Inverkan av Ex-vivo lungperfusionssystemet på mikrobiomet hos lungtransplantat och deras inflammatoriska reaktion. (ExBioma)

PROVTAGNING OCH FÖRVARING

• BAL:
• Teknik: Bronkoskopet kommer att sättas in i segment 6, alikvoter av steril koksaltlösning kommer att instilleras. Proceduren kommer att upprepas i segment 3 och 5, när det gäller höger lunga, och i segment 6 och lingula i vänster lunga. 20-30cc BAL kommer att fyllas i för varje transplantat.
• Förvaring: Proverna kommer att frysas omedelbart efter insamling och överföras till laboratoriet med en kylackumulator för att säkerställa att de inte tinar.
• Analys: Lungmikrobiomet kommer att analyseras.
• Lungbiopsi:
• Teknik: Lungbiopsi på minst 2 cm3 kommer att tas med icke-absorberbar automatisk sutur.
• Förvaring: Proverna kommer att bevaras i RNA Stabilization Solution Reagent (QIAGEN), vilket gör att prover kan förvaras i rumstemperatur tills de fryses, vilket undviker RNA-nedbrytning.
• Analys: RNA-sekvensering av transkription av inflammatoriska signaler.
• Ex vivo perfusion flytande lösning:
• Teknik: Ta prover sterila med en 20cc spruta.
• Förvaring: Proverna kommer att frysas omedelbart efter insamling och överföras till laboratoriet med en kylackumulator för att säkerställa att de inte tinar.
• Analys: Mikrobiomanalys
• Konserverande flytande lösning:
• Teknik: Ta prover sterila med en 20cc spruta.
• Förvaring: Proverna kommer att frysas omedelbart efter insamling och överföras till laboratoriet med en kylackumulator för att säkerställa att de inte tinar.
• Analys: Mikrobiom och cytokinanalys

Alla prover kommer att förvaras i frys vid -80

- Mikrobiomanalys För analys av mikrobiell mångfald kommer den variabla V4-regionen av 16S-genen att amplifieras från bakteriellt DNA genom PCR. Amplikoner kommer att sekvenseras med Illumina (MiSeq) teknologi. Prover kommer att bearbetas och mer än 10 000 300bp-sekvenser per sekvens per prov kommer att genereras.

Genuttrycksanalys RNA-extraktion kommer att utföras med det kommersiella RNeasy Mini Kit (QIAGEN). Genuttrycksanalys kommer att utföras med kvantitativ PCR (qPCR) med hjälp av den fördesignade TransplantRejection-panelen från SignArray (AnyGenes®, Paris, Frankrike) som inkluderar 84 gener som har beskrivits vara relaterade till immunsvaret vid transplantatavstötning. Dessa är: Gener som ingår i panelen: CX3CR1, ICAM1, ITGA2, ITGAE, ITGAM, PECAM1, THBS1, THBS2, VCAM1, COL1A2, CCR5, CCR7, CD40, CD40LG, CD80, CD86, CTLA4, CD, T4GF14, CXCR3, STAT , CTGF, MMP1, MMP2, MMP7, MMP9, BMP7, CCL11, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CSF2, CXCL10, IFNG, IL10, IL12A, IL13, IL16, IL1B, IL2, IL2RA, 5 IL, 4 IL, 5 , IL6, IL8, TNF, TGFB2, TGFB3, TIMP1, VEGFA, MS4A1, CXCL11, CXCL9, CXCR4, ADAM17, C3, CASP1, CASP3, CASP8, CCR2, CCR3, CD14, CD28, CD8A, FCMA, FAS1A, FAS , GZMB, NFKB1, NOS2, PRF1, PSMB9, STAT1, STAT6, TAP1, TLR3, TLR4, TLR9, TNFAIP3, TNFSF10.

- Cytokinanalys Bestämningen av cytokiner i perfusionsvätskan kommer att utföras med hjälp av immunanalyser baserade på Luminex™ xMAP™-teknologi (multi-analytprofilering) som möjliggör samtidig kvantifiering och detektering av olika utsöndrade proteiner (cytokiner, kemokiner, tillväxtfaktorer, etc.) .) Vi kommer att använda paneler utformade specifikt för genprodukterna av intresse.

Cytokinnivåer mäts med en immunanalys baserad på Luminex™ xMAP™-teknologi som möjliggör multiparametrisk analys av de olika cytokinerna. För detta ändamål utformas en personlig cytokinpanel baserad på den publicerade litteraturen om effekten av statiner på produktionen av cytokiner och andra proinflammatoriska kemokiner på systemisk nivå, samt bibliografiska bevis på de cytokiner som är involverade i lungtransplantation. Cytokinerna som analyseras i panelen utformad för detta ändamål är IFN gamma, IL-1 beta, IL-6, IL-8 (CXCL8), IL-18, IP-10 (CXCL10), MCP-1 (CCL2), MIP- 1 alfa (CCL3), TNF alfa, VEGF-D (Custom Procartaplex Multiplex Panel, Invitrogen, ThermoFisher Scientific, MA, USA). Den immunologiska analysen kommer att utföras med hjälp av programvaran Invitrogen ProcartaPlex Analyst 1.0, som levereras med reagenserna.

- Bioinformatisk analys av sekvenserna För att få fram den mikrobiella sammansättningen av varje prov kommer vi att använda programvaran QIIME. QIIME är en mjukvarupipeline som använder fylogenetisk information och multivariat statistisk teknik för att jämföra mikrobiella samhällen och avgöra till exempel om de är statistiskt olika. Programmet identifierar också de arter som bidrar mest till dessa skillnader och upptäcker mönster av olika typer som kännetecknar specifika grupper av prover.