Innvirkningen av Ex-vivo lungeperfusjonssystemet på mikrobiomet til lungetransplantater og deres inflammatoriske reaksjon. (ExBioma)

PRØVETAKING OG OPPBEVARING

• BAL:
• Teknikk: Bronkoskopet settes inn i segment 6, alikvoter av sterilt saltvann vil bli instillert. Prosedyren gjentas i segment 3 og 5, når det gjelder høyre lunge, og i segment 6 og lingula i venstre lunge. 20-30cc BAL vil bli fullført for hver graft.
• Oppbevaring: Prøver fryses umiddelbart etter innsamling og overføres til laboratoriet med kuldeakkumulator for å sikre at de ikke tiner.
• Analyse: Lungemikrobiomet vil bli analysert.
• Lungebiopsi:
• Teknikk: Lungebiopsi på minimum 2cm3 vil bli tatt med ikke-absorberbar automatisk sutur.
• Oppbevaring: Prøver vil bli oppbevart i RNA Stabilization Solution Reagent (QIAGEN), som gjør at prøver kan oppbevares ved romtemperatur til de er frosne, og unngår RNA-nedbrytning.
• Analyse: RNA-sekvensering av transkripsjon av inflammatoriske signaler.
• Ex vivo perfusjonsvæskeløsning:
• Teknikk: Tar prøver sterile med en 20cc sprøyte.
• Oppbevaring: Prøver fryses umiddelbart etter innsamling og overføres til laboratoriet med kuldeakkumulator for å sikre at de ikke tiner.
• Analyse: Mikrobiomanalyse
• Konserveringsvæskeløsning:
• Teknikk: Tar prøver sterile med en 20cc sprøyte.
• Oppbevaring: Prøver fryses umiddelbart etter innsamling og overføres til laboratoriet med kuldeakkumulator for å sikre at de ikke tiner.
• Analyse: Mikrobiom og cytokinanalyse

Alle prøver vil bli lagret i fryser ved -80

- Mikrobiomanalyse For analyse av mikrobiell mangfold, vil V4 variable regionen av 16S genet bli amplifisert fra bakteriell DNA ved PCR. Amplikoner vil bli sekvensert ved hjelp av Illumina (MiSeq) teknologi. Prøver vil bli behandlet og mer enn 10 000 300bp-sekvenser per sekvens per prøve vil bli generert.

Genekspresjonsanalyse RNA-ekstraksjon vil bli utført ved å bruke det kommersielle RNeasy Mini Kit (QIAGEN). Genekspresjonsanalyse vil bli utført ved kvantitativ PCR (qPCR) ved bruk av det forhåndsdesignede TransplantRejection-panelet fra SignArray (AnyGenes®, Paris, Frankrike) som inkluderer 84 gener som har blitt beskrevet å være relatert til immunresponsen ved transplantasjonsavvisning. Disse er: Gener inkludert i panelet: CX3CR1, ICAM1, ITGA2, ITGAE, ITGAM, PECAM1, THBS1, THBS2, VCAM1, COL1A2, CCR5, CCR7, CD40, CD40LG, CD80, CD86, CTLA4, CD, T4GF14, CD, T4GF14, CXCR3, STAT , CTGF, MMP1, MMP2, MMP7, MMP9, BMP7, CCL11, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CSF2, CXCL10, IFNG, IL10, IL12A, IL13, IL16, IL1B, IL2, IL2RA, 5 IL3, IL, 5 , IL6, IL8, TNF, TGFB2, TGFB3, TIMP1, VEGFA, MS4A1, CXCL11, CXCL9, CXCR4, ADAM17, C3, CASP1, CASP3, CASP8, CCR2, CCR3, CD14, CD28, CD8A, FCMA1A, FASLG, FAS , GZMB, NFKB1, NOS2, PRF1, PSMB9, STAT1, STAT6, TAP1, TLR3, TLR4, TLR9, TNFAIP3, TNFSF10.

- Cytokinanalyse Bestemmelsen av cytokiner i perfusjonsvæsken vil bli utført ved hjelp av immunoassays basert på Luminex™ xMAP™-teknologi (multi-analytprofilering) som muliggjør samtidig kvantifisering og påvisning av ulike utskilte proteiner (cytokiner, kjemokiner, vekstfaktorer, etc.) .) Vi vil bruke paneler designet spesielt for genproduktene av interesse.

Cytokinnivåer måles ved hjelp av en immunanalyse basert på Luminex™ xMAP™-teknologi som muliggjør multiparametrisk analyse av de forskjellige cytokinene. For dette formål er det utformet et personlig cytokinpanel basert på publisert litteratur om effekten av statiner på produksjonen av cytokiner og andre proinflammatoriske kjemokiner på systemisk nivå, samt bibliografiske bevis på cytokinene involvert i lungetransplantasjon. Cytokinene som er analysert i panelet designet for dette formålet er IFN gamma, IL-1 beta, IL-6, IL-8 (CXCL8), IL-18, IP-10 (CXCL10), MCP-1 (CCL2), MIP- 1 alfa (CCL3), TNF alfa, VEGF-D (Custom Procartaplex Multiplex Panel, Invitrogen, ThermoFisher Scientific, MA, USA). Den immunologiske analysen vil bli utført ved å bruke Invitrogen ProcartaPlex Analyst 1.0-programvaren, som følger med reagensene.

- Bioinformatisk analyse av sekvensene For å få den mikrobielle sammensetningen til hver prøve, vil vi bruke QIIME-programvaren. QIIME er en programvarepipeline som bruker fylogenetisk informasjon og multivariate statistiske teknikker for å sammenligne mikrobielle samfunn og for eksempel bestemme om de er statistisk forskjellige. Programmet identifiserer også artene som bidrar mest til disse forskjellene og oppdager mønstre av ulike typer som karakteriserer bestemte grupper av prøver.