Vliv ex-vivo plicního perfuzního systému na mikrobiom plicních štěpů a jejich zánětlivá reakce. (ExBioma)

ODBĚR A SKLADOVÁNÍ VZORKU

• BAL:
• Technika: Bronchoskop bude vložen do segmentu 6, budou nakapány alikvoty sterilního fyziologického roztoku. Postup se bude opakovat v segmentech 3 a 5 v případě pravé plíce a v segmentu 6 a lingule v levé plíci. Pro každý štěp bude doplněno 20-30 ccm BAL.
• Skladování: Vzorky budou ihned po odběru zmraženy a přeneseny do laboratoře se studeným akumulátorem, aby nedošlo k jejich rozmrznutí.
• Analýza: Bude analyzován plicní mikrobiom.
• Biopsie plic:
• Technika: Provede se odběr plicní biopsie o velikosti minimálně 2 cm3 pomocí nevstřebatelné automatické sutury.
• Skladování: Vzorky budou uchovávány v RNA Stabilizačním roztoku Reagent (QIAGEN), který umožňuje uchovávat vzorky při pokojové teplotě až do zmrazení, čímž se zabrání degradaci RNA.
• Analýza: RNA sekvenování transkripce zánětlivých signálů.
• Ex vivo perfuzní kapalný roztok:
• Technika: Odebírání vzorků sterilně pomocí 20cc stříkačky.
• Skladování: Vzorky budou ihned po odběru zmraženy a přeneseny do laboratoře se studeným akumulátorem, aby nedošlo k jejich rozmrznutí.
• Analýza: Analýza mikrobiomů
• Konzervační tekutý roztok:
• Technika: Odebírání vzorků sterilně pomocí 20cc stříkačky.
• Skladování: Vzorky budou ihned po odběru zmraženy a přeneseny do laboratoře se studeným akumulátorem, aby nedošlo k jejich rozmrznutí.
• Analýza: Analýza mikrobiomů a cytokinů

Všechny vzorky budou uloženy v mrazáku při -80

- Analýza mikrobiomu Pro analýzu mikrobiální diverzity bude variabilní oblast V4 genu 16S amplifikována z bakteriální DNA pomocí PCR. Amplikony budou sekvenovány pomocí technologie Illumina (MiSeq). Vzorky budou zpracovány a bude generováno více než 10 000 300bp sekvencí na sekvenci na vzorek.

Analýza genové exprese Extrakce RNA bude provedena pomocí komerční sady RNeasy Mini Kit (QIAGEN). Analýza genové exprese bude provedena pomocí kvantitativní PCR (qPCR) s použitím předem navrženého panelu TransplantRejection od SignArray (AnyGenes®, Paříž, Francie), který obsahuje 84 genů, u kterých bylo popsáno, že souvisejí s imunitní odpovědí při odmítnutí transplantátu. Jsou to: Geny zahrnuté v panelu: CX3CR1, ICAM1, ITGA2, ITGAE, ITGAM, PECAM1, THBS1, THBS2, VCAM1, COL1A2, CCR5, CCR7, CD40, CD40LG, CD80, CD86, CTLA4, CXCR3, STAT4, T4GF , CTGF, MMP1, MMP2, MMP7, MMP9, BMP7, CCL11, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CSF2, CXCL10, IFNG, IL10, IL12A, IL13, IL16, IL1B, IL2, IL2, IL23IL, IL , IL6, IL8, TNF, TGFB2, TGFB3, TIMP1, VEGFA, MS4A1, CXCL11, CXCL9, CXCR4, ADAM17, C3, CASP1, CASP3, CASP8, CCR2, CCR3, CD14, CD28, CD8FAA, FAS, CD81A, GZMASLG, FAS , GZMB, NFKB1, NOS2, PRF1, PSMB9, STAT1, STAT6, TAP1, TLR3, TLR4, TLR9, TNFAIP3, TNFSF10.

- Analýza cytokinů Stanovení cytokinů v perfuzní tekutině bude provedeno pomocí imunotestů založených na technologii Luminex™ xMAP™ (profilování více analytů), které umožňují současnou kvantifikaci a detekci různých vylučovaných proteinů (cytokiny, chemokiny, růstové faktory atd.). .) Použijeme panely navržené speciálně pro genové produkty, které nás zajímají.

Hladiny cytokinů se měří pomocí imunotestu založeného na technologii Luminex™ xMAP™, která umožňuje multiparametrickou analýzu různých cytokinů. Za tímto účelem je navržen personalizovaný panel cytokinů na základě publikované literatury o účinku statinů na produkci cytokinů a dalších prozánětlivých chemokinů na systémové úrovni a také bibliografických důkazů o cytokinech účastnících se transplantace plic. Cytokiny analyzované v panelu navrženém pro tento účel jsou IFN gama, IL-1 beta, IL-6, IL-8 (CXCL8), IL-18, IP-10 (CXCL10), MCP-1 (CCL2), MIP- 1 alfa (CCL3), TNF alfa, VEGF-D (Custom Procartaplex Multiplex Panel, Invitrogen, ThermoFisher Scientific, MA, USA). Imunologická analýza bude provedena pomocí softwaru Invitrogen ProcartaPlex Analyst 1.0 dodávaného s reagenciemi.

- Bioinformatická analýza sekvencí K získání mikrobiálního složení každého vzorku použijeme software QIIME. QIIME je softwarový kanál, který využívá fylogenetické informace a vícerozměrné statistické techniky k porovnání mikrobiálních komunit a například k určení, zda se statisticky liší. Program také identifikuje druhy, které k těmto rozdílům nejvíce přispívají, a objevuje vzory různých typů, které charakterizují konkrétní skupiny vzorků.