Impatto del sistema di perfusione polmonare ex vivo sul microbioma degli innesti polmonari e sulla loro reazione infiammatoria. (ExBioma)

PRELIEVO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI

• BAL:
• Tecnica: Il broncoscopio verrà inserito nel segmento 6, verranno instillate aliquote di soluzione salina sterile. La procedura verrà ripetuta nei segmenti 3 e 5, nel caso del polmone destro, e nel segmento 6 e lingula nel polmone sinistro. Per ogni innesto verranno completati 20-30 cc di BAL.
• Conservazione: i campioni verranno congelati immediatamente dopo la raccolta e trasferiti al laboratorio con un accumulatore di freddo per garantire che non si scongelino.
• Analisi: verrà analizzato il microbioma polmonare.
• Biopsia polmonare:
• Tecnica: verrà eseguita una biopsia polmonare di almeno 2 cm3 utilizzando una sutura automatica non assorbibile.
• Conservazione: i campioni verranno conservati nel reagente della soluzione di stabilizzazione dell'RNA (QIAGEN), che consente di mantenere i campioni a temperatura ambiente fino al congelamento, evitando la degradazione dell'RNA.
• Analisi: sequenziamento dell'RNA della trascrizione dei segnali infiammatori.
• Soluzione liquida per perfusione ex vivo:
• Tecnica: Prelievo di campioni sterili con una siringa da 20 cc.
• Conservazione: i campioni verranno congelati immediatamente dopo la raccolta e trasferiti al laboratorio con un accumulatore di freddo per garantire che non si scongelino.
• Analisi: analisi del microbioma
• Soluzione liquida di conservazione:
• Tecnica: Prelievo di campioni sterili con una siringa da 20 cc.
• Conservazione: i campioni verranno congelati immediatamente dopo la raccolta e trasferiti al laboratorio con un accumulatore di freddo per garantire che non si scongelino.
• Analisi: analisi del microbioma e delle citochine

Tutti i campioni verranno conservati in un congelatore a -80

- Analisi del microbioma Per l'analisi della diversità microbica, la regione variabile V4 del gene 16S sarà amplificata dal DNA batterico mediante PCR. Gli ampliconi verranno sequenziati utilizzando la tecnologia Illumina (MiSeq). I campioni verranno elaborati e verranno generate più di 10.000 sequenze da 300 bp per sequenza per campione.

Analisi dell'espressione genica L'estrazione dell'RNA verrà eseguita utilizzando il kit commerciale RNeasy Mini (QIAGEN). L'analisi dell'espressione genica verrà eseguita mediante PCR quantitativa (qPCR) utilizzando il pannello TransplantRejection preimpostato di SignArray (AnyGenes®, Parigi, Francia) che include 84 geni che sono stati descritti come correlati alla risposta immunitaria nel rigetto del trapianto. Questi sono: Geni inclusi nel pannello: CX3CR1, ICAM1, ITGA2, ITGAE, ITGAM, PECAM1, THBS1, THBS2, VCAM1, COL1A2, CCR5, CCR7, CD40, CD40LG, CD80, CD86, CTLA4, CXCR3, STAT4, TGFB1, CD44 , CTGF, MMP1, MMP2, MMP7, MMP9, BMP7, CCL11, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CSF2, CXCL10, IFNG, IL10, IL12A, IL13, IL16, IL1B, IL2, IL2RA, IL3, IL32, IL4, IL5 , IL6, IL8, TNF, TGFB2, TGFB3, TIMP1, VEGFA, MS4A1, CXCL11, CXCL9, CXCR4, ADAM17, C3, CASP1, CASP3, CASP8, CCR2, CCR3, CD14, CD28, CD8A, FAS, FASLG, FCGR1A, GZMA , GZMB, NFKB1, NOS2, PRF1, PSMB9, STAT1, STAT6, TAP1, TLR3, TLR4, TLR9, TNFAIP3, TNFSF10.

- Analisi delle citochine La determinazione delle citochine nel liquido di perfusione verrà effettuata utilizzando test immunologici basati sulla tecnologia Luminex™ xMAP™ (profilazione multi-analita) che consentono la quantificazione e la rilevazione simultanea di diverse proteine ​​secrete (citochine, chemochine, fattori di crescita, ecc.) .) Utilizzeremo pannelli progettati specificamente per i prodotti genetici di interesse.

I livelli di citochine vengono misurati utilizzando un test immunologico basato sulla tecnologia Luminex™ xMAP™ che consente l'analisi multiparametrica delle diverse citochine. A tal fine, viene disegnato un pannello personalizzato di citochine basato sulla letteratura pubblicata sull’effetto delle statine sulla produzione di citochine e altre chemochine proinfiammatorie a livello sistemico, nonché sull’evidenza bibliografica sulle citochine coinvolte nel trapianto polmonare. Le citochine analizzate nel pannello predisposto a questo scopo sono IFN gamma, IL-1 beta, IL-6, IL-8 (CXCL8), IL-18, IP-10 (CXCL10), MCP-1 (CCL2), MIP- 1 alfa (CCL3), TNF alfa, VEGF-D (pannello multiplex Procartaplex personalizzato, Invitrogen, ThermoFisher Scientific, MA, USA). L'analisi immunologica sarà effettuata utilizzando il software Invitrogen ProcartaPlex Analyst 1.0, fornito con i reagenti.

- Analisi bioinformatica delle sequenze Per ottenere la composizione microbica di ciascun campione, utilizzeremo il software QIIME. QIIME è una pipeline software che utilizza informazioni filogenetiche e tecniche statistiche multivariate per confrontare le comunità microbiche e determinare, ad esempio, se sono statisticamente diverse. Il programma identifica inoltre le specie che contribuiscono maggiormente a queste differenze e scopre modelli di vario tipo che caratterizzano specifici gruppi di campioni.