Indvirkningen af ​​det ex-vivo pulmonale perfusionssystem på mikrobiomet af lungetransplantater og deres inflammatoriske reaktion. (ExBioma)

PRØVETAGNING OG OPBEVARING

• BAL:
• Teknik: Bronkoskopet vil blive indsat i segment 6, alikvoter af sterilt saltvand inddryppes. Proceduren vil blive gentaget i segment 3 og 5, i tilfælde af højre lunge, og i segment 6 og lingula i venstre lunge. 20-30cc BAL vil blive færdiggjort for hver graft.
• Opbevaring: Prøver vil blive frosset umiddelbart efter indsamling og overført til laboratoriet med en kold akkumulator for at sikre, at de ikke tøer op.
• Analyse: Lungemikrobiomet vil blive analyseret.
• Lungebiopsi:
• Teknik: Lungebiopsi på minimum 2 cm3 vil blive taget med ikke-absorberbar automatisk sutur.
• Opbevaring: Prøver vil blive bevaret i RNA Stabilization Solution Reagent (QIAGEN), som gør det muligt at opbevare prøver ved stuetemperatur, indtil de er frosne, hvilket undgår RNA-nedbrydning.
• Analyse: RNA-sekventering af transkription af inflammatoriske signaler.
• Ex vivo perfusion flydende opløsning:
• Teknik: Udtagning af prøver sterilt med en 20cc sprøjte.
• Opbevaring: Prøver vil blive frosset umiddelbart efter indsamling og overført til laboratoriet med en kold akkumulator for at sikre, at de ikke tøer op.
• Analyse: Mikrobiom analyse
• Konserverende flydende opløsning:
• Teknik: Udtagning af prøver sterilt med en 20cc sprøjte.
• Opbevaring: Prøver vil blive frosset umiddelbart efter indsamling og overført til laboratoriet med en kold akkumulator for at sikre, at de ikke tøer op.
• Analyse: Mikrobiom og cytokinanalyse

Alle prøver vil blive opbevaret i en fryser ved -80

- Mikrobiomanalyse Til analyse af mikrobiel diversitet vil den variable V4-region af 16S-genet blive amplificeret fra bakterielt DNA ved PCR. Amplikoner vil blive sekventeret ved hjælp af Illumina (MiSeq) teknologi. Prøver vil blive behandlet, og mere end 10.000 300bp-sekvenser pr. sekvens pr. prøve vil blive genereret.

Genekspressionsanalyse RNA-ekstraktion vil blive udført ved hjælp af det kommercielle RNeasy Mini Kit (QIAGEN). Genekspressionsanalyse vil blive udført ved kvantitativ PCR (qPCR) ved hjælp af det foruddesignede TransplantRejection-panel fra SignArray (AnyGenes®, Paris, Frankrig), der inkluderer 84 gener, der er blevet beskrevet at være relateret til immunresponset ved transplantatafstødning. Disse er: Gener inkluderet i panelet: CX3CR1, ICAM1, ITGA2, ITGAE, ITGAM, PECAM1, THBS1, THBS2, VCAM1, COL1A2, CCR5, CCR7, CD40, CD40LG, CD80, CD86, CTLA4, CD, T4GF14, CXCR3, STAT , CTGF, MMP1, MMP2, MMP7, MMP9, BMP7, CCL11, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CSF2, CXCL10, IFNG, IL10, IL12A, IL13, IL16, IL1B, IL2, IL2RA, 5 IL, 4 IL, 5 , IL6, IL8, TNF, TGFB2, TGFB3, TIMP1, VEGFA, MS4A1, CXCL11, CXCL9, CXCR4, ADAM17, C3, CASP1, CASP3, CASP8, CCR2, CCR3, CD14, CD28, CD8A, FCMALG, FAS1A, FAS , GZMB, NFKB1, NOS2, PRF1, PSMB9, STAT1, STAT6, TAP1, TLR3, TLR4, TLR9, TNFAIP3, TNFSF10.

- Cytokinanalyse Bestemmelsen af ​​cytokiner i perfusionsvæsken vil blive udført ved hjælp af immunoassays baseret på Luminex™ xMAP™-teknologi (multi-analytprofilering), der muliggør samtidig kvantificering og påvisning af forskellige udskilte proteiner (cytokiner, kemokiner, vækstfaktorer osv.) .) Vi vil bruge paneler designet specifikt til genprodukterne af interesse.

Cytokinniveauer måles ved hjælp af en immunoassay baseret på Luminex™ xMAP™-teknologi, der muliggør multiparametrisk analyse af de forskellige cytokiner. Til dette formål er der designet et personligt cytokinpanel baseret på den publicerede litteratur om virkningen af ​​statiner på produktionen af ​​cytokiner og andre proinflammatoriske kemokiner på systemisk niveau, samt bibliografisk dokumentation for de cytokiner, der er involveret i lungetransplantation. Cytokinerne analyseret i panelet designet til dette formål er IFN gamma, IL-1 beta, IL-6, IL-8 (CXCL8), IL-18, IP-10 (CXCL10), MCP-1 (CCL2), MIP- 1 alfa (CCL3), TNF alfa, VEGF-D (Custom Procartaplex Multiplex Panel, Invitrogen, ThermoFisher Scientific, MA, USA). Den immunologiske analyse vil blive udført ved hjælp af Invitrogen ProcartaPlex Analyst 1.0-softwaren, der leveres med reagenserne.

- Bioinformatisk analyse af sekvenserne For at opnå den mikrobielle sammensætning af hver prøve, vil vi bruge QIIME-softwaren. QIIME er en softwarepipeline, der bruger fylogenetisk information og multivariate statistiske teknikker til at sammenligne mikrobielle samfund og for eksempel bestemme, om de er statistisk forskellige. Programmet identificerer også de arter, der bidrager mest til disse forskelle, og opdager mønstre af forskellige typer, der karakteriserer specifikke grupper af prøver.