폐 이식편의 미생물군집과 염증 반응에 대한 생체외 폐관류 시스템의 영향. (ExBioma)

샘플 채취 및 보관

• 발:
• 기술: 기관지경을 세그먼트 6에 삽입하고 멸균 식염수를 주입합니다. 절차는 오른쪽 폐의 경우 세그먼트 3과 5에서, 왼쪽 폐의 경우 세그먼트 6과 설측에서 반복됩니다. 각 이식편마다 20-30cc의 BAL이 완성됩니다.
• 보관: 샘플은 수집 후 즉시 냉동 보관되며, 해동되지 않도록 저온 어큐뮬레이터를 사용하여 실험실로 옮겨집니다.
• 분석: 폐 미생물군집을 분석합니다.
• 폐 생검:
• 기법: 비흡수성 자동봉합사를 이용하여 최소 2cm3의 폐생검을 실시합니다.
• 보관: 샘플은 RNA 안정화 용액 시약(QIAGEN)에 보관됩니다. 이를 통해 샘플은 냉동될 때까지 실온에서 보관되어 RNA 분해를 피할 수 있습니다.
• 분석: 염증 신호 전사의 RNA 서열분석.
• 생체외 관류액 용액:
• 기술: 20cc 주사기를 사용하여 멸균 샘플을 채취합니다.
• 보관: 샘플은 수집 후 즉시 냉동 보관되며, 해동되지 않도록 저온 어큐뮬레이터를 사용하여 실험실로 옮겨집니다.
• 분석: 미생물군집 분석
• 보존액 용액:
• 기술: 20cc 주사기를 사용하여 멸균 샘플을 채취합니다.
• 보관: 샘플은 수집 후 즉시 냉동 보관되며, 해동되지 않도록 저온 어큐뮬레이터를 사용하여 실험실로 옮겨집니다.
• 분석: 미생물군집 및 사이토카인 분석

모든 샘플은 -80도의 냉동고에 보관됩니다.

- 미생물군집 분석 미생물 다양성 분석을 위해 세균 DNA로부터 16S 유전자의 V4 가변영역을 PCR로 증폭합니다. 앰플리콘은 Illumina(MiSeq) 기술을 사용하여 서열 분석됩니다. 샘플이 처리되고 샘플당 시퀀스당 10,000개 이상의 300bp 시퀀스가 ​​생성됩니다.

유전자 발현 분석 RNA 추출은 상용 RNeasy Mini Kit(QIAGEN)을 사용하여 수행됩니다. 유전자 발현 분석은 이식 거부 시 면역 반응과 관련된 것으로 기술된 84개 유전자를 포함하는 SignArray(AnyGenes®, Paris, France)의 미리 설계된 TransplantRejection 패널을 사용하여 정량적 PCR(qPCR)을 통해 수행됩니다. 패널에 포함된 유전자: CX3CR1, ICAM1, ITGA2, ITGAE, ITGAM, PECAM1, THBS1, THBS2, VCAM1, COL1A2, CCR5, CCR7, CD40, CD40LG, CD80, CD86, CTLA4, CXCR3, STAT4, TGFB1, CD44 , CTGF, MMP1, MMP2, MMP7, MMP9, BMP7, CCL11, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CSF2, CXCL10, IFNG, IL10, IL12A, IL13, IL16, IL1B, IL2, IL2RA, IL3, IL32, IL4, IL5 , IL6, IL8, TNF, TGFB2, TGFB3, TIMP1, VEGFA, MS4A1, CXCL11, CXCL9, CXCR4, ADAM17, C3, CASP1, CASP3, CASP8, CCR2, CCR3, CD14, CD28, CD8A, FAS, FASLG, FCGR1A, GZMA , GZMB, NFKB1, NOS2, PRF1, PSMB9, STAT1, STAT6, TAP1, TLR3, TLR4, TLR9, TNFAIP3, TNFSF10.

- 사이토카인 분석 관류액 내 사이토카인 측정은 다양한 분비 단백질(사이토카인, 케모카인, 성장 인자 등)을 동시에 정량화하고 검출할 수 있는 Luminex™ xMAP™ 기술(다중 분석물 프로파일링)을 기반으로 한 면역분석법을 사용하여 수행됩니다. .) 우리는 관심 있는 유전자 산물을 위해 특별히 설계된 패널을 사용할 것입니다.

사이토카인 수준은 다양한 사이토카인의 다중 매개변수 분석을 허용하는 Luminex™ xMAP™ 기술을 기반으로 한 면역분석법을 사용하여 측정됩니다. 이를 위해 맞춤형 사이토카인 패널은 전신 수준에서 사이토카인 및 기타 전염증성 케모카인 생성에 스타틴이 미치는 영향에 대한 출판된 문헌과 폐 이식과 관련된 사이토카인에 대한 서지적 증거를 기반으로 설계되었습니다. 이 목적을 위해 설계된 패널에서 분석된 사이토카인은 IFN 감마, IL-1 베타, IL-6, IL-8(CXCL8), IL-18, IP-10(CXCL10), MCP-1(CCL2), MIP-8입니다. 1 알파(CCL3), TNF 알파, VEGF-D(Custom Procartaplex Multiplex Panel, Invitrogen, ThermoFisher Scientific, MA, USA). 면역학적 분석은 시약과 함께 제공되는 Invitrogen ProcartaPlex Analyst 1.0 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다.

- 서열의 생물정보학적 분석 각 샘플의 미생물 조성을 얻기 위해 QIIME 소프트웨어를 사용합니다. QIIME은 계통발생 정보와 다변량 통계 기술을 사용하여 미생물 군집을 비교하고 통계적으로 다른지 여부 등을 결정하는 소프트웨어 파이프라인입니다. 또한 이 프로그램은 이러한 차이에 가장 큰 영향을 미치는 종을 식별하고 특정 샘플 그룹을 특징짓는 다양한 유형의 패턴을 발견합니다.