Einfluss des Ex-vivo-Lungenperfusionssystems auf das Mikrobiom von Lungentransplantaten und ihre Entzündungsreaktion. (ExBioma)

PROBENENTNAHME UND LAGERUNG

• BAL:
• Technik: Das Bronchoskop wird in Segment 6 eingeführt, Aliquots steriler Kochsalzlösung werden instilliert. Der Vorgang wird im Fall der rechten Lunge in den Segmenten 3 und 5 und im Fall der linken Lunge in Segment 6 und Lingula wiederholt. Für jedes Transplantat werden 20-30 ml BAL vervollständigt.
• Lagerung: Die Proben werden unmittelbar nach der Entnahme eingefroren und mit einem Kältespeicher ins Labor gebracht, um sicherzustellen, dass sie nicht auftauen.
• Analyse: Das Lungenmikrobiom wird analysiert.
• Lungenbiopsie:
• Technik: Eine Lungenbiopsie von mindestens 2 cm3 wird mit einer nicht resorbierbaren automatischen Naht entnommen.
• Lagerung: Die Proben werden im RNA-Stabilisierungslösungsreagenz (QIAGEN) aufbewahrt, wodurch die Proben bis zum Einfrieren bei Raumtemperatur aufbewahrt werden können, wodurch ein RNA-Abbau vermieden wird.
• Analyse: RNA-Sequenzierung der Transkription von Entzündungssignalen.
• Ex-vivo-Perfusionsflüssigkeitslösung:
• Technik: Sterile Probenentnahme mit einer 20-ml-Spritze.
• Lagerung: Die Proben werden unmittelbar nach der Entnahme eingefroren und mit einem Kältespeicher ins Labor gebracht, um sicherzustellen, dass sie nicht auftauen.
• Analyse: Mikrobiomanalyse
• Flüssige Konservierungslösung:
• Technik: Sterile Probenentnahme mit einer 20-ml-Spritze.
• Lagerung: Die Proben werden unmittelbar nach der Entnahme eingefroren und mit einem Kältespeicher ins Labor gebracht, um sicherzustellen, dass sie nicht auftauen.
• Analyse: Mikrobiom- und Zytokinanalyse

Alle Proben werden in einem Gefrierschrank bei -80 °C gelagert

- Mikrobiomanalyse Zur Analyse der mikrobiellen Diversität wird die variable V4-Region des 16S-Gens aus bakterieller DNA mittels PCR amplifiziert. Amplikons werden mithilfe der Illumina-Technologie (MiSeq) sequenziert. Die Proben werden verarbeitet und mehr als 10.000 300-bp-Sequenzen pro Sequenz und Probe generiert.

Die Genexpressionsanalyse der RNA-Extraktion wird mit dem kommerziellen RNeasy Mini Kit (QIAGEN) durchgeführt. Die Genexpressionsanalyse wird durch quantitative PCR (qPCR) unter Verwendung des vorgefertigten TransplantRejection-Panels von SignArray (AnyGenes®, Paris, Frankreich) durchgeführt, das 84 Gene umfasst, von denen beschrieben wurde, dass sie mit der Immunantwort bei der Transplantatabstoßung zusammenhängen. Dies sind: Im Panel enthaltene Gene: CX3CR1, ICAM1, ITGA2, ITGAE, ITGAM, PECAM1, THBS1, THBS2, VCAM1, COL1A2, CCR5, CCR7, CD40, CD40LG, CD80, CD86, CTLA4, CXCR3, STAT4, TGFB1, CD44 , CTGF, MMP1, MMP2, MMP7, MMP9, BMP7, CCL11, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CSF2, CXCL10, IFNG, IL10, IL12A, IL13, IL16, IL1B, IL2, IL2RA, IL3, IL32, IL4, IL5 , IL6, IL8, TNF, TGFB2, TGFB3, TIMP1, VEGFA, MS4A1, CXCL11, CXCL9, CXCR4, ADAM17, C3, CASP1, CASP3, CASP8, CCR2, CCR3, CD14, CD28, CD8A, FAS, FASLG, FCGR1A, GZMA , GZMB, NFKB1, NOS2, PRF1, PSMB9, STAT1, STAT6, TAP1, TLR3, TLR4, TLR9, TNFAIP3, TNFSF10.

- Zytokinanalyse Die Bestimmung von Zytokinen in der Perfusionsflüssigkeit erfolgt mithilfe von Immunoassays auf Basis der Luminex™ xMAP™-Technologie (Multi-Analyt-Profiling), die die gleichzeitige Quantifizierung und Detektion verschiedener sekretierter Proteine ​​(Zytokine, Chemokine, Wachstumsfaktoren usw.) ermöglichen .) Wir werden Panels verwenden, die speziell für die interessierenden Genprodukte entwickelt wurden.

Die Zytokinspiegel werden mithilfe eines Immunoassays gemessen, der auf der Luminex™ xMAP™-Technologie basiert und eine multiparametrische Analyse der verschiedenen Zytokine ermöglicht. Zu diesem Zweck wird ein personalisiertes Zytokin-Panel entwickelt, das auf der veröffentlichten Literatur über die Wirkung von Statinen auf die Produktion von Zytokinen und anderen proinflammatorischen Chemokinen auf systemischer Ebene sowie auf bibliografischen Belegen zu den an Lungentransplantationen beteiligten Zytokinen basiert. Die in dem für diesen Zweck konzipierten Panel analysierten Zytokine sind IFN-Gamma, IL-1 Beta, IL-6, IL-8 (CXCL8), IL-18, IP-10 (CXCL10), MCP-1 (CCL2), MIP- 1 alpha (CCL3), TNF alpha, VEGF-D (Custom Procartaplex Multiplex Panel, Invitrogen, ThermoFisher Scientific, MA, USA). Die immunologische Analyse wird mit der Invitrogen ProcartaPlex Analyst 1.0-Software durchgeführt, die mit den Reagenzien geliefert wird.

- Bioinformatische Analyse der Sequenzen Um die mikrobielle Zusammensetzung jeder Probe zu erhalten, verwenden wir die QIIME-Software. QIIME ist eine Software-Pipeline, die phylogenetische Informationen und multivariate statistische Techniken nutzt, um mikrobielle Gemeinschaften zu vergleichen und beispielsweise festzustellen, ob sie statistisch unterschiedlich sind. Das Programm identifiziert auch die Arten, die am meisten zu diesen Unterschieden beitragen, und entdeckt Muster verschiedener Typen, die bestimmte Gruppen von Proben charakterisieren.