Impacto del sistema de perfusión pulmonar ex vivo sobre el microbioma de los injertos pulmonares y su reacción inflamatoria. (ExBioma)

TOMA Y ALMACENAMIENTO DE MUESTRAS

• Balón:
• Técnica: Se insertará el broncoscopio en el segmento 6 y se instilarán alícuotas de solución salina estéril. El procedimiento se repetirá en los segmentos 3 y 5, en el caso del pulmón derecho, y en el segmento 6 y língula en el pulmón izquierdo. Se completarán 20-30 cc de BAL por cada injerto.
• Almacenamiento: Las muestras se congelarán inmediatamente después de su recolección y se trasladarán al laboratorio con un acumulador de frío para garantizar que no se descongelen.
• Análisis: Se analizará el microbioma pulmonar.
• Biopsia de pulmón:
• Técnica: Se tomará una biopsia de pulmón de un mínimo de 2 cm3 mediante sutura automática no absorbible.
• Almacenamiento: Las muestras se conservarán en un reactivo de solución de estabilización de ARN (QIAGEN), que permite mantener las muestras a temperatura ambiente hasta que se congelen, evitando la degradación del ARN.
• Análisis: Secuenciación de ARN de transcripción de señales inflamatorias.
• Solución líquida de perfusión ex vivo:
• Técnica: Toma de muestras esterilizadas con jeringa de 20 cc.
• Almacenamiento: Las muestras se congelarán inmediatamente después de su recolección y se trasladarán al laboratorio con un acumulador de frío para garantizar que no se descongelen.
• Análisis: análisis del microbioma.
• Solución líquida de conservación:
• Técnica: Toma de muestras esterilizadas con jeringa de 20 cc.
• Almacenamiento: Las muestras se congelarán inmediatamente después de su recolección y se trasladarán al laboratorio con un acumulador de frío para garantizar que no se descongelen.
• Análisis: análisis de microbioma y citocinas.

Todas las muestras se almacenarán en un congelador a -80

- Análisis del microbioma Para el análisis de la diversidad microbiana, la región variable V4 del gen 16S se amplificará a partir de ADN bacteriano mediante PCR. Los amplicones se secuenciarán utilizando tecnología Illumina (MiSeq). Se procesarán muestras y se generarán más de 10.000 secuencias de 300 pb por secuencia por muestra.

La extracción de ARN del análisis de expresión génica se realizará utilizando el Mini kit comercial RNeasy (QIAGEN). El análisis de la expresión génica se realizará mediante PCR cuantitativa (qPCR) utilizando el panel TransplantRejection prediseñado de SignArray (AnyGenes®, París, Francia) que incluye 84 genes que se ha descrito que están relacionados con la respuesta inmune en el rechazo de trasplantes. Estos son: Genes incluidos en el panel: CX3CR1, ICAM1, ITGA2, ITGAE, ITGAM, PECAM1, THBS1, THBS2, VCAM1, COL1A2, CCR5, CCR7, CD40, CD40LG, CD80, CD86, CTLA4, CXCR3, STAT4, TGFB1, CD44. , CTGF, MMP1, MMP2, MMP7, MMP9, BMP7, CCL11, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CSF2, CXCL10, IFNG, IL10, IL12A, IL13, IL16, IL1B, IL2, IL2RA, IL3, IL32, IL4, IL5. , IL6, IL8, TNF, TGFB2, TGFB3, TIMP1, VEGFA, MS4A1, CXCL11, CXCL9, CXCR4, ADAM17, C3, CASP1, CASP3, CASP8, CCR2, CCR3, CD14, CD28, CD8A, FAS, FASLG, FCGR1A, GZMA , GZMB, NFKB1, NOS2, PRF1, PSMB9, STAT1, STAT6, TAP1, TLR3, TLR4, TLR9, TNFAIP3, TNFSF10.

- Análisis de citocinas La determinación de citocinas en el líquido de perfusión se realizará mediante inmunoensayos basados ​​en la tecnología Luminex™ xMAP™ (multi-analyte profiling) que permiten la cuantificación y detección simultánea de diferentes proteínas secretadas (citocinas, quimiocinas, factores de crecimiento, etc.) .) Utilizaremos paneles diseñados específicamente para los productos genéticos de interés.

Los niveles de citocinas se miden mediante un inmunoensayo basado en la tecnología Luminex™ xMAP™ que permite el análisis multiparamétrico de las diferentes citocinas. Para ello se diseña un panel personalizado de citocinas basado en la literatura publicada sobre el efecto de las estatinas en la producción de citocinas y otras quimiocinas proinflamatorias a nivel sistémico, así como en la evidencia bibliográfica sobre las citocinas implicadas en el trasplante de pulmón. Las citocinas analizadas en el panel diseñado al efecto son IFN gamma, IL-1 beta, IL-6, IL-8 (CXCL8), IL-18, IP-10 (CXCL10), MCP-1 (CCL2), MIP- 1 alfa (CCL3), TNF alfa, VEGF-D (Panel Multiplex Procartaplex personalizado, Invitrogen, ThermoFisher Scientific, MA, EE. UU.). El análisis inmunológico se realizará mediante el software Invitrogen ProcartaPlex Analyst 1.0, suministrado con los reactivos.

- Análisis bioinformático de las secuencias Para obtener la composición microbiana de cada muestra utilizaremos el software QIIME. QIIME es una línea de software que utiliza información filogenética y técnicas estadísticas multivariadas para comparar comunidades microbianas y determinar, por ejemplo, si son estadísticamente diferentes. El programa también identifica las especies que más contribuyen a estas diferencias y descubre patrones de varios tipos que caracterizan a grupos específicos de muestras.