Concordancia de clasificación molecular basada en biopsia con aguja fina (FNB) y muestras quirúrgicas

INFORMACIÓN GENERAL El cáncer de tiroides es el octavo cáncer más común por prevalencia y la incidencia ha aumentado >6% por año desde 1992. El cáncer papilar de tiroides (CPT) representa la mayoría de los cánceres de tiroides, y la creciente incidencia del cáncer de tiroides puede atribuirse casi por completo a una mayor detección de pequeños CPT (1). El PTC suele tener un pronóstico favorable con altas tasas de curación. Sin embargo, aproximadamente entre el 10 y el 15 % de los PTC muestran un comportamiento más agresivo y, a menudo, son resistentes a las terapias adyuvantes convencionales como el yodo radiactivo (2,3). Dado el creciente número de casos de PTC (y la posible carga sobre los costos de atención médica), el pronóstico preciso es cada vez más importante. Las estimaciones precisas del pronóstico y el riesgo de recurrencia evitarán cirugías, investigaciones y seguimientos innecesariamente extensos en individuos con buen pronóstico, y dirigirán cirugías más extensas, terapias adyuvantes y seguimientos prolongados a quienes lo necesiten.

Sistema de estratificación de riesgos de la Asociación Estadounidense de Tiroides (ATA) Las decisiones de tratamiento se basan en el Sistema de estratificación de riesgos de la Asociación Estadounidense de Tiroides (ATA), que estima el riesgo de recurrencia de la enfermedad en función de factores clínicos y patológicos. Aunque este sistema ha sido validado retrospectivamente por varios estudios, la proporción de varianza explicada es subóptima y oscila entre 19% y 34% (4, 5). La incapacidad del sistema ATA para predecir completamente la recurrencia puede estar relacionada con la falla de este sistema para integrar adecuadamente el riesgo asociado con el perfil molecular de un tumor. Actualmente, solo un marcador molecular, BRAFV600E, está incorporado en el Sistema de estratificación de riesgos de ATA. Otra limitación del Sistema de Estratificación de Riesgos ATA es que sólo puede implementarse completamente después de la cirugía, cuando todos los datos clínicos y patológicos necesarios para estimar el riesgo están disponibles. En ese momento, ya se han tomado importantes decisiones de tratamiento y el paciente ya se ha dado cuenta del impacto de la cirugía.

Estimación del riesgo antes del tratamiento: el estándar de atención actual En 2015, la ATA informó sobre los criterios que podrían usarse para seleccionar pacientes para cirugías más conservadoras, como la lobectomía tiroidea. Según las pautas de la ATA de 2015, los pacientes con los siguientes criterios preoperatorios se consideran de bajo riesgo: tamaño del tumor de 1 a 4 cm, ganglios clínicamente negativos, sin diseminación extratiroidea, sin antecedentes familiares de cáncer de tiroides y sin antecedentes de radioterapia en el cuello ( 6). Estos pacientes podrían ser tratados inicialmente con una lobectomía tiroidea (a diferencia de una tiroidectomía total). Sin embargo, entre el 40 y el 60% requerirán una tiroidectomía completa porque la estratificación del riesgo postoperatorio (utilizando toda la información clínica y patológica disponible después de la cirugía) los clasificó como de mayor riesgo que el estimado inicialmente (7-11). En un estudio reciente, el 51% de los pacientes requirieron conversión a una tiroidectomía completa porque se reconocieron factores de riesgo adicionales durante la cirugía o después de que la patología final estuvo disponible (12). Esto demuestra las limitaciones de las estimaciones del riesgo clínico preoperatorio y la necesidad de un método mejorado de estimación del riesgo preoperatorio. Por lo tanto, los cirujanos y los pacientes con cáncer de tiroides se beneficiarían de información adicional que perfeccionaría la decisión de realizar una lobectomía en los pacientes apropiados y al mismo tiempo minimizaría la necesidad de completar la tiroidectomía.

Thyroid GuidePx®: un nuevo sistema de estratificación de riesgo molecular Las deficiencias del sistema de estratificación de riesgo ATA para determinar de manera confiable el pronóstico se han abordado utilizando un nuevo sistema de estratificación de riesgo molecular que comprende la firma del gen Thyroid GuidePx®. Utilizando un algoritmo de software informático, se identificaron transcripciones (ARNm) asociadas con la recurrencia y transcripciones asociadas con la ausencia de recurrencia en un conjunto de entrenamiento de 335 pacientes con PTC y luego se validaron en un conjunto de validación de 167 pacientes. Los tumores incluidos en el conjunto de datos estaban frescos congelados.

Se identificaron tres subtipos moleculares según el patrón de expresión de genes de pronóstico. Estos se denominaron Tipo 1, Tipo 2 y Tipo 3. Los PTC de tipo 3 tenían la biología más agresiva y la tasa más alta de recurrencia. Posteriormente se validó en 124 pacientes con PTC de Corea y en 167 pacientes de Edmonton.

Los subtipos moleculares se consideraron en el contexto del estadio del tumor. Específicamente, los tumores que medían entre 1 y 4 cm en ausencia de enfermedad de los ganglios linfáticos (que comprenden pacientes que serían candidatos potenciales para lobectomía tiroidea) se analizaron por separado de los pacientes con enfermedad más avanzada. Curiosamente, los PTC tipo 3 tuvieron una alta tasa de recurrencia independientemente del estadio del tumor. Los candidatos a lobectomía con PTC tipo 1 y tipo 2 tuvieron una tasa de recurrencia de <3 % (Figura 1A, B, consulte Protocol_Calgary_11 de julio de 2023.docx adjunto).

Rendimiento de la prueba La prueba basada en NGS que identificó el subtipo molecular de PTC se llamó Thyroid GuidePx®. La subclasificación molecular y clínica combinada de PTC utilizando Thyroid GuidePx® se comparó con el sistema de estratificación de riesgos ATA. Los grupos de estratificación de riesgo de ATA fueron determinados por dos médicos practicantes para cada caso. Para calcular el área bajo la curva característica operativa del receptor (AUROC) dependiente del tiempo, se aplicó una clasificación binaria: riesgo bajo versus riesgo intermedio/alto. AUROC se calculó en función de los resultados de recurrencia de la cohorte de descubrimiento TCGA y la cohorte de Edmonton. El mejor rendimiento de estratificación del riesgo se logró con la prueba Thyroid GuidePx® junto con las características clínicas (es decir, tamaño del tumor y afectación de los ganglios linfáticos). Utilizando el paquete smoothROCtime, el AUROC a 5 años fue de 0,80 para Thyroid GuidePx® al considerar el tamaño del tumor y el estado de los ganglios linfáticos, y de 0,51 para el sistema de estratificación de riesgo ATA (Figura 2, consulte Protocol_Calgary_11 de julio de 2023.docx adjunto).

Thyroid GuidePx®: Descripción del ensayo La prueba Thyroid GuidePx® es un ensayo basado en la secuenciación de ARN de enriquecimiento por captura híbrida dirigida (RNA-Seq). La entrada de la prueba es ARN aislado de tejido fijado con formalina e incluido en parafina (FFPE) o de muestras de cáncer papilar de tiroides mediante biopsia con aguja fina (FNB). La preparación de la biblioteca implica amplificar específicamente las regiones objetivo de cada uno de los genes en el panel Thyroid GuidePx®. El panel consta de 82 genes. Las bibliotecas de muestras resultantes se transfieren a un cartucho de reactivos MiSeq/MiSeqDx que contiene todos los reactivos para la secuenciación. El software de análisis en tiempo real (RTA), que es un componente del secuenciador MiSeq/MiSeqDx, proporciona llamadas base y puntuaciones de calidad asociadas durante la secuenciación. Se generan archivos FASTQ que contienen la información de secuenciación y calidad. El archivo FASTQ es un formato de archivo basado en texto ampliamente utilizado para almacenar la secuencia de nucleótidos de cada amplicón y su correspondiente puntuación de calidad. Los archivos FASTQ sirven como entrada para algoritmos de alineación de secuencias. Las lecturas alineadas se escriben en archivos en formato BAM que posteriormente se convierten en recuentos de lecturas y valores de expresión. Luego, los niveles de expresión genética se envían al algoritmo para clasificar las categorías de riesgo.

El software clasifica el riesgo según el patrón de expresión de grupos de genes dentro del panel Thyroid GuidePx® de 82 genes. Se han definido tres clases moleculares a partir de un estudio con 502 muestras de pacientes que asocia el patrón de expresión génica con la supervivencia libre de recurrencia a los 5 años. Un grupo de alto riesgo enriquecido con mutaciones BRAFV600E; y se identificaron dos subgrupos moleculares de menor riesgo.

Utilidad clínica

El pronóstico más preciso proporcionado por Thyroid GuidePx® podría afectar las decisiones de tratamiento de los médicos. Los siguientes son ejemplos de cómo los médicos pueden aplicar la nueva información derivada de Thyroid GuidePx®:

1. El CPT de bajo riesgo podría tratarse potencialmente con una tiroidectomía parcial (p. ej., lobectomía) o incluso vigilancia activa, en lugar de una tiroidectomía total. Esto tiene dos beneficios principales además del ahorro de tiempo y costos. En primer lugar, hay una reducción en la posible necesidad de reemplazo de por vida de la hormona tiroidea después de una lobectomía. En segundo lugar, prácticamente no existe riesgo de complicaciones potencialmente devastadoras de una tiroidectomía total, como lesión del nervio laríngeo recurrente bilateral o hipoparatiroidismo permanente.
2. Identificar con precisión el PTC de bajo riesgo también aumentaría la idoneidad del yodo radiactivo adyuvante (RAI). La terapia RAI puede provocar efectos secundarios transitorios y a largo plazo, como disfunción de las glándulas salivales, disfunción ovárica y testicular y supresión de la médula ósea. La terapia RAI también tiene un riesgo teórico de neoplasia maligna secundaria: una estimación es que 100 mCi de 131I induce 56 neoplasias malignas por cada 10.000 pacientes tratados (15). Limitar la terapia RAI a aquellos pacientes que obtendrían una mejora en la supervivencia general o libre de enfermedad también es rentable.
3. La vigilancia del PTC puede suponer una carga para los pacientes y las organizaciones sanitarias por dos razones: el PTC se diagnostica más comúnmente en la mediana edad y los pacientes suelen sobrevivir durante largos períodos después de su diagnóstico. Esto significa que los exámenes e investigaciones regulares para la detección temprana de recurrencias pueden continuar durante muchos años. El seguimiento generalmente implica un examen físico anual, medición sérica de la hormona estimulante de la tiroides y tiroglobulina y ecografías periódicas del cuello. Los pacientes de bajo riesgo pueden tener intervalos más prolongados entre exámenes de seguimiento e investigaciones, y potencialmente podrían ser dados de alta de la vigilancia.
4. También es importante identificar con precisión a los pacientes con alto riesgo de recurrencia. Se sabe que el sistema de estratificación de riesgos ATA es inexacto a la hora de predecir la recurrencia. En los pacientes clasificados como de "bajo riesgo" según el Sistema de estratificación de riesgos de la ATA de 2015, el 16 % de los pacientes acaba desarrollando una enfermedad recurrente (16). Estos pacientes pueden recibir un tratamiento insuficiente como resultado de esta clasificación de riesgo. En pacientes en los que se dispone de una asignación más precisa de alto riesgo, se pueden considerar tratamientos más agresivos (es decir, tiroidectomía total y RAI) o la inscripción en ensayos clínicos.

Thyroid GuidePx® mediante biopsia con aguja fina Hasta ahora, nuestros estudios se han realizado utilizando muestras quirúrgicas y se ha producido un ensayo disponible comercialmente en este formato. Sin embargo, un estudio reciente realizado por el Instituto de Economía de la Salud ha determinado que se lograría una mayor rentabilidad de Thyroid GuidePx® realizando la prueba antes de la cirugía. La implementación de una prueba preoperatoriamente requeriría que la prueba funcione bien utilizando muestras derivadas de una biopsia con aguja fina (BAF).

Los FNB de tiroides se almacenan de forma rutinaria en CytoLyt, un conservante líquido tamponado a base de metanol, durante hasta 7 días antes de transferir las células a un ThinPrep para su evaluación citológica. Nosotros y otros (17-21) hemos determinado previamente que se puede derivar ADN y ARN de calidad a partir de células en CytoLyt. Nuestro reciente estudio de viabilidad que consta de 12 pacientes con PTC demostró que es factible realizar el ensayo Thyroid GuidePx® en FNB. Hasta ahora, la tasa de éxito técnico ha sido del 100% y la concordancia a nivel genético con muestras quirúrgicas supera el 0,9. Sin embargo, la dependencia de un FNB limitado para la caracterización de la enfermedad molecular implica que la muestra es representativa de la totalidad del tumor. Se ha descrito heterogeneidad genómica y transcriptómica en tumores primarios y metástasis (23). Por tanto, será importante documentar la concordancia entre las muestras adquiridas por FNB y las muestras quirúrgicas.

OBJETIVOS Y PROPÓSITO DEL ENSAYO El propósito general del estudio es determinar si la muestra más limitada de una biopsia con aguja fina es suficientemente representativa del tumor más grande para determinar una clasificación molecular válida utilizando la prueba Thyroid GuidePx®.

Objetivo principal 1. Determinar la concordancia entre las clasificaciones moleculares de Thyroid GuidePx® adquiridas a partir de FNA y muestras quirúrgicas coincidentes.

Objetivos secundarios

1. Comparar la tasa de éxito técnico al completar una Thyroid GuidePx® válida utilizando FNA y muestras quirúrgicas.
2. Comparar los resultados de recurrencia utilizando el sistema de estratificación de riesgo ATA versus pacientes clasificados por Thyroid GuidePx® utilizando muestras quirúrgicas.
3. Comparar los resultados de recurrencia utilizando el sistema de estratificación de riesgo ATA versus pacientes clasificados por Thyroid GuidePx® utilizando muestras de FNA.

DISEÑO DE PRUEBA Esquema de prueba (consulte Protocol_Calgary_11 de julio de 2023.docx adjunto)

Adquisición y análisis de muestras Se invitará a participar a los pacientes si tienen un diagnóstico tisular preoperatorio de PTC (Bethesda VI) o sospecha de PTC (Bethesda V), y son elegibles para tiroidectomía parcial o total, como se describe en los criterios de inclusión y exclusión. . Tras el consentimiento, los pacientes se someterán a la cirugía según lo planeado por su cirujano. Se adquirirán datos demográficos, clínicos y patológicos de todos los participantes.

Durante la cirugía, cuando la glándula tiroides y el tumor están expuestos, el cirujano realizará una BAF del tumor dominante (es decir, la lesión identificada preoperatoriamente), bajo visión directa. Esto simula más fielmente las condiciones in vivo de una FNB preoperatoria, pero limita los posibles fallos técnicos de una biopsia percutánea (p. ej., localización inadecuada de la lesión). El material celular derivado del FNB se colocará inmediatamente en el medio de transporte (CytoLyt) y luego se refrigerará. Las muestras se enviarán semanalmente al laboratorio central para aislamiento de ARN y RNASeq. Al mismo tiempo, un citopatólogo capacitado examinará las muestras de FNB para detectar la presencia de células tumorales.

Si hay más de un nódulo, el cirujano marcará el nódulo FNB para el patólogo. Bajo la dirección de un patólogo colaborador, se extirpará una parte del tumor y se congelará, y se tomará una pieza adyacente para fijación con formalina e inclusión en parafina (FFPE). Un portaobjetos H & E de la muestra FFPE se teñirá para H & E, y se prepararán de 3 a 6 secciones sin teñir, luego se enviarán al laboratorio central para microdisección, aislamiento de ARN y RNASeq. Este proceso seguirá protocolos de procesamiento de muestras de rutina y no interferirá con los métodos estándar de diagnóstico patológico.

Si los pacientes han firmado el formulario de consentimiento informado opcional para el biobanco, si queda suficiente muestra congelada, la muestra se conservará con el fin de volver a realizar la prueba (si es necesario) o para respaldar estudios adicionales, como el análisis del transcriptoma completo y el análisis mutacional. El uso de estas muestras para estos fines requeriría aprobaciones éticas adicionales.

Ya se ha completado un estudio de viabilidad que consta de 12 pacientes. La tasa de éxito técnico en la adquisición de muestras y la realización del ensayo fue del 100 %, la cantidad y calidad del ARN fueron excelentes en los FNB y hubo una excelente concordancia a nivel genético en los ensayos realizados en FNB y muestras quirúrgicas.

RNASeq para Thyroid GuidePx® se realizará en OncoHelix, un laboratorio clínico con experiencia en oncología de precisión ubicado en la Facultad de Medicina Cumming de la Universidad de Calgary. Si las pruebas no se pueden realizar de manera oportuna en OncoHelix, las muestras se analizarán en Protean BioDiagnostics, un laboratorio certificado por CAP/CLIA en Orlando, FL, que actualmente realiza la prueba comercialmente. Las clases de riesgo serán asignadas mediante un software diseñado por Qualisure Diagnostics utilizando los datos generados por RNASeq.

Puntos finales

Variable principal:

1. Concordancia, clasificación de riesgo molecular de BAF de cáncer papilar de tiroides y muestras quirúrgicas congeladas compatibles

Criterios de valoración secundarios:

1. Tasa de éxito técnico al completar un Thyroid GuidePx® válido utilizando FNB
2. Tasa de éxito técnico al completar una Thyroid GuidePx® válida en muestras quirúrgicas FFPE.
3. Tasa de recurrencia bioquímica a los 5 años (tiroglobulina ≥ 1 ng/ml, para pacientes que se sometieron únicamente a tiroidectomía total)
4. Tasa de recurrencia estructural a 5 años

5. Rendimiento de la prueba como prueba de pronóstico, Thyroid GuidePx®: FNB y muestras quirúrgicas

   1. Especificidad: la proporción de pacientes sin recurrencia estructural predicha por la prueba.
   2. Sensibilidad: la capacidad de la prueba para identificar individuos cuya enfermedad reaparecerá dentro de 5 años (proporción de recurrencias estructurales previstas)
   3. AUROC
   4. Valor predictivo positivo
   5. Valor predictivo negativo

6. Desempeño, estratificación de riesgos ATA

   1. Especificidad: la proporción de pacientes sin recurrencia estructural predicha por la prueba.
   2. Sensibilidad: la capacidad de la prueba para identificar individuos cuya enfermedad reaparecerá dentro de 5 años (proporción de recurrencias estructurales previstas)
   3. AUROC
   4. Valor predictivo positivo
   5. Valor predictivo negativo

Cegamiento y limitación del sesgo Solo se incluirán en el análisis muestras con suficiente calidad de ARN (DV200>30). Sólo los FNB que contengan células tumorales ("citología positiva") se incluirán en el cálculo de concordancia. RNASeq será realizado por un técnico que no conoce ningún detalle clínico. Específicamente, el técnico no podrá identificar muestras coincidentes de muestras quirúrgicas y FNB. La clasificación molecular se realizará de forma ciega. Los datos serán monitoreados por un Comité de Monitoreo de Datos independiente. El Comité de Seguimiento de Datos, formado por al menos tres personas, incluido un estadístico, supervisará el análisis de los datos.

Reglas de detención En nuestras muestras quirúrgicas, las repeticiones entre lotes e intralotes tuvieron consistentemente una concordancia a nivel genético de> 0,9. Se controlará la concordancia a nivel genético entre FNB positivo para citología y muestras quirúrgicas congeladas (el "estándar de oro") para cada lote de 24 pacientes. Si R<0,9, haremos una pausa para volver a evaluar el flujo de trabajo analítico y la instrumentación. Si la concordancia es persistentemente inferior a 0,9 después de 72 pacientes, dejaremos de evaluar los BAF, pero continuaremos analizando muestras quirúrgicas. Dado que este no es un estudio de alto riesgo, no pretendemos finalizar el ensayo prematuramente. Incluso si existe una baja concordancia entre la BAF y las muestras quirúrgicas, los datos derivados del estudio de los resultados en relación con la clasificación molecular (en muestras quirúrgicas) serán útiles.

SELECCIÓN Y RETIRADA DE ASIGNATURAS Criterios de inclusión

1. Edad ≥ 18 años
2. Un diagnóstico de cáncer papilar de tiroides basado en una biopsia con aguja fina (BAF) interpretada como una citología Bethesda V o VI.
3. Tamaño del tumor > 1 cm de diámetro máximo
4. El paciente es un candidato operativo.
5. El paciente ha dado su consentimiento.

Criterio de exclusión

1. Historia familiar de cáncer de tiroides.
2. Historia de radiación en el cuello.
3. No puede o no quiere someterse a una biopsia con aguja fina
4. No dispuesto a someterse a tiroidectomía.
5. La patología final no demuestra cáncer papilar de tiroides.
6. Casos en los que no existe un nódulo dominante claro
7. Casos en los que hay múltiples nódulos que impiden el muestreo de un nódulo definido

Criterios de retiro del sujeto Los sujetos pueden suspender su participación en cualquier momento notificando a uno de los investigadores o al personal de investigación. Los datos adquiridos antes del retiro se utilizarán para el análisis, pero no se recopilarán datos adicionales después del retiro. A petición del sujeto, se podrán retirar muestras antes de realizar la prueba. Los sujetos serán reemplazados si las muestras no han sido analizadas por RNASeq (Thyroid GuidePx®).

TRATAMIENTO DE LOS SUJETOS La clasificación molecular y el riesgo de recurrencia determinados por Thyroid GuidePx® serán revelados al médico y al paciente. El riesgo de recurrencia se basa en datos de validación acumulativos que incluyen casos de Alberta y Australia. Sólo se divulgarán los resultados de la muestra quirúrgica congelada (el "estándar de oro"). Como es habitual, las decisiones de tratamiento las tomará el médico en colaboración con el paciente, basándose en una síntesis de toda la información clínica disponible. Este ensayo clínico no define una vía de tratamiento. La frecuencia y duración del seguimiento no serán prescritas por protocolo y las determinará el médico tratante. Este es un estudio no intervencionista, por lo que no se controlará el cumplimiento.

EVALUACIÓN DE LA EFICACIA Un resultado secundario es el desempeño de la prueba para estratificar el riesgo de recurrencia. El rendimiento de la prueba se comparará en muestras adquiridas por FNB y muestras quirúrgicas, luego se comparará con el estándar de atención actual (el sistema de estratificación de riesgo ATA). El tiempo hasta la recurrencia se medirá desde el momento de completar el tratamiento inicial. En pacientes con enfermedad microscópica restante después de la cirugía, el tiempo hasta la recurrencia se medirá desde que se completa la dosis terapéutica de yodo radiactivo. Los eventos de recurrencia se definirán según las pautas de la Asociación Estadounidense de Tiroides de 2016.

Los siguientes criterios indicarán un estado libre de enfermedad después de la terapia: (i) no hay evidencia clínica de tumor; (ii) no hay evidencia de tumor en las imágenes con yodo radiactivo y/o en la ecografía cervical; (iii) para tiroidectomía post-total, tiroglobulina (Tg) sérica no estimulada <0,2 ng/ml; para poslobectomía, Tg no estimulada <30. Una respuesta indeterminada a la terapia se definirá como: (i) ninguna evidencia clínica de tumor; (ii) no hay evidencia de tumor en las imágenes con yodo radiactivo y/o en la ecografía cervical; (iii) para tiroidectomía post-total, Tg no estimulada 0,2 - 1; para poslobectomía, Tg>30. Después de una tiroidectomía total, una respuesta bioquímica incompleta se define como Tg>1 en ausencia de enfermedad estructural. Los valores de Tg sólo son fiables en ausencia de anticuerpos de interferencia (TgAb) (6).

La enfermedad se definirá como una verdadera recurrencia si un paciente tenía previamente una Tg indetectable en ausencia de TgAb y una ecografía del cuello negativa dentro del año posterior a la operación anterior. La enfermedad persistente se definirá como Tg superior a los umbrales anteriores, una ecografía anormal del cuello, niveles persistentemente elevados de TgAb o presencia de metástasis a distancia.

Los pacientes con enfermedad persistente y/o enfermedad metastásica (resección no curativa) no se incluirán en el cálculo de la supervivencia libre de recurrencia.

EVALUACIÓN DE LA SEGURIDAD La única desviación de la atención clínica estándar es la obtención intraoperatoria de muestra por parte de FNB. Sin embargo, en comparación con el procedimiento quirúrgico planificado, este riesgo es pequeño. El riesgo principal es un pequeño riesgo de hemorragia clínicamente significativa, estimado en <1%. Como no habrá ninguna intervención asociada con este estudio, no existe ningún plan para monitorear los eventos adversos.

ESTADÍSTICAS Optimización de las condiciones de RNASeq para muestras en CytoLyt El ARN se aislará de FNB en CytoLyt según el SOP. NanoDrop evaluará la cantidad de ARN y DV200 cuantificará la calidad. RNASeq se realizará en muestras de CytoLyt y muestras congeladas emparejadas a diferentes profundidades de lectura. En tejidos CytoLyt y FFPE emparejados, las métricas del ensayo se evaluarán en función del método de almacenamiento del tejido de entrada, la calidad del ARN (DV200) y el tiempo de almacenamiento. La expresión genética se comparará en CytoLyt emparejado y en tejidos congelados, y luego se correlacionará entre condiciones. El resultado más importante, la asignación de clases moleculares, se comparará en muestras pareadas.

Se evaluarán las siguientes métricas de rendimiento para cada experimento, según la lista de verificación de requisitos específicos de la secuenciación de próxima generación del College of American Pathologists (CAP):

Métricas de ensayo

a) Métricas de RNASeq: (i) Recuentos de lecturas (lecturas totales, lecturas únicas, lecturas duplicadas, lecturas de ARNr, especificidad de cadena); (ii) Cobertura (número de lecturas que cubren una posición genómica determinada): cobertura media, coeficiente de variación medio, cobertura 5'/3', brechas en la cobertura, sesgo de GC (iii) Correlación de expresión (niveles de expresión medidos versus niveles conocidos de los estándares internos del ERCC) b) Detección de genes individuales: (i) Sensibilidad analítica: fracción de casos en los que cada gen en el estándar interno del ERCC está correctamente identificado.

(ii) Especificidad analítica: capacidad de identificar la ausencia de los genes que componen el estándar interno del ERCC (iii) Precisión: sensibilidad + especificidad

Comparación de la estratificación del riesgo molecular (Thyroid GuidePx®) determinada en muestras FNB y en muestras quirúrgicas Los pacientes con una patología final que no demuestre cáncer papilar de tiroides serán excluidos del análisis de concordancia. Del mismo modo, las muestras de BAF que sean citológicamente negativas serán excluidas del análisis de concordancia. La asignación de clase molecular se comparará entre muestras obtenidas por FNB y muestras quirúrgicas congeladas coincidentes. Las muestras quirúrgicas se considerarán el estándar de oro. La estadística kappa se utilizará para determinar la importancia de la concordancia entre los dos tipos de muestras.

Los estratos de riesgo se asignarán de forma ciega utilizando Thyroid GuidePx® y el sistema de estratificación de riesgo ATA. Se compararán las tasas de recurrencia estructural y bioquímica a los 5 años para cada clase de riesgo. Se utilizará un resultado de prueba binario, condicionado al estado de la enfermedad (recurrencia estructural), para evaluar la precisión de la prueba. La recurrencia estructural representa el estándar de oro. Se utilizará una prueba de McNemar bilateral para dos proporciones dependientes para evaluar la sensibilidad y especificidad de cada método de estratificación del riesgo, con el ajuste de Holm por multiplicidad para evaluar cada medida de precisión por separado.

Rendimiento de Thyroid GuidePx®

A partir de los estudios descritos anteriormente, el rendimiento de Thyroid GuidePx® se evaluará por separado en muestras FNB y muestras quirúrgicas. Las características de desempeño se evaluarán de la siguiente manera:

1. AUROC (área bajo la curva del operador receptor) dependiente del tiempo (24). A los efectos de los cálculos, el nivel umbral para una prueba positiva es una designación de riesgo intermedio o alto (ya que se prevé que una asignación de riesgo intermedio daría lugar a decisiones clínicas significativamente diferentes).
2. Sensibilidad: calculada como sensibilidad acumulada a 5 años, según lo descrito por Kamarudin y Kolamunnage-Dona (24)
3. Especificidad: calculada como especificidad dinámica, como lo describen Kamarudin y Kolamunnage-Dona (24)

Cálculo del tamaño de la muestra Compararemos la asignación de riesgo molecular de muestras quirúrgicas y FNB coincidentes de 109 pacientes. Un nivel mínimo de concordancia clínicamente aceptable es del 80%. Los cálculos del tamaño de la muestra se basaron en la estadística Kappa de Lin para determinar la concordancia entre las dos medidas para tres subgrupos moleculares (25). Se aplicó una hipótesis bilateral con un nivel de significancia de 0,05 y el poder se fijó en 90%. Los tamaños de los subgrupos moleculares se fijaron en 23% (Tipo 1), 49% (Tipo 2) y 28% (Tipo 3). Si la hipótesis nula es que el nivel de concordancia entre la BAF y las muestras quirúrgicas es de 0,6, entonces podríamos detectar un nivel de concordancia de 0,8 o superior con 109 pacientes. Sería detectable una concordancia de 0,90 si 40 pacientes supusieran el mismo nivel nulo de acuerdo.

Aproximadamente el 25 % de los pacientes con citología Bethesda V y aproximadamente el 5 % de los pacientes con citología Bethesda VI tendrán una enfermedad benigna. Además, en aproximadamente el 5% de los casos, la calidad de RNASeq es insuficiente en muestras FFPE. En base a esto, planeamos una tasa de deserción del 20%. Por tanto, el ensayo está diseñado para incluir a 130 pacientes.

ACCESO DIRECTO A LOS DATOS/DOCUMENTOS FUENTE El sitio del ensayo clínico permitirá monitoreo, auditorías, revisión de REB e inspecciones regulatorias relacionadas con el ensayo, proporcionando acceso directo a los datos/documentos fuente.

Las auditorías de ensayos clínicos se realizan para garantizar que los derechos, la seguridad y el bienestar de los pacientes estén adecuadamente protegidos, para evaluar el cumplimiento del protocolo, los procesos y los acuerdos, los estándares de Buenas Prácticas Clínicas de la ICH y los requisitos reglamentarios aplicables, y para evaluar la calidad de los datos.

Cualquier agencia reguladora nacional puede venir en cualquier momento a auditar o inspeccionar el sitio del estudio. Esta auditoría consta de entrevistas con el investigador principal y el equipo de estudio, revisión de documentación y prácticas, revisión de instalaciones, equipos y verificación de datos fuente.

El investigador otorgará a cualquier agencia reguladora nacional acceso directo a la documentación impresa y/o electrónica relacionada con el estudio clínico (p. ej. CRF, documentos fuente como historias clínicas de pacientes hospitalarios y archivos de estudios de investigadores). Todas las instalaciones del sitio relacionadas con la realización del estudio podrían visitarse durante una auditoría (p. ej. laboratorio, departamento ambulatorio). El investigador acepta cooperar y brindar asistencia en momentos y lugares razonables con respecto a cualquier actividad de auditoría.

CONTROL DE CALIDAD Y GARANTÍA DE CALIDAD El investigador principal se asegurará de que todos los miembros del estudio sigan el protocolo y cumplan con los estándares regulatorios y de buenas prácticas clínicas. Todos los sitios de ensayos clínicos permitirán monitoreo, auditorías, revisión de REB e inspecciones regulatorias relacionadas con los ensayos, brindando acceso directo a los datos/documentos de origen.

El Comité de Monitoreo de Datos (DMC) se reunirá durante la realización del ensayo de la siguiente manera: 1. Al inicio del ensayo para finalizar los Estatutos del DMC; 2. Después de que se hayan inscrito 24 participantes; 3. Después de que se hayan inscrito 72 participantes; y 4. después de completar la inscripción.

ÉTICA El investigador responsable garantizará que este estudio se realice de acuerdo con la Declaración de Helsinki. Este estudio se llevará a cabo según los estándares canadienses e internacionales de Buenas Prácticas Clínicas para todos los estudios, incluida la Guía Tripartita Armonizada de la ICH sobre Buenas Prácticas Clínicas. También se seguirán las regulaciones gubernamentales aplicables, las pautas de ensayos clínicos del NNHPD y las políticas y procedimientos de investigación de los Servicios de Salud de Alberta.

Este protocolo y cualquier modificación se presentará al HREBA-CC para su aprobación formal para realizar el estudio. La decisión del HREBA-CC sobre la realización del estudio se realizará por escrito al investigador.

La divulgación de la clasificación del riesgo molecular de las muestras quirúrgicas (el "estándar de oro") es justificable, ya que existen datos sustanciales sobre los resultados de las muestras quirúrgicas. Además, cuando se lance esta prueba, la prueba estará disponible comercialmente como prueba desarrollada en laboratorio (LDT).

MANEJO DE DATOS Y MANTENIMIENTO DE REGISTROS Una vez que se complete el estudio, todos los datos de este estudio se conservarán durante 15 años y se almacenarán según el protocolo en el Centro de Investigación Clínica de Calgary.

FINANCIACIÓN Y SEGURO El ensayo será financiado por Qualisure Diagnostics, Inc., complementado con subvenciones revisadas por pares. El seguro será proporcionado por la Universidad de Calgary y los Servicios de Salud de Alberta, así como por Qualisure Diagnostics.

POLÍTICA DE PUBLICACIÓN Los hallazgos de este estudio clínico se publicarán en una revista revisada por pares con todos los investigadores nombrados como coautores. Se reconocerán todas las fuentes de financiación.

6.0 Describa procedimientos, tratamientos o actividades que estén por encima o además de las prácticas estándar: .

La única desviación de la atención clínica estándar es la obtención intraoperatoria de muestra por parte de FNB. Sin embargo, en comparación con el procedimiento quirúrgico planificado, este riesgo es pequeño. El riesgo principal es un pequeño riesgo de hemorragia clínicamente significativa, estimado en <1%. Como no habrá ninguna intervención asociada con este estudio, no existe ningún plan para monitorear los eventos adversos.

Durante la cirugía, cuando la glándula tiroides y el tumor están expuestos, el cirujano realizará una BAF del tumor dominante (es decir, la lesión identificada preoperatoriamente), bajo visión directa. Esto simula más fielmente las condiciones in vivo de una FNB preoperatoria, pero limita los posibles fallos técnicos de una biopsia percutánea (p. ej., localización inadecuada de la lesión).

Bajo la dirección de un patólogo colaborador, se extirpará una parte del tumor y se congelará, y se tomará una parte adyacente para fijarla con formalina e incluirla en parafina. El tejido se liberará para investigación solo una vez que se haya extraído suficiente tejido para uso clínico y diagnóstico.