离体肺灌注系统对肺移植物微生物组及其炎症反应的影响。 (ExBioma)

取样和储存

• 巴尔：
• 技术：将支气管镜插入第 6 段，滴注等份无菌盐水。 如果是右肺，则将在第 3 段和第 5 段重复该过程；如果是左肺，则将在第 6 段和舌叶中重复该过程。 每个移植物将完成 20-30cc 的 BAL。
• 储存：样品采集后立即冷冻，并用蓄冷器转移至实验室，确保不解冻。
• 分析：将分析肺部微生物组。
• 肺活检：
• 技术：使用不可吸收自动缝合线进行至少 2cm3 的肺活检。
• 储存：样本将保存在RNA稳定溶液试剂（QIAGEN）中，使样本可以在室温下保存直至冷冻，从而避免RNA降解。
• 分析：炎症信号转录的 RNA 测序。
• 离体灌注液：
• 技术：用 20cc 注射器无菌取样。
• 储存：样品采集后立即冷冻，并用蓄冷器转移至实验室，确保不解冻。
• 分析：微生物组分析
• 保存液溶液：
• 技术：用 20cc 注射器无菌取样。
• 储存：样品采集后立即冷冻，并用蓄冷器转移至实验室，确保不解冻。
• 分析：微生物组和细胞因子分析

所有样品将保存在-80℃的冰箱中

- 微生物组分析 为了分析微生物多样性，将通过 PCR 从细菌 DNA 中扩增 16S 基因的 V4 可变区。 扩增子将使用 Illumina (MiSeq) 技术进行测序。 样品将被处理，并且每个样品的每个序列将生成超过 10,000 个 300bp 序列。

基因表达分析 RNA 提取将使用商业 RNeasy Mini Kit (QIAGEN) 进行。 将使用 SignArray（AnyGenes®，法国巴黎）预先设计的 TransplantRejection 面板通过定量 PCR (qPCR) 进行基因表达分析，该面板包括 84 个已被描述与移植排斥中的免疫反应相关的基因。 这些是： 面板中包含的基因：CX3CR1、ICAM1、ITGA2、ITGAE、ITGAM、PECAM1、THBS1、THBS2、VCAM1、COL1A2、CCR5、CCR7、CD40、CD40LG、CD80、CD86、CTLA4、CXCR3、STAT4、TGFB1、CD44 , CTGF, MMP1, MMP2, MMP7, MMP9, BMP7, CCL11, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CSF2, CXCL10, IFNG, IL10, IL12A, IL13, IL16, IL1B, IL2, IL2RA, IL3, IL32, IL4, IL5 , IL6, IL8, TNF, TGFB2, TGFB3, TIMP1, VEGFA, MS4A1, CXCL11, CXCL9, CXCR4, ADAM17, C3, CASP1, CASP3, CASP8, CCR2, CCR3, CD14, CD28, CD8A, FAS, FASLG, FCGR1A, GZMA 、GZMB、NFKB1、NOS2、PRF1、PSMB9、STAT1、STAT6、TAP1、TLR3、TLR4、TLR9、TNFAIP3、TNFSF10。

- 细胞因子分析 灌注液中细胞因子的测定将使用基于 Luminex™ xMAP™ 技术（多分析物分析）的免疫测定法进行，该技术可以同时定量和检测不同的分泌蛋白（细胞因子、趋化因子、生长因子等） .)我们将使用专为感兴趣的基因产物设计的面板。

使用基于 Luminex™ xMAP™ 技术的免疫测定法测量细胞因子水平，该技术允许对不同细胞因子进行多参数分析。 为此，根据已发表的有关他汀类药物对全身水平的细胞因子和其他促炎趋化因子产生的影响的文献，以及有关肺移植中涉及的细胞因子的文献证据，设计了个性化细胞因子面板。 为此目的设计的面板中分析的细胞因子是 IFN γ、IL-1 β、IL-6、IL-8 (CXCL8)、IL-18、IP-10 (CXCL10)、MCP-1 (CCL2)、MIP- 1 α (CCL3)、TNF α、VEGF-D（定制 Procartaplex Multiplex Panel，Invitrogen，ThermoFisher Scientific，MA，美国）。 将使用随试剂提供的 Invitrogen ProcartaPlex Analyst 1.0 软件进行免疫学分析。

- 序列的生物信息分析 为了获得每个样品的微生物组成，我们将使用 QIIME 软件。 QIIME 是一个软件管道，它使用系统发育信息和多元统计技术来比较微生物群落并确定它们是否具有统计差异等。 该计划还确定了对这些差异影响最大的物种，并发现了表征特定样本组的各种类型的模式。