Impact du système de perfusion pulmonaire ex vivo sur le microbiome des greffes pulmonaires et leur réaction inflammatoire. (ExBioma)

PRÉLÈVEMENT ET CONSERVATION DES ÉCHANTILLONS

• BAL :
• Technique : Le bronchoscope sera inséré dans le segment 6, des aliquotes de solution saline stérile seront instillées. La procédure sera répétée dans les segments 3 et 5, dans le cas du poumon droit, et dans le segment 6 et le lingula du poumon gauche. 20 à 30 cc de BAL seront complétés pour chaque greffe.
• Stockage : Les échantillons seront congelés immédiatement après le prélèvement et transférés au laboratoire avec un accumulateur de froid pour garantir qu'ils ne décongèlent pas.
• Analyse : Le microbiome pulmonaire sera analysé.
• Biopsie pulmonaire :
• Technique : Une biopsie pulmonaire d'un minimum de 2 cm3 sera réalisée à l'aide d'une suture automatique non résorbable.
• Stockage : les échantillons seront conservés dans une solution de stabilisation de l'ARN réactif (QIAGEN), qui permet de conserver les échantillons à température ambiante jusqu'à ce qu'ils soient congelés, évitant ainsi la dégradation de l'ARN.
• Analyse : Séquençage d'ARN de transcription de signaux inflammatoires.
• Solution liquide de perfusion ex vivo :
• Technique : Prélèvement d'échantillons stériles avec une seringue de 20cc.
• Stockage : Les échantillons seront congelés immédiatement après le prélèvement et transférés au laboratoire avec un accumulateur de froid pour garantir qu'ils ne décongèlent pas.
• Analyse : analyse du microbiome
• Solution liquide de conservation :
• Technique : Prélèvement d'échantillons stériles avec une seringue de 20cc.
• Stockage : Les échantillons seront congelés immédiatement après le prélèvement et transférés au laboratoire avec un accumulateur de froid pour garantir qu'ils ne décongèlent pas.
• Analyse : analyse du microbiome et des cytokines

Tous les échantillons seront conservés au congélateur à -80

- Analyse du microbiome Pour l'analyse de la diversité microbienne, la région variable V4 du gène 16S sera amplifiée à partir de l'ADN bactérien par PCR. Les amplicons seront séquencés à l'aide de la technologie Illumina (MiSeq). Les échantillons seront traités et plus de 10 000 séquences de 300 pb par séquence et par échantillon seront générées.

Analyse de l'expression génique L'extraction de l'ARN sera effectuée à l'aide du kit commercial RNeasy Mini (QIAGEN). L'analyse de l'expression génique sera effectuée par PCR quantitative (qPCR) à l'aide du panel TransplantRejection prédéfini de SignArray (AnyGenes®, Paris, France) qui comprend 84 gènes qui ont été décrits comme étant liés à la réponse immunitaire en cas de rejet de greffe. Il s'agit de : Gènes inclus dans le panel : CX3CR1, ICAM1, ITGA2, ITGAE, ITGAM, PECAM1, THBS1, THBS2, VCAM1, COL1A2, CCR5, CCR7, CD40, CD40LG, CD80, CD86, CTLA4, CXCR3, STAT4, TGFB1, CD44. , CTGF, MMP1, MMP2, MMP7, MMP9, BMP7, CCL11, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CSF2, CXCL10, IFNG, IL10, IL12A, IL13, IL16, IL1B, IL2, IL2RA, IL3, IL32, IL4, IL5 , IL6, IL8, TNF, TGFB2, TGFB3, TIMP1, VEGFA, MS4A1, CXCL11, CXCL9, CXCR4, ADAM17, C3, CASP1, CASP3, CASP8, CCR2, CCR3, CD14, CD28, CD8A, FAS, FASLG, FCGR1A, GZMA , GZMB, NFKB1, NOS2, PRF1, PSMB9, STAT1, STAT6, TAP1, TLR3, TLR4, TLR9, TNFAIP3, TNFSF10.

- Analyse des cytokines Le dosage des cytokines dans le liquide de perfusion sera réalisé à l'aide d'immunoessais basés sur la technologie Luminex™ xMAP™ (profilage multi-analyte) qui permettent la quantification et la détection simultanées de différentes protéines sécrétées (cytokines, chimiokines, facteurs de croissance, etc. .) Nous utiliserons des panels conçus spécifiquement pour les produits génétiques d’intérêt.

Les niveaux de cytokines sont mesurés à l'aide d'un test immunologique basé sur la technologie Luminex™ xMAP™ qui permet une analyse multiparamétrique des différentes cytokines. À cette fin, un panel de cytokines personnalisé est conçu sur la base de la littérature publiée sur l'effet des statines sur la production de cytokines et d'autres chimiokines pro-inflammatoires à un niveau systémique, ainsi que des preuves bibliographiques sur les cytokines impliquées dans la transplantation pulmonaire. Les cytokines analysées dans le panel prévu à cet effet sont l'IFN gamma, l'IL-1 bêta, l'IL-6, l'IL-8 (CXCL8), l'IL-18, l'IP-10 (CXCL10), le MCP-1 (CCL2), le MIP- 1 alpha (CCL3), TNF alpha, VEGF-D (Custom Procartaplex Multiplex Panel, Invitrogen, ThermoFisher Scientific, MA, USA). L'analyse immunologique sera réalisée à l'aide du logiciel Invitrogen ProcartaPlex Analyst 1.0, fourni avec les réactifs.

- Analyse bioinformatique des séquences Pour obtenir la composition microbienne de chaque échantillon, nous utiliserons le logiciel QIIME. QIIME est un pipeline logiciel qui utilise des informations phylogénétiques et des techniques statistiques multivariées pour comparer les communautés microbiennes et déterminer, par exemple, si elles sont statistiquement différentes. Le programme identifie également les espèces qui contribuent le plus à ces différences et découvre des modèles de différents types qui caractérisent des groupes spécifiques d'échantillons.