Impact van het ex-vivo pulmonale perfusiesysteem op het microbioom van longtransplantaten en hun ontstekingsreactie. (ExBioma)

MONSTERNEMEN EN OPSLAG

• BAL:
• Techniek: De bronchoscoop wordt in segment 6 ingebracht, er worden aliquots steriele zoutoplossing ingebracht. De procedure wordt herhaald in segmenten 3 en 5, in het geval van de rechterlong, en in segment 6 en lingula in de linkerlong. Voor elk transplantaat wordt 20-30 cc BAL voltooid.
• Opslag: Monsters worden onmiddellijk na afname ingevroren en met een koudeaccumulator naar het laboratorium overgebracht om ervoor te zorgen dat ze niet ontdooien.
• Analyse: Het longmicrobioom zal worden geanalyseerd.
• Longbiopsie:
• Techniek: Er wordt een longbiopsie van minimaal 2 cm3 genomen met behulp van niet-resorbeerbare automatische hechtingen.
• Opslag: Monsters worden bewaard in RNA Stabilization Solution Reagent (QIAGEN), waardoor monsters bij kamertemperatuur kunnen worden bewaard totdat ze bevroren zijn, waardoor afbraak van RNA wordt vermeden.
• Analyse: RNA-sequencing van transcriptie van ontstekingssignalen.
• Ex vivo perfusievloeistofoplossing:
• Techniek: Steriel nemen van monsters met een spuit van 20 cc.
• Opslag: Monsters worden onmiddellijk na afname ingevroren en met een koudeaccumulator naar het laboratorium overgebracht om ervoor te zorgen dat ze niet ontdooien.
• Analyse: Microbioomanalyse
• Conserveringsvloeistof oplossing:
• Techniek: Steriel nemen van monsters met een spuit van 20 cc.
• Opslag: Monsters worden onmiddellijk na afname ingevroren en met een koudeaccumulator naar het laboratorium overgebracht om ervoor te zorgen dat ze niet ontdooien.
• Analyse: Microbioom- en cytokineanalyse

Alle monsters worden in een vriezer bij -80°C bewaard

- Microbioomanalyse Voor de analyse van de microbiële diversiteit zal het V4-variabele gebied van het 16S-gen door middel van PCR uit bacterieel DNA worden geamplificeerd. Amplicons zullen worden gesequenced met behulp van Illumina (MiSeq) -technologie. Monsters worden verwerkt en er worden meer dan 10.000 sequenties van 300 bp per sequentie per monster gegenereerd.

Analyse van genexpressie RNA-extractie zal worden uitgevoerd met behulp van de commerciële RNeasy Mini Kit (QIAGEN). Genexpressieanalyse zal worden uitgevoerd door kwantitatieve PCR (qPCR) met behulp van het vooraf ontworpen TransplantRejection-panel van SignArray (AnyGenes®, Parijs, Frankrijk) dat 84 genen omvat waarvan is beschreven dat ze verband houden met de immuunrespons bij transplantaatafstoting. Dit zijn: Genen opgenomen in het panel: CX3CR1, ICAM1, ITGA2, ITGAE, ITGAM, PECAM1, THBS1, THBS2, VCAM1, COL1A2, CCR5, CCR7, CD40, CD40LG, CD80, CD86, CTLA4, CXCR3, STAT4, TGFB1, CD44 , CTGF, MMP1, MMP2, MMP7, MMP9, BMP7, CCL11, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CSF2, CXCL10, IFNG, IL10, IL12A, IL13, IL16, IL1B, IL2, IL2RA, IL3, IL32, IL4, IL5 , IL6, IL8, TNF, TGFB2, TGFB3, TIMP1, VEGFA, MS4A1, CXCL11, CXCL9, CXCR4, ADAM17, C3, CASP1, CASP3, CASP8, CCR2, CCR3, CD14, CD28, CD8A, FAS, FASLG, FCGR1A, GZMA , GZMB, NFKB1, NOS2, PRF1, PSMB9, STAT1, STAT6, TAP1, TLR3, TLR4, TLR9, TNFAIP3, TNFSF10.

- Cytokine-analyse De bepaling van cytokines in de perfusievloeistof zal worden uitgevoerd met behulp van immunoassays gebaseerd op Luminex™ xMAP™-technologie (multi-analyte profiling) die de gelijktijdige kwantificering en detectie van verschillende uitgescheiden eiwitten (cytokines, chemokines, groeifactoren, enz.) mogelijk maakt. .) We zullen panels gebruiken die specifiek zijn ontworpen voor de genproducten waarin we geïnteresseerd zijn.

Cytokineniveaus worden gemeten met behulp van een immunoassay gebaseerd op Luminex™ xMAP™-technologie die multiparametrische analyse van de verschillende cytokines mogelijk maakt. Daartoe wordt een gepersonaliseerd cytokinepanel ontworpen op basis van de gepubliceerde literatuur over het effect van statines op de productie van cytokines en andere pro-inflammatoire chemokinen op systemisch niveau, evenals bibliografisch bewijsmateriaal over de cytokines die betrokken zijn bij longtransplantatie. De cytokinen die in het voor dit doel ontworpen panel zijn geanalyseerd, zijn IFN-gamma, IL-1 bèta, IL-6, IL-8 (CXCL8), IL-18, IP-10 (CXCL10), MCP-1 (CCL2), MIP- 1 alfa (CCL3), TNF alfa, VEGF-D (aangepast Procartaplex multiplexpaneel, Invitrogen, ThermoFisher Scientific, MA, VS). De immunologische analyse zal worden uitgevoerd met behulp van de Invitrogen ProcartaPlex Analyst 1.0-software, die bij de reagentia wordt geleverd.

- Bioinformatische analyse van de sequenties Om de microbiële samenstelling van elk monster te bepalen, zullen we de QIIME-software gebruiken. QIIME is een softwarepijplijn die fylogenetische informatie en multivariate statistische technieken gebruikt om microbiële gemeenschappen te vergelijken en bijvoorbeeld te bepalen of ze statistisch verschillend zijn. Het programma identificeert ook de soorten die het meest bijdragen aan deze verschillen en ontdekt patronen van verschillende typen die specifieke groepen monsters kenmerken.