltooiing van de thyreoïdectomie tot een minimum zou worden beperkt.

Schildklier GuidePx®: een nieuw moleculair risicostratificatiesysteem De tekortkomingen van het ATA-risicostratificatiesysteem om op betrouwbare wijze de prognose te bepalen, zijn aangepakt met behulp van een nieuw moleculair risicostratificatiesysteem dat de Thyroid GuidePx®-gensignatuur omvat. Met behulp van een computersoftware-algoritme werden transcripten (mRNA) geassocieerd met recidief en transcripten geassocieerd met de afwezigheid van recidief geïdentificeerd in een trainingsset van 335 patiënten met PTC, en vervolgens gevalideerd in een validatieset van 167 patiënten. Tumoren in de dataset waren vers ingevroren.

Er werden drie moleculaire subtypen geïdentificeerd op basis van het expressiepatroon van prognostische genen. Deze werden Type 1, Type 2 en Type 3 genoemd. Type 3 PTC's hadden de meest agressieve biologie en het hoogste recidiefpercentage. Het werd vervolgens gevalideerd bij 124 PTC-patiënten uit Korea en bij 167 patiënten uit Edmonton.

De moleculaire subtypen werden beschouwd in de context van het tumorstadium. Specifiek werden tumoren met een afmeting van 1 - 4 cm bij afwezigheid van lymfeklierziekte (die patiënten omvatten die potentiële kandidaten zouden zijn voor schildklierlobectomie) afzonderlijk geanalyseerd van patiënten met een meer gevorderde ziekte. Interessant genoeg hadden Type 3 PTC's een hoog recidiefpercentage, ongeacht het tumorstadium. Lobectomiekandidaten met Type 1 en Type 2 PTC's hadden een recidiefpercentage van <3% (Figuur 1A, B, zie Protocol_Calgary_July 11, 2023.docx bijgevoegd).

Testprestaties De op NGS gebaseerde test die het moleculaire subtype van PTC identificeerde, heette Thyroid GuidePx®. De gecombineerde moleculaire en klinische subclassificatie van PTC met behulp van Thyroid GuidePx® werd vergeleken met het ATA Risk Stratification System. Voor elk geval werden ATA-risicostratificatiegroepen door twee praktiserende artsen bepaald. Om het tijdsafhankelijke gebied onder de receiver operating karakteristieke curve (AUROC) te berekenen, werd een binaire classificatie toegepast: laag risico versus gemiddeld/hoog risico. AUROC werd berekend op basis van de recidiefresultaten van het TCGA-ontdekkingscohort en het Edmonton-cohort. De beste risicostratificatieprestaties werden bereikt door de Thyroid GuidePx®-test in combinatie met klinische kenmerken (d.w.z. tumorgrootte en betrokkenheid van lymfeklieren). Met behulp van het smoothROCtime-pakket was de 5-jaars AUROC 0,80 voor Thyroid GuidePx® bij het overwegen van de tumorgrootte en lymfeklierstatus, en 0,51 voor het ATA-risicostratificatiesysteem (Figuur 2, zie Protocol_Calgary_July 11, 2023.docx bijgevoegd).

Thyroid GuidePx®: Testbeschrijving De Thyroid GuidePx®-test is een test gebaseerd op gerichte hybride-capture-verrijkende RNA-sequencing (RNA-Seq). De testinvoer is RNA dat is geïsoleerd uit in formaline gefixeerd, in paraffine ingebed (FFPE) weefsel of fijne naaldbiopsie (FNB) papillaire schildklierkankerspecimens. Het voorbereiden van de bibliotheek omvat het specifiek amplificeren van de doelgebieden van elk van de genen in het Thyroid GuidePx®-paneel. Het panel bestaat uit 82 genen. De resulterende monsterbibliotheken worden overgebracht naar een MiSeq/MiSeqDx-reagenscartridge die alle reagentia voor sequencing bevat. Real-Time Analysis (RTA)-software, een onderdeel van de MiSeq/MiSeqDx-sequencer, biedt basisoproepen en bijbehorende kwaliteitsscores tijdens de sequencing-run. Er worden FASTQ-bestanden gegenereerd die de sequentie- en kwaliteitsinformatie bevatten. Het FASTQ-bestand is een veelgebruikt, op tekst gebaseerd bestandsformaat voor het opslaan van de nucleotidesequentie voor elk amplicon en de bijbehorende kwaliteitsscore. De FASTQ-bestanden dienen als invoer voor algoritmen voor sequentie-uitlijning. Uitgelijnde leesbewerkingen worden naar bestanden in BAM-indeling geschreven, die vervolgens worden geconverteerd naar leestellingen en expressiewaarden. Genexpressieniveaus worden vervolgens aan het algoritme voorgelegd om risicocategorieën te classificeren.

De software classificeert risico's op basis van het expressiepatroon van groepen genen binnen het 82 genen tellende Thyroid GuidePx®-panel. Er zijn drie moleculaire klassen gedefinieerd op basis van een onderzoek met 502 patiëntenmonsters die het patroon van genexpressie associëren met recidiefvrije overleving na 5 jaar. Een risicogroep verrijkt met BRAFV600E-mutaties; en er werden twee moleculaire subgroepen met een lager risico geïdentificeerd.

Klinisch nut

De nauwkeurigere prognose van Thyroid GuidePx® zou de behandelbeslissingen van artsen kunnen beïnvloeden. Hieronder volgen voorbeelden van hoe artsen de nieuwe informatie uit Thyroid GuidePx® kunnen toepassen:

1. PTC met een laag risico zou mogelijk kunnen worden behandeld met een gedeeltelijke thyreoïdectomie (bijv. lobectomie) of zelfs actieve surveillance, in plaats van een totale thyreoïdectomie. Dit heeft naast tijd- en kostenbesparing twee grote voordelen. Ten eerste is er een vermindering van de potentiële behoefte aan levenslange vervanging van schildklierhormoon na een lobectomie. Ten tweede is er vrijwel geen risico op de potentieel verwoestende complicaties van een totale thyreoïdectomie, zoals bilateraal recidiverend letsel aan de larynxzenuw of permanente hypoparathyreoïdie.
2. Het nauwkeurig identificeren van PTC met een laag risico zou ook de geschiktheid van adjuvans radioactief jodium (RAI) vergroten. RAI-therapie kan zowel voorbijgaande als langdurige bijwerkingen veroorzaken, zoals dysfunctie van de speekselklieren, disfunctie van de eierstokken en testes, en beenmergsuppressie. RAI-therapie brengt ook een theoretisch risico met zich mee op secundaire maligniteit: één schatting is dat 100mCi 131I 56 maligniteiten per 10.000 behandelde patiënten induceert (15). Het beperken van RAI-therapie tot die patiënten die een verbetering van de algehele of ziektevrije overleving zouden behalen, is ook kosteneffectief.
3. Het toezicht op PTC kan om twee redenen druk uitoefenen op patiënten en gezondheidszorgorganisaties: PTC wordt meestal op middelbare leeftijd gediagnosticeerd, en patiënten overleven vaak nog lange tijd na hun diagnose. Dit betekent dat regulier onderzoek en onderzoeken voor het vroegtijdig opsporen van een recidief vele jaren kunnen duren. De follow-up omvat doorgaans jaarlijks lichamelijk onderzoek, serummeting van schildklierstimulerend hormoon en thyroglobuline, en periodieke echografie van de nek. Patiënten met een laag risico kunnen langere intervallen hebben tussen vervolgonderzoeken en onderzoeken, en kunnen mogelijk worden ontslagen uit de surveillance.
4. Het nauwkeurig identificeren van patiënten met een hoog risico op recidief is ook belangrijk. Het is bekend dat het ATA Risk Stratification System onnauwkeurig is bij het voorspellen van herhaling. Bij patiënten die volgens het ATA Risk Stratification System uit 2015 als ‘laag risico’ zijn geclassificeerd, ontwikkelt 16% van de patiënten uiteindelijk een recidiverende ziekte (16). Deze patiënten kunnen als gevolg van deze risicoclassificatie onderbehandeld zijn. Bij patiënten bij wie een nauwkeuriger toewijzing van hoog risico beschikbaar is, kunnen agressievere behandelingen (dat wil zeggen totale thyreoïdectomie en RAI) of deelname aan klinische onderzoeken worden overwogen.

Schildklier GuidePx® door middel van fijne naaldbiopsie Onze onderzoeken zijn tot nu toe uitgevoerd met behulp van chirurgische monsters, en er is een in de handel verkrijgbare test in dit formaat geproduceerd. Uit een recent onderzoek van het Institute of Health Economics is echter gebleken dat een grotere kosteneffectiviteit van Thyroid GuidePx® kan worden bereikt door de test vóór de operatie uit te voeren. Het preoperatief implementeren van een test zou vereisen dat de test goed presteert met behulp van monsters afkomstig van een fijne naaldbiopsie (FNB).

Schildklier-FNB's worden routinematig opgeslagen in CytoLyt, een op methanol gebaseerd gebufferd vloeibaar conserveermiddel, gedurende maximaal 7 dagen voordat de cellen worden overgebracht naar een ThinPrep voor cytologische evaluatie. Wij en anderen (17-21) hebben eerder vastgesteld dat kwaliteits-DNA en RNA kunnen worden afgeleid uit cellen in CytoLyt. Ons recente haalbaarheidsonderzoek bij 12 patiënten met PTC heeft aangetoond dat het uitvoeren van de Thyroid GuidePx®-test op FNB's haalbaar is. Tot dusver is het technische succespercentage 100% en bedraagt ​​de overeenstemming op genniveau met chirurgische monsters meer dan 0,9. Het vertrouwen op een beperkte FNB voor de karakterisering van moleculaire ziekten impliceert echter dat het monster representatief is voor de gehele tumor. Genomische en transcriptomische heterogeniteit is beschreven bij primaire tumoren en metastasen (23). Daarom zal het belangrijk zijn om de overeenstemming tussen monsters verkregen door FNB en chirurgische monsters te documenteren.

DOELSTELLINGEN EN DOEL VAN HET PROEF Het algemene doel van het onderzoek is om te bepalen of het beperktere monster uit een fijne naaldbiopsie voldoende representatief is voor de grotere tumor om een ​​geldige moleculaire classificatie te bepalen met behulp van de Thyroid GuidePx®-test.

Primaire doelstelling 1. Om de overeenstemming te bepalen tussen de moleculaire classificaties van de Thyroid GuidePx® verkregen van FNA's en gematchte chirurgische monsters.

Secundaire doelstellingen

1. Om het technische succespercentage te vergelijken bij het invullen van een geldige Thyroid GuidePx® met behulp van FNA's en chirurgische monsters.
2. Om de uitkomsten van recidief te vergelijken met behulp van het ATA-risicostratificatiesysteem versus patiënten geclassificeerd door Thyroid GuidePx® met behulp van chirurgische monsters.
3. Om de uitkomsten van recidief te vergelijken met behulp van het ATA-risicostratificatiesysteem versus patiënten geclassificeerd door Thyroid GuidePx® met behulp van FNA-monsters.

PROEFONTWERP Proefschema (zie Protocol_Calgary_11 juli 2023.docx bijgevoegd)

Monstername en -analyse Patiënten worden uitgenodigd om deel te nemen als ze een preoperatieve weefseldiagnose van PTC (Bethesda VI) hebben of verdacht zijn voor PTC (Bethesda V), en ze in aanmerking komen voor gedeeltelijke of totale thyreoïdectomie, zoals beschreven in de inclusie- en exclusiecriteria. . Na toestemming zullen patiënten een operatie ondergaan zoals gepland door hun chirurg. Van alle deelnemers zullen demografische, klinische en pathologische gegevens worden verzameld.

Tijdens de operatie, wanneer de schildklier en de tumor zichtbaar zijn, zal de chirurg onder direct zicht een FNB uitvoeren van de dominante tumor (dat wil zeggen: de preoperatief geïdentificeerde laesie). Dit simuleert het meest de in vivo omstandigheden van een preoperatieve FNB, maar beperkt toch de potentiële technische nadelen van een percutane biopsie (bijvoorbeeld: onvoldoende doelgerichtheid van de laesie). Het uit de FNB afkomstige celmateriaal wordt onmiddellijk in het transportmedium (CytoLyt) geplaatst en vervolgens gekoeld. Er worden wekelijks monsters naar het centrale laboratorium gestuurd voor RNA-isolatie en RNASeq. Tegelijkertijd zullen FNB-monsters door een getrainde cytopatholoog worden onderzocht op de aanwezigheid van tumorcellen.

Als er meer dan één knobbel aanwezig is, wordt de FNB-knobbel door de chirurg voor de patholoog gemarkeerd. Onder leiding van een samenwerkende patholoog wordt een stuk van de tumor verwijderd en ingevroren, en een aangrenzend stuk wordt genomen voor formalinefixatie en paraffine-inbedding (FFPE). Eén H & E-glaasje van het FFPE-monster moet worden gekleurd voor H & E, en 3 - 6 ongekleurde coupes zullen worden voorbereid en vervolgens naar het centrale laboratorium worden gestuurd voor microdissectie, RNA-isolatie en RNASeq. Dit proces volgt routinematige monsterverwerkingsprotocollen en interfereert niet met standaardmethoden voor pathologische diagnose.

Als patiënten het optionele geïnformeerde toestemmingsformulier voor biobanking hebben ondertekend en er voldoende bevroren monster over is, wordt het monster bewaard met het oog op hertesten (indien nodig) of ter ondersteuning van aanvullende onderzoeken, zoals volledige transcriptoomanalyse en mutatieanalyse. Voor het gebruik van deze monsters voor deze doeleinden zijn aanvullende ethische goedkeuringen vereist.

Een haalbaarheidsstudie met 12 patiënten is al afgerond. Het technische succespercentage bij het verkrijgen van monsters en het uitvoeren van de test was 100%, de kwantiteit en kwaliteit van RNA waren uitstekend in FNB's, en er was uitstekende overeenstemming op genniveau in tests uitgevoerd op FNB's en chirurgische monsters.

RNASeq voor schildklier GuidePx® zal worden uitgevoerd bij OncoHelix, een klinisch laboratorium met expertise op het gebied van precisie-oncologie, gelegen aan de Cumming School of Medicine, Universiteit van Calgary. Als het testen niet tijdig kan worden uitgevoerd bij OncoHelix, zullen de monsters worden getest bij Protean BioDiagnostics, een CAP/CLIA-gecertificeerd laboratorium in Orlando, Florida dat de test momenteel commercieel uitvoert. Risicoklassen worden toegewezen door software ontworpen door Qualisure Diagnostics met behulp van de gegevens gegenereerd door RNASeq.

Eindpunten

Primair eindpunt:

1. Concordantie, moleculaire risicoclassificatie van FNB's voor papillaire schildklierkanker en bijpassende ingevroren chirurgische monsters

Secundaire eindpunten:

1. Technisch succespercentage bij het invullen van een geldige Thyroid GuidePx® met behulp van FNB's
2. Technisch succespercentage bij het invullen van een geldige Thyroid GuidePx® in chirurgische FFPE-monsters.
3. Biochemisch recidiefpercentage na 5 jaar (thyroglobuline ≥ 1 ng/ml, alleen voor patiënten die een totale thyreoïdectomie hebben ondergaan)
4. Structureel recidiefpercentage na 5 jaar

5. Testprestaties als prognostische test, Schildklier GuidePx®: FNB en chirurgische monsters

   1. Specificiteit: het percentage patiënten zonder structureel recidief, voorspeld door de test
   2. Gevoeligheid: het vermogen van de test om personen te identificeren bij wie de ziekte binnen vijf jaar zal terugkeren (aandeel van structurele recidieven voorspeld)
   3. AUROC
   4. Positief voorspellende waarde
   5. Negatieve voorspellende waarde

6. Prestaties, ATA-risicostratificatie

   1. Specificiteit: het percentage patiënten zonder structureel recidief, voorspeld door de test
   2. Gevoeligheid: het vermogen van de test om personen te identificeren bij wie de ziekte binnen vijf jaar zal terugkeren (aandeel van structurele recidieven voorspeld)
   3. AUROC
   4. Positief voorspellende waarde
   5. Negatieve voorspellende waarde

Blindering en beperking van bias Alleen monsters met voldoende RNA-kwaliteit (DV200>30) zullen in de analyse worden opgenomen. Alleen FNB's die tumorcellen bevatten ("cytologiepositief") worden meegenomen in de concordantieberekening. RNASeq wordt uitgevoerd door een technicus die geen oog heeft voor klinische details. De technicus zal met name niet in staat zijn overeenkomende monsters van chirurgische monsters en FNB's te identificeren. Moleculaire classificatie zal op een geblindeerde manier worden uitgevoerd. De gegevens zullen worden gemonitord door een onafhankelijk Data Monitoring Committee. Het Data Monitoring Committee, bestaande uit minimaal drie personen, waaronder een statisticus, zal toezicht houden op de data-analyse.

Stopregels In onze chirurgische monsters hadden herhalingen tussen batches en intra-batchs consistent een concordantie op genniveau van >0,9. Concordantie op genniveau tussen cytologie-positieve FNB en ingevroren chirurgische monsters (de "gouden standaard") zal worden gecontroleerd voor elke batch van 24 patiënten. Als R<0,9 zullen we pauzeren om de analytische workflow en instrumentatie opnieuw te evalueren. Als de concordantie na 72 patiënten aanhoudend lager is dan 0,9, zullen we stoppen met het evalueren van FNB's, maar zullen we doorgaan met het testen van chirurgische monsters. Omdat het geen risicovol onderzoek betreft, zijn wij niet van plan de proef voortijdig te beëindigen. Zelfs als er een lage overeenstemming is tussen FNB en chirurgische monsters, zullen de gegevens die zijn afgeleid van de studieresultaten met betrekking tot moleculaire classificatie (in chirurgische monsters) nuttig zijn.

SELECTIE EN INTREKKING VAN ONDERWERPEN Inclusiecriteria

1. Leeftijd ≥ 18 jaar
2. Een diagnose van papillaire schildklierkanker op basis van een fijne naaldbiopsie (FNB), geïnterpreteerd als een Bethesda V- of VI-cytologie
3. Tumorgrootte > 1 cm in maximale diameter
4. De patiënt is een operatieve kandidaat
5. De patiënt heeft toestemming gegeven

Uitsluitingscriteria

1. Familiegeschiedenis van schildklierkanker
2. Geschiedenis van bestraling van de nek
3. Kan of wil geen fijne naaldbiopsie ondergaan
4. Niet bereid om een ​​thyreoïdectomie te ondergaan
5. De uiteindelijke pathologie toont geen papillaire schildklierkanker aan
6. Gevallen waarbij er geen duidelijke dominante knobbel is
7. Gevallen waarin er meerdere knobbeltjes zijn die bemonstering van een gedefinieerde knobbel onmogelijk maken

Criteria voor terugtrekking van proefpersonen Proefpersonen kunnen hun deelname op elk moment stopzetten door een van de onderzoekers of het onderzoekspersoneel hiervan op de hoogte te stellen. Gegevens die vóór de intrekking zijn verkregen, worden voor analyse gebruikt, maar na de intrekking worden geen aanvullende gegevens verzameld. Op verzoek van de proefpersoon kunnen vóór het onderzoek monsters worden genomen. Proefpersonen zullen worden vervangen als monsters niet zijn getest door RNASeq (Thyroid GuidePx®).

BEHANDELING VAN ONDERWERPEN De moleculaire classificatie en het herhalingsrisico bepaald door Thyroid GuidePx® zullen aan de arts en de patiënt worden bekendgemaakt. Het herhalingsrisico is gebaseerd op cumulatieve validatiegegevens, waaronder gevallen uit Alberta en Australië. Alleen de resultaten van het ingevroren chirurgische monster (de "gouden standaard") zullen openbaar worden gemaakt. Zoals gebruikelijk worden behandelbeslissingen genomen door de arts in samenwerking met de patiënt, op basis van een synthese van alle beschikbare klinische informatie. Deze klinische proef definieert geen behandeltraject. De frequentie en duur van de follow-up zijn niet protocollair voorgeschreven en worden bepaald door de behandelend arts. Dit is een niet-interventioneel onderzoek en er zal dus geen toezicht worden gehouden op de naleving ervan.

BEOORDELING VAN DE EFFICIËNTIE Een secundaire uitkomst is de testprestatie om het herhalingsrisico te stratificeren. De testprestaties zullen worden vergeleken in monsters verkregen door FNB en chirurgische monsters, en vervolgens vergeleken met de huidige zorgstandaard (het ATA-risicostratificatiesysteem). De tijd tot recidief zal worden gemeten vanaf het moment van volledige initiële behandeling. Bij patiënten met een microscopische ziekte die na de operatie nog resteert, zal de tijd tot recidief worden gemeten vanaf het einde van de therapeutische dosis radioactief jodium. Herhalingsgebeurtenissen zullen worden gedefinieerd op basis van de richtlijnen van de American Thyroid Association uit 2016.

De volgende criteria duiden op een ziektevrije status na therapie: (i) geen klinisch bewijs van tumor; (ii) geen bewijs van tumor op beeldvorming met radioactief jodium en/of cervicale echografie; (iii) voor post-totale thyreoïdectomie, ongestimuleerd serumthyroglobuline (Tg) <0,2 ng/ml; voor post-lobectomie, ongestimuleerde Tg<30. Een onbepaalde respons op therapie zal worden gedefinieerd als: (i) geen klinisch bewijs van tumor; (ii) geen bewijs van tumor op beeldvorming met radioactief jodium en/of cervicale echografie; (iii) voor post-totale thyreoïdectomie, ongestimuleerde Tg 0,2 - 1; voor post-lobectomie, Tg>30. Na een totale thyreoïdectomie wordt een biochemische onvolledige respons gedefinieerd als Tg>1 bij afwezigheid van structurele ziekte. Tg-waarden zijn alleen betrouwbaar als er geen storende antilichamen (TgAb) aanwezig zijn (6).

Er is sprake van een werkelijk recidief als een patiënt eerder een niet-detecteerbare Tg had bij afwezigheid van TgAb en een negatief echografieonderzoek van de nek binnen 1 jaar na de vorige operatie. Aanhoudende ziekte zal worden gedefinieerd als een Tg groter dan de bovengenoemde drempelwaarden, een abnormale echografie van de nek, aanhoudend verhoogde niveaus van TgAb of de aanwezigheid van metastasen op afstand.

Patiënten met een aanhoudende ziekte en/of metastatische ziekte (niet-curatieve resectie) worden niet meegenomen in de berekening van de recidiefvrije overleving.

BEOORDELING VAN DE VEILIGHEID De enige afwijking van de standaard klinische zorg is de intraoperatieve afname van monsters door FNB. In vergelijking met de geplande chirurgische ingreep is dit risico echter klein. Het belangrijkste risico is een klein risico op klinisch significante bloedingen, geschat op <1%. Omdat er geen enkele interventie in verband met dit onderzoek zal plaatsvinden, is er geen plan voor het monitoren van bijwerkingen.

STATISTIEKEN Optimalisatie van RNASeq-omstandigheden voor monsters in CytoLyt RNA zal worden geïsoleerd uit FNB's in CytoLyt volgens SOP. De RNA-kwantiteit zal worden beoordeeld door NanoDrop en de kwaliteit zal worden gekwantificeerd door DV200. RNASeq zal worden uitgevoerd in CytoLyt-monsters en gematchte bevroren monsters op verschillende leesdieptes. In gepaarde CytoLyt- en FFPE-weefsels zullen de teststatistieken worden geëvalueerd als een functie van de invoerweefselopslagmethode, RNA-kwaliteit (DV200) en opslagtijd. Genexpressie zal worden vergeleken in gepaarde CytoLyt- en bevroren weefsels, en vervolgens gecorreleerd tussen omstandigheden. Het belangrijkste resultaat, de toewijzing van moleculaire klassen, zal in gepaarde monsters worden vergeleken.

De volgende prestatiegegevens worden voor elk experiment geëvalueerd, op basis van de checklist van het College of American Pathologists (CAP) met vereisten die specifiek zijn voor sequencing van de volgende generatie:

Teststatistieken

a) RNASeq-metrieken: (i) Leesaantallen (totaal aantal lezingen, unieke lezingen, dubbele lezingen, rRNA-lezingen, strengspecificiteit); (ii) Dekking (aantal metingen dat een bepaalde genomische positie bestrijkt): gemiddelde dekking, gemiddelde variatiecoëfficiënt, 5'/3' dekking, gaten in de dekking, GC-bias (iii) Expressiecorrelatie (gemeten expressieniveaus versus bekende niveaus van de interne standaarden van de ERCC) b) Individuele gendetectie: (i) Analytische gevoeligheid: fractie van de gevallen waarin elk gen in de interne standaard van de ERCC correct is geïdentificeerd.

(ii) Analytische specificiteit: vermogen om de afwezigheid van de genen te identificeren die de interne standaard van de ERCC vormen (iii) Nauwkeurigheid: gevoeligheid + specificiteit

Vergelijking van moleculaire risicostratificatie (schildklier GuidePx®), bepaald in FNB-monsters en in chirurgische monsters. Patiënten met een definitieve pathologie die geen papillaire schildklierkanker aantoont, zullen worden uitgesloten van de concordantieanalyse. Op soortgelijke wijze zullen FNB-monsters die cytologie-negatief zijn, worden uitgesloten van de concordantieanalyse. De toewijzing van de moleculaire klasse zal worden vergeleken tussen monsters verkregen door FNB en overeenkomende ingevroren chirurgische monsters. Chirurgische monsters zullen als de gouden standaard worden beschouwd. De kappa-statistiek zal worden gebruikt om de significantie van de overeenstemming tussen de twee steekproeftypen te bepalen.

Risicolagen worden op een geblindeerde manier toegewezen met behulp van Thyroid GuidePx® en het ATA Risk Stratification System. Voor elke risicoklasse zullen de structurele en biochemische recidiefpercentages na vijf jaar worden vergeleken. Een binair testresultaat, afhankelijk van de ziektestatus (structureel recidief), zal worden gebruikt om de nauwkeurigheid van de test te beoordelen. Structurele herhaling vertegenwoordigt de gouden standaard. Een tweezijdige McNemar-test voor twee afhankelijke verhoudingen zal worden gebruikt om de gevoeligheid en specificiteit van elke methode van risicostratificatie te evalueren, met Holm's aanpassing voor multipliciteit voor het afzonderlijk beoordelen van elke nauwkeurigheidsmaatstaf.

Prestaties van Schildklier GuidePx®

Op basis van de hierboven beschreven onderzoeken zullen de prestaties van Thyroid GuidePx® afzonderlijk worden beoordeeld in FNB-monsters en chirurgische monsters. De prestatiekenmerken worden als volgt beoordeeld:

1. Tijdsafhankelijke AUROC (gebied onder de ontvanger-operatorcurve) (24). Voor de doeleinden van de berekeningen is het drempelniveau voor een positieve test een aanduiding van een gemiddeld of hoog risico (aangezien wordt verwacht dat een toewijzing van een gemiddeld risico zou resulteren in significant andere klinische beslissingen).
2. Gevoeligheid: berekend als cumulatieve gevoeligheid na 5 jaar, zoals beschreven door Kamarudin en Kolamunnage-Dona (24)
3. Specificiteit: berekend als dynamische specificiteit, zoals beschreven door Kamarudin en Kolamunnage-Dona (24)

Berekening van de steekproefomvang We zullen de toewijzing van het moleculaire risico van chirurgische monsters en gematchte FNB's van 109 patiënten vergelijken. Een minimaal niveau van overeenstemming dat klinisch aanvaardbaar is, is 80%. Berekeningen van de steekproefomvang waren gebaseerd op de Lin's Kappa-statistiek voor overeenstemming tussen de twee metingen voor drie moleculaire subgroepen (25). Er werd een tweezijdige hypothese toegepast met een significantieniveau van 0,05, en de power werd vastgesteld op 90%. De grootte van de moleculaire subgroepen werd vastgesteld op 23% (Type 1), 49% (Type 2) en 28% (Type 3). Als de nulhypothese is dat het niveau van overeenstemming tussen FNB en chirurgische monsters 0,6 is, dan zouden we bij 109 patiënten een niveau van overeenstemming van 0,8 of hoger kunnen detecteren. Een concordantie van 0,90 zou detecteerbaar zijn, waarbij 40 patiënten hetzelfde nulniveau van overeenstemming zouden aannemen.

Ongeveer 25% van de patiënten met Bethesda V-cytologie en ongeveer 5% van de patiënten met een Bethesda VI-cytologie zal een goedaardige ziekte hebben. Bovendien is in ongeveer 5% van de gevallen de RNASeq-kwaliteit onvoldoende in FFPE-monsters. Op basis hiervan plannen we een uitvalpercentage van 20%. Daarom is het onderzoek bedoeld om 130 patiënten te includeren.

DIRECTE TOEGANG TOT BRONGEGEVENS/DOCUMENTEN De klinische proeflocatie zal proefgerelateerde monitoring, audits, REB-beoordeling en regelgevende inspectie(s) mogelijk maken, waardoor directe toegang tot brongegevens/documenten wordt geboden.

Audits van klinische onderzoeken worden uitgevoerd om zekerheid te bieden dat de rechten, de veiligheid en het welzijn van patiënten naar behoren worden beschermd, om de naleving van het protocol, de processen en overeenkomsten, de ICH Good Clinical Practice-normen en de toepasselijke wettelijke vereisten te beoordelen, en om de kwaliteit van de gegevens te beoordelen.

Elke binnenlandse regelgevende instantie kan op elk moment langskomen om de onderzoekslocatie te controleren of te inspecteren. Deze audit bestaat uit interviews met de hoofdonderzoeker en het onderzoeksteam, beoordeling van documentatie en praktijken, beoordeling van faciliteiten, apparatuur en verificatie van brongegevens.

De onderzoeker zal elke binnenlandse regelgevende instantie directe toegang verlenen tot papieren en/of elektronische documentatie met betrekking tot de klinische studie (bijv. CRF's, brondocumenten zoals patiëntendossiers van ziekenhuizen en onderzoeksdossiers van onderzoekers). Tijdens een audit konden alle locatiefaciliteiten die verband hielden met de onderzoeksuitvoering bezocht worden (bijv. laboratorium, polikliniek). De onderzoeker stemt ermee in om op redelijke tijden en plaatsen samen te werken en hulp te bieden met betrekking tot eventuele auditactiviteiten.

KWALITEITSCONTROLE EN KWALITEITSBORGING De hoofdonderzoeker zal ervoor zorgen dat alle onderzoeksleden het protocol volgen en voldoen aan de wettelijke en Good Clinical Practice-normen. Alle klinische proeflocaties zullen proefgerelateerde monitoring, audits, REB-beoordeling en regelgevende inspectie(s) mogelijk maken, waardoor directe toegang tot brongegevens/documenten wordt geboden.

Het Data Monitoring Committee (DMC) zal tijdens de uitvoering van de proef als volgt bijeenkomen: 1. Bij aanvang van de proef om het DMC-handvest af te ronden; 2. Nadat er 24 deelnemers zijn ingeschreven; 3. Nadat er 72 deelnemers zijn ingeschreven; en 4. na voltooiing van de inschrijving.

ETHIEK De verantwoordelijke onderzoeker zal ervoor zorgen dat dit onderzoek wordt uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki. Dit onderzoek zal worden uitgevoerd volgens de Canadese en internationale normen van Good Clinical Practice voor alle onderzoeken, inclusief de ICH Harmonised Tripartite Guideline on Good Clinical Practice. Toepasselijke overheidsvoorschriften, richtlijnen voor klinische proeven van de NNHPD en het onderzoeksbeleid en de onderzoeksprocedures van Alberta Health Services zullen ook worden gevolgd.

Dit protocol en eventuele wijzigingen zullen worden voorgelegd aan de HREBA-CC voor formele goedkeuring om het onderzoek uit te voeren. Het besluit van de HREBA-CC over de uitvoering van het onderzoek wordt schriftelijk aan de onderzoeker medegedeeld.

Het openbaar maken van de moleculaire risicoclassificatie van chirurgische monsters (de "gouden standaard") is gerechtvaardigd, aangezien er substantiële uitkomstgegevens van chirurgische monsters bestaan. Bovendien zal de test, wanneer deze proef wordt gelanceerd, commercieel verkrijgbaar zijn als Laboratory Developed Test (LDT).

GEGEVENSVERWERKING EN REGISTRATIE Zodra het onderzoek is voltooid, worden alle gegevens voor dit onderzoek gedurende 15 jaar bewaard, volgens het protocol opgeslagen in het Calgary Center for Clinical Research.

FINANCIERING EN VERZEKERING De proef zal worden gefinancierd door Qualisure Diagnostics, Inc., aangevuld met peer-reviewed subsidies. De verzekering wordt verzorgd door de University of Calgary en Alberta Health Services, evenals door Qualisure Diagnostics.

PUBLICATIEBELEID De bevindingen van deze klinische studie zullen worden gepubliceerd in een peer-reviewed tijdschrift met alle genoemde onderzoekers als co-auteurs. Alle financieringsbronnen zullen worden erkend.

6.0 Beschrijf procedures, behandelingen of activiteiten die verder gaan dan of een aanvulling vormen op de standaardpraktijken: .

De enige afwijking van de standaard klinische zorg is de intraoperatieve verkrijging van monsters door FNB. In vergelijking met de geplande chirurgische ingreep is dit risico echter klein. Het belangrijkste risico is een klein risico op klinisch significante bloedingen, geschat op <1%. Omdat er geen enkele interventie in verband met dit onderzoek zal plaatsvinden, is er geen plan voor het monitoren van bijwerkingen.

Tijdens de operatie, wanneer de schildklier en de tumor zichtbaar zijn, zal de chirurg onder direct zicht een FNB uitvoeren van de dominante tumor (dat wil zeggen: de preoperatief geïdentificeerde laesie). Dit simuleert het meest de in vivo omstandigheden van een preoperatieve FNB, maar beperkt toch de potentiële technische nadelen van een percutane biopsie (bijvoorbeeld: onvoldoende doelgerichtheid van de laesie).

Onder leiding van een samenwerkende patholoog wordt een stuk van de tumor verwijderd en ingevroren, en een aangrenzend stuk wordt genomen voor formalinefixatie en paraffine-inbedding. Weefsel wordt pas vrijgegeven voor onderzoek als er voldoende weefsel is afgenomen voor diagnostisch en klinisch gebruik.