Impacto do sistema de perfusão pulmonar ex vivo no microbioma dos enxertos pulmonares e sua reação inflamatória. (ExBioma)

COLETA E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS

• BAL:
• Técnica: O broncoscópio será inserido no segmento 6, serão instiladas alíquotas de soro fisiológico estéril. O procedimento será repetido nos segmentos 3 e 5, no caso do pulmão direito, e no segmento 6 e língula no pulmão esquerdo. 20-30 cc de BAL serão completados para cada enxerto.
• Armazenamento: As amostras serão congeladas imediatamente após a coleta e transferidas para o laboratório com acumulador de frio para garantir que não descongelem.
• Análise: O microbioma pulmonar será analisado.
• Biópsia pulmonar:
• Técnica: Será realizada biópsia pulmonar de no mínimo 2cm3 com sutura automática inabsorvível.
• Armazenamento: As amostras serão preservadas em solução reagente de estabilização de RNA (QIAGEN), que permite que as amostras sejam mantidas em temperatura ambiente até serem congeladas, evitando a degradação do RNA.
• Análise: Sequenciamento de RNA de transcrição de sinais inflamatórios.
• Solução líquida de perfusão ex vivo:
• Técnica: Coleta de amostras estéreis com seringa de 20 cc.
• Armazenamento: As amostras serão congeladas imediatamente após a coleta e transferidas para o laboratório com acumulador de frio para garantir que não descongelem.
• Análise: análise do microbioma
• Solução líquida de preservação:
• Técnica: Coleta de amostras estéreis com seringa de 20 cc.
• Armazenamento: As amostras serão congeladas imediatamente após a coleta e transferidas para o laboratório com acumulador de frio para garantir que não descongelem.
• Análise: análise de microbioma e citocinas

Todas as amostras serão armazenadas em freezer a -80

- Análise do microbioma Para análise da diversidade microbiana, a região variável V4 do gene 16S será amplificada a partir do DNA bacteriano por PCR. Os amplicons serão sequenciados usando a tecnologia Illumina (MiSeq). As amostras serão processadas e mais de 10.000 sequências de 300 pb por sequência por amostra serão geradas.

Análise de expressão gênica A extração de RNA será realizada utilizando o kit comercial RNeasy Mini Kit (QIAGEN). A análise da expressão gênica será realizada por PCR quantitativo (qPCR) usando o painel TransplantRejection pré-projetado da SignArray (AnyGenes®, Paris, França) que inclui 84 ​​genes que foram descritos como relacionados à resposta imune na rejeição de transplantes. São eles: Genes incluídos no painel: CX3CR1, ICAM1, ITGA2, ITGAE, ITGAM, PECAM1, THBS1, THBS2, VCAM1, COL1A2, CCR5, CCR7, CD40, CD40LG, CD80, CD86, CTLA4, CXCR3, STAT4, TGFB1, CD44 , CTGF, MMP1, MMP2, MMP7, MMP9, BMP7, CCL11, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CSF2, CXCL10, IFNG, IL10, IL12A, IL13, IL16, IL1B, IL2, IL2RA, IL3, IL32, IL4, IL5 , IL6, IL8, TNF, TGFB2, TGFB3, TIMP1, VEGFA, MS4A1, CXCL11, CXCL9, CXCR4, ADAM17, C3, CASP1, CASP3, CASP8, CCR2, CCR3, CD14, CD28, CD8A, FAS, FASLG, FCGR1A, GZMA , GZMB, NFKB1, NOS2, PRF1, PSMB9, STAT1, STAT6, TAP1, TLR3, TLR4, TLR9, TNFAIP3, TNFSF10.

- Análise de citocinas A determinação de citocinas no fluido de perfusão será realizada utilizando imunoensaios baseados na tecnologia Luminex™ xMAP™ (perfil multi-analítico) que permitem a quantificação e detecção simultânea de diferentes proteínas secretadas (citocinas, quimiocinas, fatores de crescimento, etc. .) Usaremos painéis projetados especificamente para os produtos genéticos de interesse.

Os níveis de citocinas são medidos utilizando um imunoensaio baseado na tecnologia Luminex™ xMAP™ que permite a análise multiparamétrica das diferentes citocinas. Para tal, é desenhado um painel personalizado de citocinas com base na literatura publicada sobre o efeito das estatinas na produção de citocinas e outras quimiocinas pró-inflamatórias a nível sistémico, bem como em evidências bibliográficas sobre as citocinas envolvidas no transplante pulmonar. As citocinas analisadas no painel desenhado para esse fim são IFN gama, IL-1 beta, IL-6, IL-8 (CXCL8), IL-18, IP-10 (CXCL10), MCP-1 (CCL2), MIP- 1 alfa (CCL3), TNF alfa, VEGF-D (Custom Procartaplex Multiplex Panel, Invitrogen, ThermoFisher Scientific, MA, EUA). A análise imunológica será realizada utilizando o software Invitrogen ProcartaPlex Analyst 1.0, fornecido com os reagentes.

- Análise bioinformática das sequências Para obtenção da composição microbiana de cada amostra utilizaremos o software QIIME. QIIME é um pipeline de software que utiliza informações filogenéticas e técnicas estatísticas multivariadas para comparar comunidades microbianas e determinar, por exemplo, se elas são estatisticamente diferentes. O programa também identifica as espécies que mais contribuem para essas diferenças e descobre padrões de diversos tipos que caracterizam grupos específicos de amostras.