Hienoneulabiopsiaan (FNB) ja kirurgisiin näytteisiin perustuvan molekyyliluokituksen vastaavuus

TAUSTAA Kilpirauhassyöpä on esiintyvyyden mukaan kahdeksanneksi yleisin syöpä, ja ilmaantuvuus on kasvanut yli 6 % vuodessa vuodesta 1992 lähtien. Papillaarinen kilpirauhassyöpä (PTC) muodostaa suurimman osan kilpirauhassyövistä, ja kilpirauhassyövän lisääntyminen voidaan melkein kokonaan selittää pienten PTC-syöpien lisääntyneellä havaitsemisella (1). PTC:llä on yleensä suotuisa ennuste korkealla paranemisasteella. Kuitenkin noin 10-15 % PTC:istä käyttäytyy aggressiivisemmin ja ovat usein resistenttejä tavanomaisille adjuvanttihoidoille, kuten radioaktiiviselle jodille (2,3). Kun otetaan huomioon PTC-tapausten lisääntyminen (ja terveydenhuoltokustannusten mahdollinen taakka), tarkasta ennusteesta on tulossa yhä tärkeämpää. Tarkat ennusteen ja uusiutumisriskin arviot välttävät tarpeettoman laajat leikkaukset, tutkimukset ja seurannat hyvän ennusteen omaavilla henkilöillä ja ohjaavat laajemmat leikkaukset, adjuvanttihoidot ja pitkittyneet seurannat niitä tarvitseville.

American Thyroid Associationin (ATA) Risk Stratification System Hoitopäätökset tekevät American Thyroid Associationin (ATA) Risk Stratification System, joka arvioi sairauden uusiutumisen riskin kliinisten ja patologisten tekijöiden perusteella. Vaikka tämä järjestelmä on takautuvasti validoitu useissa tutkimuksissa, selitetty varianssiosuus on pienempi kuin optimaalinen ja vaihtelee välillä 19–34 % (4, 5). ATA-järjestelmän kyvyttömyys ennustaa täysin uusiutumista saattaa liittyä tämän järjestelmän epäonnistumiseen integroida riittävästi kasvaimen molekyyliprofiiliin liittyvää riskiä. Vain yksi molekyylimarkkeri, BRAFV600E, on tällä hetkellä sisällytetty ATA Risk Stratification System -järjestelmään. Toinen ATA Risk Stratification Systemin rajoitus on, että se voidaan ottaa täysin käyttöön vasta leikkauksen jälkeen, kun kaikki riskin arvioimiseen tarvittavat kliiniset ja patologiset tiedot ovat saatavilla. Tuolloin merkittäviä hoitopäätöksiä on jo tehty ja leikkauksen vaikutukset ovat jo potilaan käsissä.

Riskin arvioiminen ennen hoitoa: Nykyinen hoitotaso Vuonna 2015 ATA raportoi kriteereistä, joita voitaisiin käyttää potilaiden valinnassa konservatiivisempaan leikkaukseen, kuten kilpirauhasen lobektomiaan. Vuoden 2015 ATA-ohjeiden mukaan potilaat, joilla on seuraavat preoperatiiviset kriteerit, katsotaan alhaiseksi riskiksi: kasvaimen koko 1 - 4 cm, kliinisesti solmunegatiivinen, ei kilpirauhasen ulkopuolista leviämistä, ei suvussa kilpirauhassyöpää eikä kaulan sädehoitoa ( 6). Näitä potilaita voitaisiin aluksi hoitaa kilpirauhasen lobektomialla (toisin kuin täydellisellä kilpirauhasen poistoleikkauksella). Kuitenkin 40 - 60 % vaatii täydentävän kilpirauhasen poiston, koska leikkauksen jälkeinen riskikerrostuminen (kaikki leikkauksen jälkeen saatavilla olevat kliiniset ja patologiset tiedot) luokitteli ne suuremmiksi riskeiksi kuin alun perin arvioitiin (7-11). Äskettäisessä tutkimuksessa 51 % potilaista tarvitsi siirtymistä loppuun suoritettuun kilpirauhasen poistoon, koska muita riskitekijöitä tunnistettiin leikkauksen aikana tai sen jälkeen, kun lopullinen patologia oli saatavilla (12). Tämä osoittaa kliinisen preoperatiivisen riskinarvioinnin rajoitukset ja parannetun preoperatiivisen riskin arviointimenetelmän tarpeen. Siksi kilpirauhassyöpäkirurgit ja potilaat hyötyisivät lisätiedoista, jotka tarkentavat päätöstä tehdä lobektomia asianmukaisille potilaille samalla, kun minimoidaan loppuun kilpirauhasen poiston tarve.

Thyroid GuidePx®: uusi molekyyliriskin kerrostusjärjestelmä ATA Risk Stratification Systemin puutteet ennusteen luotettavassa määrittämisessä on korjattu käyttämällä uutta molekyyliriskin kerrostusjärjestelmää, joka sisältää kilpirauhasen GuidePx®-geenin allekirjoituksen. Tietokoneohjelmistoalgoritmia käyttämällä tunnistettiin uusiutumiseen liittyvät transkriptit (mRNA) ja uusiutumisen puuttumiseen liittyvät transkriptit 335 PTC-potilaan koulutussarjassa, minkä jälkeen ne validoitiin 167 potilaan validointisarjassa. Aineistoon sisältyvät kasvaimet olivat tuoreita jäädytettyjä.

Prognostisten geenien ilmentymismallin perusteella tunnistettiin kolme molekyylialatyyppiä. Näitä kutsuttiin tyypeiksi 1, 2 ja 3. Tyypin 3 PTC:illä oli aggressiivisin biologia ja korkein uusiutumisaste. Myöhemmin se validoitiin 124 PTC-potilaalla Koreasta sekä 167 potilaalla Edmontonista.

Molekyylialatyyppejä tarkasteltiin kasvainvaiheen yhteydessä. Tarkemmin sanottuna kasvaimet, joiden koko oli 1 - 4 cm ilman imusolmukesairauksia (jotka käsittävät potilaita, jotka olisivat potentiaalisia ehdokkaita kilpirauhasen lobektomiaan) analysoitiin erikseen potilaista, joilla oli edennyt sairaus. Mielenkiintoista on, että tyypin 3 PTC:illä oli korkea uusiutumisaste kasvainvaiheesta riippumatta. Lobektomiaehdokkailla, joilla oli tyypin 1 ja tyypin 2 PTC:t, uusiutumisaste oli <3 % (Kuva 1A, B, katso Protocol_Calgary_July 11, 2023.docx liitteenä).

Testin suorituskyky NGS-pohjaista testiä, joka tunnisti PTC:n molekyylialatyypin, kutsuttiin Thyroid GuidePx®:ksi. PTC:n yhdistettyä molekyyli- ja kliinistä alaluokitusta käyttämällä Thyroid GuidePx®:ää verrattiin ATA Risk Stratification Systemiin. Kaksi harjoittavaa kliinikkoa määritti ATA-riskin kerrostusryhmät kullekin tapaukselle. Ajasta riippuvan alueen laskemiseksi vastaanottimen toimintakäyrän (AUROC) alla käytettiin binääristä luokitusta: pieni riski vs. keskitaso/korkea riski. AUROC laskettiin TCGA-löytökohortin ja Edmonton-kohortin uusiutumistulosten perusteella. Paras riskikerrostumissuorituskyky saavutettiin Thyroid GuidePx® -testillä kliinisten ominaisuuksien (eli kasvaimen koon ja imusolmukkeiden osallistumisen) yhteydessä. Käytettäessä smoothROCtime-pakettia 5 vuoden AUROC oli 0,80 Thyroid GuidePx®:lle, kun otetaan huomioon kasvaimen koko ja imusolmukkeiden tila, ja 0,51 ATA-riskikerrostumisjärjestelmälle (Kuva 2, katso Protocol_Calgary_July 11, 2023.docx liitteenä).

Thyroid GuidePx®: Määrityksen kuvaus Thyroid GuidePx® -testi on määritys, joka perustuu kohdennettuun hybridi-sieppausrikastus-RNA-sekvensointiin (RNA-Seq). Testin syöte on RNA:ta, joka on eristetty formaliinilla kiinnitetystä parafiiniin upotetusta (FFPE) kudoksesta tai hienoneulaisesta biopsiasta (FNB) otetusta papillaarikilpirauhassyöpänäytteistä. Kirjaston valmisteluun kuuluu kunkin Thyroid GuidePx® -paneelissa olevan geenin kohdealueiden spesifinen monistus. Paneeli koostuu 82 geenistä. Tuloksena saadut näytekirjastot siirretään MiSeq/MiSeqDx-reagenssipatruunalle, joka sisältää kaikki sekvensointia varten tarvittavat reagenssit. Real-Time Analysis (RTA) -ohjelmisto, joka on MiSeq/MiSeqDx-sekvensserin osa, tarjoaa peruspuhelut ja niihin liittyvät laatupisteet sekvensointiajon aikana. Luodaan FASTQ-tiedostoja, jotka sisältävät järjestys- ja laatutiedot. FASTQ-tiedosto on laajalti käytetty tekstipohjainen tiedostomuoto kunkin amplikonin nukleotidisekvenssin ja sitä vastaavien laatupisteiden tallentamiseen. FASTQ-tiedostot toimivat syötteenä sekvenssikohdistusalgoritmeille. Tasatut lukemat kirjoitetaan tiedostoihin BAM-muodossa, jotka muunnetaan myöhemmin lukumääriksi ja lausekearvoiksi. Geenien ilmentymistasot lähetetään sitten algoritmille riskikategorioiden luokittelemiseksi.

Ohjelmisto luokittelee riskit 82 geenin Thyroid GuidePx® -paneelissa olevien geeniryhmien ilmentymismallin perusteella. Kolme molekyyliluokkaa on määritelty 502 potilasnäytteen tutkimukseen perustuen, jotka yhdistävät geenin ilmentymismallin uusiutumattomaan eloonjäämiseen 5 vuoden kohdalla. Korkean riskin ryhmä, joka on rikastettu BRAFV600E-mutaatioilla; ja kaksi pienemmän riskin molekyylialaryhmää tunnistettiin.

Kliininen apuohjelma

Thyroid GuidePx®:n tarjoama tarkempi ennuste saattaa vaikuttaa kliinikon hoitopäätöksiin. Seuraavassa on esimerkkejä siitä, kuinka lääkärit voivat soveltaa Thyroid GuidePx®:stä saatua uutta tietoa:

1. Pienen riskin PTC:tä voitaisiin mahdollisesti hoitaa osittaisella kilpirauhasen poistoleikkauksella (esim. lobektomialla) tai jopa aktiivisella valvonnalla täydellisen kilpirauhasen poiston sijaan. Tällä on kaksi suurta etua ajan- ja kustannussäästöjen lisäksi. Ensinnäkin mahdollinen tarve elinikäiseen kilpirauhashormonin korvaamiseen lobektomian jälkeen vähenee. Toiseksi, ei käytännössä ole riskiä täydellisen kilpirauhasen poiston mahdollisesti tuhoisista komplikaatioista, kuten kahdenvälisestä toistuvasta kurkunpään hermovauriosta tai pysyvästä hypoparatyreoosista.
2. Pienen riskin PTC:n tarkka tunnistaminen lisäisi myös adjuvanttiradioaktiivisen jodin (RAI) tarkoituksenmukaisuutta. RAI-hoito voi aiheuttaa sekä ohimeneviä että pitkäaikaisia ​​sivuvaikutuksia, kuten sylkirauhasten toimintahäiriöitä, munasarjojen ja kivesten toimintahäiriöitä ja luuytimen vajaatoimintaa. RAI-hoidolla on myös teoreettinen riski sekundaariseen maligniteettiin: yksi arvio on, että 100mCi 131I aiheuttaa 56 pahanlaatuista kasvainta 10 000 hoidettua potilasta kohti (15). Kustannustehokasta on myös rajoittaa RAI-hoito niihin potilaisiin, jotka parantaisivat yleistä tai sairaudesta vapaata eloonjäämistä.
3. PTC:n valvonta voi rasittaa potilaita ja terveydenhuoltoorganisaatioita kahdesta syystä: PTC diagnosoidaan yleisimmin keski-iässä, ja potilaat elävät usein pitkiä aikoja diagnoosinsa jälkeen. Tämä tarkoittaa, että säännölliset tarkastukset ja tutkimukset uusiutumisen varhaisessa havaitsemisessa voivat kestää useita vuosia. Seuranta sisältää tyypillisesti vuotuisen fyysisen tutkimuksen, kilpirauhasta stimuloivan hormonin ja tyroglobuliinin mittaamisen seerumissa sekä säännöllisen kaulan ultraäänitutkimuksen. Pienen riskin potilailla voi olla pitempi aikaväli seurantatutkimusten ja tutkimusten välillä, ja heidät voidaan mahdollisesti vapauttaa valvonnasta.
4. On myös tärkeää tunnistaa tarkasti potilaat, joilla on suuri uusiutumisen riski. ATA Risk Stratification System -järjestelmän tiedetään olevan epätarkka toistumisen ennustamisessa. Vuoden 2015 ATA Risk Stratification System -järjestelmän mukaan "pieniriskisiksi" luokitelluista potilaista 16 %:lle potilaista kehittyy lopulta uusiutuva sairaus (16). Nämä potilaat voivat saada alihoitoa tämän riskiluokituksen vuoksi. Potilailla, joilla on saatavilla tarkempi suuren riskin luokitus, voidaan harkita aggressiivisempia hoitoja (ts. kokonaiskilpirauhasen poisto ja RAI) tai osallistumista kliinisiin tutkimuksiin.

Thyroid GuidePx® hienoneulabiopsialla Tutkimuksemme on tähän mennessä tehty kirurgisilla näytteillä, ja kaupallisesti saatavilla oleva määritys on tuotettu tässä muodossa. Kuitenkin Institute of Health Economicsin tuoreessa tutkimuksessa on todettu, että Thyroid GuidePx®:n kustannustehokkuus paranee suorittamalla testi ennen leikkausta. Testin suorittaminen ennen leikkausta edellyttäisi, että testi toimii hyvin käyttämällä hienosta neulabiopsiasta (FNB) saatuja näytteitä.

Kilpirauhasen FNB-soluja säilytetään rutiininomaisesti CytoLytissä, metanolipohjaisessa puskuroidussa nestemäisessä säilöntäaineessa, enintään 7 päivää ennen solujen siirtämistä ThinPrepiin sytologista arviointia varten. Me ja muut (17-21) olemme aiemmin määrittäneet, että laadukasta DNA:ta ja RNA:ta voidaan saada CytoLyt-soluista. Äskettäinen toteutettavuustutkimuksemme, jossa oli mukana 12 PTC-potilasta, osoitti, että Thyroid GuidePx® -määrityksen suorittaminen FNB:ille on mahdollista. Toistaiseksi tekninen onnistumisprosentti on ollut 100 % ja geenitason vastaavuus leikkausnäytteiden kanssa on yli 0,9. Luottaminen rajoitettuun FNB:hen molekyylisairauden karakterisoinnissa merkitsee kuitenkin, että näyte edustaa koko kasvainta. Genomista ja transkriptomista heterogeenisyyttä on kuvattu primaarisissa kasvaimissa ja metastaaseissa (23). Siksi on tärkeää dokumentoida FNB:n keräämien näytteiden ja kirurgisten näytteiden välinen vastaavuus.

KOKEIDEN TAVOITTEET JA TARKOITUS Tutkimuksen yleinen tarkoitus on määrittää, edustaako suppeampi näyte hienosta neulabiopsiasta riittävän suurta kasvainta, jotta voidaan määrittää kelvollinen molekyyliluokitus käyttämällä Kilpirauhasen GuidePx®-testiä.

Ensisijainen tavoite 1. FNA:ista saatujen Thyroid GuidePx® -molekyyliluokittelujen ja vastaavien kirurgisten näytteiden välisen vastaavuuden määrittäminen.

Toissijaiset tavoitteet

1. Vertaile teknistä onnistumisprosenttia kelvollisen kilpirauhasen GuidePx®:n täyttämisessä käyttämällä FNA:ita ja kirurgisia näytteitä.
2. Vertaamaan uusiutumistuloksia käyttämällä ATA-riskin kerrostusjärjestelmää verrattuna potilaisiin, jotka on luokiteltu Thyroid GuidePx®:n mukaan käyttämällä kirurgisia näytteitä.
3. Vertaamaan uusiutumistuloksia käyttämällä ATA-riskin kerrostusjärjestelmää verrattuna potilaisiin, jotka on luokiteltu Thyroid GuidePx®:n avulla käyttämällä FNA-näytteitä.

TRIAL DESIGN Kokeilukaavio (katso Protocol_Calgary_July 11, 2023.docx liitteenä)

Näytteenotto- ja analyysipotilaat kutsutaan osallistumaan, jos heillä on ennen leikkausta kudosdiagnoosi PTC (Bethesda VI) tai epäillään PTC:tä (Bethesda V) ja he ovat kelvollisia osittaiseen tai täydelliseen kilpirauhasen poistoleikkaukseen sisällyttämis- ja poissulkemiskriteerien mukaisesti. . Suostumuksen saatuaan potilaalle suoritetaan leikkaus kirurgin suunnitelmien mukaan. Demografiset, kliiniset ja patologiset tiedot hankitaan kaikilta osallistujilta.

Leikkauksen aikana, kun kilpirauhanen ja kasvain paljastuvat, kirurgi tekee FNB:n hallitsevasta kasvaimesta (eli leesiosta, joka tunnistettiin ennen leikkausta) suoran näön alaisuudessa. Tämä simuloi parhaiten leikkausta edeltävän FNB:n in vivo -olosuhteita, mutta rajoittaa perkutaanisen biopsian mahdollisia teknisiä epäonnistumisia (esim. leesion riittämätön kohdistaminen). FNB:stä peräisin oleva solumateriaali laitetaan välittömästi kuljetusväliaineeseen (CytoLyt) ja jäähdytetään sitten. Näytteet lähetetään viikoittain keskuslaboratorioon RNA:n eristämistä ja RNASeq:iä varten. Samanaikaisesti koulutettu sytopatologi tutkii FNB-näytteiden kasvainsolujen esiintymisen.

Jos läsnä on useampi kuin yksi kyhmy, kirurgi merkitsee FNB-kyhmyn patologia varten. Yhteistyössä toimivan patologin ohjauksessa pala kasvaimesta poistetaan ja pikapakastetaan, ja viereinen pala otetaan formaliinikiinnitystä ja parafiiniin upottamista (FFPE) varten. Yksi H&E-levy FFPE-näytteestä, joka on värjätty H&E:n varalta, ja 3–6 värjäämätöntä leikettä valmistetaan ja lähetetään sitten keskuslaboratorioon mikrodissektiota, RNA-eristystä ja RNASeq-testiä varten. Tämä prosessi noudattaa rutiininomaisia ​​näytteenkäsittelyprotokollia, eikä se vaikuta patologisen diagnoosin standardimenetelmiin.

Jos potilaat ovat allekirjoittaneet valinnaisen tietoisen suostumuslomakkeen biopankkia varten, jos pakastettua näytettä on jäljellä riittävästi, näyte säilytetään uudelleentestausta varten (tarvittaessa) tai lisätutkimusten, kuten koko transkriptianalyysin ja mutaatioanalyysin, tueksi. Näiden näytteiden käyttö näihin tarkoituksiin edellyttäisi lisäeettisiä hyväksyntöjä.

12 potilaan kannattavuustutkimus on jo saatu päätökseen. Tekninen onnistumisaste näytteiden hankinnassa ja määrityksen suorittamisessa oli 100 %, RNA:n määrä ja laatu olivat erinomaisia ​​FNB:issä, ja FNB:illä ja kirurgisilla näytteillä suoritetuissa määrityksissä oli erinomainen geenitason vastaavuus.

RNASeq for Thyroid GuidePx® suoritetaan OncoHelixissä, kliinisessä laboratoriossa, joka on erikoistunut tarkkaan onkologiaan ja joka sijaitsee Calgaryn yliopiston Cumming School of Medicine -yliopistossa. Jos testausta ei voida tehdä ajoissa OncoHelixissä, näytteet testataan kaupallisesti Protean BioDiagnosticsissa, CAP/CLIA-sertifioidussa laboratoriossa Orlandossa, Floridassa, joka tällä hetkellä suorittaa testin. Riskiluokat määritellään Qualisure Diagnosticsin suunnittelemalla ohjelmistolla käyttäen RNASeqin tuottamia tietoja.

Päätepisteet

Ensisijainen päätepiste:

1. Papillaarisen kilpirauhassyövän FNB:iden ja vastaavien pakastettujen kirurgisten näytteiden yhteensopivuus, molekyyliriskiluokitus

Toissijaiset päätepisteet:

1. Tekninen onnistumisprosentti kelvollisen kilpirauhasen GuidePx®:n täyttämisessä FNB:itä käyttämällä
2. Tekninen onnistumisprosentti kelvollisen kilpirauhasen GuidePx®:n täyttämisessä FFPE-leikkausnäytteissä.
3. Biokemiallinen uusiutumistiheys 5 vuoden kuluttua (tyroglobuliini ≥ 1 ng/ml, potilailla, joille on tehty vain täydellinen kilpirauhasen poisto)
4. Rakenteellisen toistumisen määrä 5 vuoden kuluttua

5. Testin suorituskyky prognostisena testinä, Thyroid GuidePx®: FNB ja kirurgiset näytteet

   1. Spesifisyys: niiden potilaiden osuus, joilla ei ole testin ennustettu rakenteellista uusiutumista
   2. Herkkyys: testin kyky tunnistaa henkilöt, joiden sairaus uusiutuu 5 vuoden sisällä (ennustettujen rakenteellisten uusiutumisten osuus)
   3. AUROC
   4. Positiivinen ennustearvo
   5. Negatiivinen ennustearvo

6. Suorituskyky, ATA Risk Stratification

   1. Spesifisyys: niiden potilaiden osuus, joilla ei ole testin ennustettu rakenteellista uusiutumista
   2. Herkkyys: testin kyky tunnistaa henkilöt, joiden sairaus uusiutuu 5 vuoden sisällä (ennustettujen rakenteellisten uusiutumisten osuus)
   3. AUROC
   4. Positiivinen ennustearvo
   5. Negatiivinen ennustearvo

Sokkoutus ja harhan rajoittaminen Vain näytteet, joiden RNA-laatu on riittävä (DV200>30), otetaan mukaan analyysiin. Vain kasvainsoluja sisältävät FNB:t ("sytologiapositiiviset") otetaan mukaan vastaavuuslaskelmaan. RNASeqin suorittaa teknikko, joka on sokea näkemään kliiniset yksityiskohdat. Teknikko ei erityisesti pysty tunnistamaan vastaavia näytteitä kirurgisista näytteistä ja FNB:istä. Molekyyliluokitus suoritetaan sokeutetulla tavalla. Tietoja valvoo riippumaton tiedonseurantakomitea. Tietojen analysointia valvoo tiedonseurantakomitea, johon kuuluu vähintään kolme henkilöä, mukaan lukien tilastotieteilijä.

Pysäytyssäännöt Kirurgisissa näytteissämme erien välisten ja eränsisäisten toistojen geenitason vastaavuus oli johdonmukaisesti > 0,9. Geenitason vastaavuutta sytologiapositiivisten FNB- ja pakastettujen kirurgisten näytteiden välillä ("kultastandardi") seurataan jokaisessa 24 potilaan erässä. Jos R < 0,9, keskeytämme analyyttisen työnkulun ja instrumentoinnin uudelleenarvioinnin. Jos vastaavuus on jatkuvasti alle 0,9 72 potilaan jälkeen, lopetamme FNB:iden arvioinnin, mutta jatkamme kirurgisten näytteiden testaamista. Koska tämä ei ole korkean riskin tutkimus, emme aio lopettaa tutkimusta ennenaikaisesti. Vaikka FNB:n ja kirurgisten näytteiden välillä on alhainen vastaavuus, tutkimustuloksista saadut tiedot molekyyliluokituksen suhteen (kirurgisissa näytteissä) ovat hyödyllisiä.

AINEIDEN VALINTA JA PERUUTTAMINEN Sisällyttämiskriteerit

1. Ikä ≥ 18 vuotta
2. Papillaarisen kilpirauhassyövän diagnoosi, joka perustuu hienoneulaiseen biopsiaan (FNB), joka tulkitaan Bethesda V tai VI sytologiaksi
3. Kasvaimen koko > 1 cm maksimihalkaisijalla
4. Potilas on ehdokas leikkaukseen
5. Potilas on antanut suostumuksensa

Poissulkemiskriteerit

1. Suvussa kilpirauhassyöpää
2. Historia säteilystä niskaan
3. Ei pysty tai ei halua tehdä hienon neulan biopsiaa
4. Ei halua kilpirauhasen poistoleikkaukseen
5. Lopullinen patologia ei osoita papillaarista kilpirauhassyöpää
6. Tapaukset, joissa ei ole selvää hallitsevaa kyhmyä
7. Tapaukset, joissa on useita kyhmyjä, jotka estävät näytteenoton määritellystä kyhmystä

Tutkittavan vetäytymiskriteerit Tutkittavat voivat keskeyttää osallistumisen milloin tahansa ilmoittamalla siitä jollekin tutkijalle tai tutkimushenkilöstölle. Ennen peruuttamista hankittuja tietoja käytetään analysointiin, mutta lisätietoja ei kerätä peruutuksen jälkeen. Tutkittavan pyynnöstä näytteet voidaan ottaa ennen testausta. Koehenkilöt vaihdetaan, jos näytteitä ei ole testattu RNASeq:llä (Tyroid GuidePx®).

KOHTIEN HOITO Thyroid GuidePx®:n määrittämä molekyyliluokitus ja uusiutumisriski ilmoitetaan lääkärille ja potilaalle. Uusiutumisriski perustuu kumulatiivisiin validointitietoihin, mukaan lukien tapaukset Albertasta ja Australiasta. Vain pakastetun kirurgisen näytteen ("kultastandardi") tulokset julkistetaan. Tavanomaiseen tapaan hoitopäätökset tekee lääkäri yhteistyössä potilaan kanssa perustuen synteesiin kaikista saatavilla olevista kliinisistä tiedoista. Tämä kliininen tutkimus ei määrittele hoitoreittiä. Seurantatiheyttä ja -kestoa ei määrätä protokollan mukaan, vaan ne määrää hoitava lääkäri. Tämä on ei-interventiotutkimus, joten noudattamista ei valvota.

TEHOKKUUDEN ARVIOINTI Toissijainen tulos on testien suoritus uusiutumisriskin kerrostamiseksi. Testin suorituskykyä verrataan FNB:n ja leikkausnäytteissä ja sen jälkeen nykyiseen hoitotasoon (ATA-riskin kerrostusjärjestelmä). Toistumiseen kuluva aika mitataan täydellisen alkuhoidon ajankohdasta. Potilailla, joilla on mikroskooppinen sairaus, joka on jäljellä leikkauksen jälkeen, uusiutumiseen kuluva aika mitataan radioaktiivisen jodin terapeuttisen annoksen päättymisestä. Toistuvat tapahtumat määritellään American Thyroid Associationin vuoden 2016 ohjeiden mukaan.

Seuraavat kriteerit merkitsevät taudista vapaata tilaa hoidon jälkeen: (i) ei kliinisiä todisteita kasvaimesta; (ii) ei todisteita kasvaimesta radioaktiivisella jodikuvauksella ja/tai kohdunkaulan ultraäänellä; (iii) post-total tyroidectomy, stimuloimaton seerumin tyroglobuliini (Tg) <0,2 ng/ml; lobektomian jälkeistä aikaa varten, stimuloimaton Tg<30. Määrittämätön vaste hoitoon määritellään seuraavasti: (i) ei kliinisiä todisteita kasvaimesta; (ii) ei todisteita kasvaimesta radioaktiivisella jodikuvauksella ja/tai kohdunkaulan ultraäänellä; (iii) post-total tyroidectomia varten stimuloimaton Tg 0,2 - 1; post lobektomia varten, Tg>30. Täydellisen kilpirauhasen poiston jälkeen biokemiallisesti epätäydellinen vaste määritellään arvoksi Tg>1 rakenteellisen sairauden puuttuessa. Tg-arvot ovat luotettavia vain häiritsevien vasta-aineiden (TgAb) puuttuessa (6).

Sairaus määritellään todelliseksi uusiutumiseksi, jos potilaalla on aiemmin ollut havaitsematon Tg ilman TgAb:tä ja negatiivinen kaulan ultraäänitutkimus vuoden sisällä edellisestä leikkauksesta. Pysyvä sairaus määritellään edellä mainittuja kynnysarvoja suuremmiksi Tg:ksi, epänormaaliksi kaulan ultraääneksi, jatkuvasti kohonneeksi TgAb-tasoksi tai etäismetastaasien läsnäoloksi.

Potilaita, joilla on jatkuva sairaus ja/tai metastaattinen sairaus (ei-parantava resektio), ei oteta huomioon uusiutumattoman eloonjäämisen laskennassa.

TURVALLISUUDEN ARVIOINTI Ainoa poikkeama normaalista kliinisestä hoidosta on FNB:n suorittama leikkauksensisäinen näytteenotto. Suunniteltuun leikkaustoimenpiteeseen verrattuna tämä riski on kuitenkin pieni. Suurin riski on pieni kliinisesti merkittävän verenvuodon riski, jonka arvioidaan olevan <1 %. Koska tähän tutkimukseen ei liity mitään interventioita, haittatapahtumien seurantaa ei ole suunniteltu.

TILASTOJA RNASeq-olosuhteiden optimointi näytteille CytoLytissä RNA eristetään FNB:istä CytoLytissä SOP:n mukaisesti. NanoDrop arvioi RNA:n määrän ja DV200 määrittää laadun. RNASeq suoritetaan CytoLyt-näytteissä ja yhteensopivissa jäädytetyissä näytteissä vaihtelevilla lukusyvyyksillä. Parillisissa CytoLyt- ja FFPE-kudoksissa määritysmetriikkaa arvioidaan syötetyn kudoksen varastointimenetelmän, RNA-laadun (DV200) ja säilytysajan funktiona. Geenien ilmentymistä verrataan parillisissa CytoLyt- ja jäädytetyissä kudoksissa, minkä jälkeen se korreloidaan olosuhteiden välillä. Tärkein tulos, molekyyliluokkamääritys, verrataan parinäytteissä.

Seuraavat suorituskykymittarit arvioidaan kullekin kokeelle perustuen College of American Pathologists (CAP) -tarkistusluetteloon seuraavan sukupolven sekvensointiin liittyvistä vaatimuksista:

Assay Metrics

a) RNASeq-metriikka: (i) lukumäärät (kokonaislukemat, yksilölliset lukemat, kaksoislukemat, rRNA-lukemat, juosteen spesifisyys); (ii) Kattavuus (lukemien määrä, jotka kattavat tietyn genomisen sijainnin): keskimääräinen kattavuus, keskimääräinen variaatiokerroin, 5'/3' kattavuus, kattavuuden aukot, GC-poikkeama (iii) Ilmentymiskorrelaatio (mitatut ilmentymistasot vs. tunnetut tasot) b) Yksittäinen geenin havaitseminen: (i) Analyyttinen herkkyys: osa tapauksista, joissa jokainen ERCC:n sisäisen standardin geeni tunnistetaan oikein.

(ii) Analyyttinen spesifisyys: kyky tunnistaa ERCC:n sisäisen standardin sisältävien geenien puuttuminen (iii) Tarkkuus: herkkyys + spesifisyys

FNB-näytteissä ja kirurgisissa näytteissä määritetyn molekyyliriskin jakautumisen (Tyroid GuidePx®) vertailu Potilaat, joiden lopullinen patologia ei osoita papillaarista kilpirauhassyöpää, suljetaan pois konkordanssianalyysistä. Samoin FNB-näytteet, jotka ovat sytologiaan negatiivisia, jätetään konkordanssianalyysin ulkopuolelle. Molekyyliluokkajakoa verrataan FNB:llä saatujen näytteiden ja yhteensopivien pakastettujen kirurgisten näytteiden välillä. Kirurgisia näytteitä pidetään kultastandardina. Kappa-tilastoa käytetään määrittämään kahden otostyypin konkordanssin merkitys.

Riskitasot määritetään sokkoutetulla tavalla käyttämällä Thyroid GuidePx®:ää ja ATA Risk Stratification System -järjestelmää. Kunkin riskiluokan osalta verrataan rakenteellisia ja biokemiallisia uusiutumislukuja 5 vuoden kohdalla. Testin tarkkuuden arvioimiseen käytetään binääristä testitulosta, joka riippuu sairauden tilasta (rakenteellinen uusiutuminen). Rakenteellinen uusiutuminen edustaa kultaista standardia. Kunkin riskikerrostusmenetelmän herkkyyden ja spesifisyyden arvioimiseen käytetään kaksipuolista McNemar-testiä kahdelle riippuvaiselle suhteelle Holmin moninkertaisuuden oikaisulla kunkin tarkkuusmitan arvioimiseksi erikseen.

Kilpirauhasen GuidePx®:n suorituskyky

Yllä kuvatuista tutkimuksista Thyroid GuidePx®:n suorituskykyä arvioidaan erikseen FNB-näytteissä ja kirurgisissa näytteissä. Suorituskykyominaisuudet arvioidaan seuraavasti:

1. Aikariippuvainen AUROC (vastaanottimen käyttäjäkäyrän alla oleva alue) (24). Laskelmia varten positiivisen testin kynnystaso on keskitason tai korkean riskin nimitys (koska keskitason riskin osoitus johtaisi merkittävästi erilaisiin kliinisiin päätöksiin).
2. Herkkyys: laskettu kumulatiivisena herkkyytenä 5 vuoden kohdalla, kuten Kamarudin ja Kolamunnage-Dona ovat kuvanneet (24)
3. Spesifisyys: laskettu dynaamisena spesifisyytenä, kuten Kamarudin ja Kolamunnage-Dona ovat kuvanneet (24)

Näytteen koon laskeminen Vertaamme 109 potilaan kirurgisista näytteistä ja vastaavista FNB:istä saatua molekyyliriskiä. Kliinisesti hyväksyttävä vähimmäistaso on 80 %. Näytteen kokolaskelmat perustuivat Linin Kappa-tilastoihin kahden mittarin välisen yhteneväisyyden varmistamiseksi kolmelle molekyylialaryhmälle (25). Käytettiin kaksipuolista hypoteesia, jonka merkitsevyystaso oli 0,05, ja tehoksi vahvistettiin 90 %. Molekyylialaryhmien koot olivat 23 % (tyyppi 1), 49 % (tyyppi 2) ja 28 % (tyyppi 3). Jos nollahypoteesi on, että FNB:n ja kirurgisten näytteiden välinen yhteneväisyystaso on 0,6, pystyisimme havaitsemaan 0,8 tai korkeamman yhtäpitävyystason 109 potilaalla. Vastaavuus 0,90 olisi havaittavissa, jos 40 potilasta olettaisi saman nollatasoisen yksimielisyyden.

Noin 25 %:lla potilaista, joilla on Bethesda V -sytologia, ja noin 5 %:lla potilaista, joilla on Bethesda VI -sytologia, on hyvänlaatuinen sairaus. Lisäksi noin 5 %:ssa tapauksista RNASeq-laatu on riittämätön FFPE-näytteissä. Tämän perusteella suunnittelemme 20 prosentin keskeyttämisasteeksi. Siksi tutkimukseen on tarkoitus osallistua 130 potilasta.

SUORA PÄÄSY LÄHDETIETOIHIN/ASIAKIRJOIHIN Kliinisen kokeen sivusto mahdollistaa tutkimukseen liittyvän seurannan, auditoinnit, REB-tarkistukset ja viranomaistarkastukset, mikä tarjoaa suoran pääsyn lähdetietoihin/asiakirjoihin.

Kliinisten tutkimusten auditoinneilla varmistetaan, että potilaiden oikeudet, turvallisuus ja hyvinvointi on asianmukaisesti suojattu, arvioidaan protokollan, prosessien ja sopimusten, ICH:n hyvän kliinisen käytännön standardien ja sovellettavien sääntelyvaatimusten noudattamista sekä tietojen laadun arvioimiseksi.

Mikä tahansa kotimainen sääntelyviranomainen voi tulla milloin tahansa tarkastamaan tai tarkastamaan tutkimuspaikkaa. Tämä auditointi koostuu päätutkijan ja tutkimusryhmän haastatteluista, asiakirjojen ja käytäntöjen tarkastelusta, tilojen, laitteiden ja lähdetietojen todentamisesta.

Tutkija myöntää mille tahansa kotimaiselle sääntelyviranomaiselle suoran pääsyn kliiniseen tutkimukseen liittyvään paperi- ja/tai sähköiseen dokumentaatioon (esim. CRF:t, lähdeasiakirjat, kuten sairaalan potilaskartat ja tutkijan tutkimustiedostot). Auditoinnin aikana voitiin vierailla kaikissa tutkimuksen suorittamiseen liittyvissä työmaatiloissa (esim. laboratorio, poliklinikka). Tutkija sitoutuu tekemään yhteistyötä ja antamaan apua kohtuullisina aikoina ja paikoissa mitä tahansa tilintarkastustoimintaa varten.

LAADUNVALVONTA JA LAADUNVARMISTUS Vastuullinen tutkija varmistaa, että kaikki tutkimuksen jäsenet noudattavat protokollaa ja säännösten ja hyvän kliinisen käytännön standardeja. Kaikki kliiniset tutkimuspaikat mahdollistavat tutkimukseen liittyvän seurannan, auditoinnit, REB-tarkistukset ja viranomaistarkastukset, mikä tarjoaa suoran pääsyn lähdetietoihin/asiakirjoihin.

Data Monitoring Committee (DMC) kokoontuu kokeen suorittamisen aikana seuraavasti: 1. Kokeilun alkaessa viimeistellä DMC-peruskirja; 2. Kun 24 osallistujaa on ilmoittautunut; 3. Kun 72 osallistujaa on ilmoittautunut; ja 4. ilmoittautumisen päätyttyä.

EETTIIKKA Vastuullinen tutkija varmistaa, että tämä tutkimus tehdään Helsingin julistuksen mukaisesti. Tämä tutkimus suoritetaan kanadalaisten ja kansainvälisten hyvän kliinisen käytännön standardien mukaisesti kaikkien tutkimusten osalta, mukaan lukien ICH:n harmonisoitu kolmikantaohje hyvästä kliinisestä käytännöstä. Noudatetaan myös soveltuvia valtion säädöksiä, NNHPD:n kliinisiä kokeita koskevia ohjeita ja Alberta Health Services -tutkimuspolitiikkaa ja -menettelyjä.

Tämä protokolla ja kaikki muutokset toimitetaan HREBA-CC:lle muodollista hyväksyntää varten tutkimuksen suorittamista varten. HREBA-CC:n päätös tutkimuksen suorittamisesta tehdään kirjallisesti tutkijalle.

Molekyyliriskiluokituksen paljastaminen kirurgisista näytteistä ("kultastandardi") on perusteltua, koska kirurgisista näytteistä on olemassa merkittäviä tulostietoja. Lisäksi, kun tämä kokeilu käynnistetään, testi on kaupallisesti saatavilla LDT (Laboratory Developed Test) -testinä.

TIETOJEN KÄSITTELY JA TIETOJEN SÄILYTTÄMINEN Kun tutkimus on valmis, kaikki tämän tutkimuksen tiedot säilytetään 15 vuoden ajan Calgaryn kliinisen tutkimuksen keskuksen protokollan mukaisesti.

RAHOITUS JA VAKUUTUS Kokeilun rahoittaa Qualisure Diagnostics, Inc., jota täydentää vertaisarvioidut apurahat. Vakuutuksen tarjoavat Calgaryn yliopisto ja Alberta Health Services sekä Qualisure Diagnostics.

JULKAISUTOIMINTA Tämän kliinisen tutkimuksen tulokset julkaistaan ​​vertaisarvioidussa lehdessä, jossa kaikki nimetyt tutkijat ovat mukana kirjoittajina. Kaikki rahoituslähteet mainitaan.

6.0 Kuvaa toimenpiteitä, hoitoja tai toimintoja, jotka ylittävät tai täydentävät vakiokäytäntöjä: .

Ainoa poikkeama tavanomaisesta kliinisestä hoidosta on FNB:n intraoperatiivinen näytteenotto. Suunniteltuun leikkaustoimenpiteeseen verrattuna tämä riski on kuitenkin pieni. Suurin riski on pieni kliinisesti merkittävän verenvuodon riski, jonka arvioidaan olevan <1 %. Koska tähän tutkimukseen ei liity mitään interventioita, haittatapahtumien seurantaa ei ole suunniteltu.

Leikkauksen aikana, kun kilpirauhanen ja kasvain paljastuvat, kirurgi tekee FNB:n hallitsevasta kasvaimesta (eli leesiosta, joka tunnistettiin ennen leikkausta) suoran näön alaisuudessa. Tämä simuloi parhaiten leikkausta edeltävän FNB:n in vivo -olosuhteita, mutta rajoittaa perkutaanisen biopsian mahdollisia teknisiä epäonnistumisia (esim. leesion riittämätön kohdistaminen).

Yhteistyössä toimivan patologin ohjauksessa pala kasvaimesta poistetaan ja pikapakastetaan, ja viereinen pala otetaan formaliinikiinnitystä ja parafiinien upottamista varten. Kudos luovutetaan tutkimukseen vasta, kun kudosta on otettu riittävästi diagnostista ja kliinistä käyttöä varten.