Wpływ systemu perfuzji płuc ex vivo na mikrobiom przeszczepów płuc i ich reakcję zapalną. (ExBioma)

POBIERANIE PRÓBEK I PRZECHOWYWANIE

• BAL:
• Technika: Bronchoskop zostanie wprowadzony do segmentu 6, zostaną wkroplone porcje jałowej soli fizjologicznej. Zabieg zostanie powtórzony w segmencie 3 i 5 w przypadku płuca prawego oraz w segmencie 6 i linguli w płucu lewym. Na każdy przeszczep zostanie zużyte 20–30 cm3 BAL.
• Przechowywanie: Próbki zostaną zamrożone natychmiast po pobraniu i przeniesione do laboratorium wraz z zimnym akumulatorem, aby zapobiec ich rozmrożeniu.
• Analiza: Przeanalizowany zostanie mikrobiom płuc.
• Biopsja płuc:
• Technika: Pobrana zostanie biopsja płuca o objętości minimum 2 cm3 przy użyciu niewchłanialnego szwu automatycznego.
• Przechowywanie: Próbki będą konserwowane w odczynniku do stabilizacji RNA (QIAGEN), który pozwala na przechowywanie próbek w temperaturze pokojowej do czasu zamrożenia, co pozwala uniknąć degradacji RNA.
• Analiza: Sekwencjonowanie RNA transkrypcji sygnałów zapalnych.
• Roztwór płynu perfuzyjnego ex vivo:
• Technika: Pobieranie próbek w sposób sterylny za pomocą strzykawki o pojemności 20 cm3.
• Przechowywanie: Próbki zostaną zamrożone natychmiast po pobraniu i przeniesione do laboratorium wraz z zimnym akumulatorem, aby zapobiec ich rozmrożeniu.
• Analiza: Analiza mikrobiomu
• Roztwór płynu konserwującego:
• Technika: Pobieranie próbek w sposób sterylny za pomocą strzykawki o pojemności 20 cm3.
• Przechowywanie: Próbki zostaną zamrożone natychmiast po pobraniu i przeniesione do laboratorium wraz z zimnym akumulatorem, aby zapobiec ich rozmrożeniu.
• Analiza: Analiza mikrobiomu i cytokin

Wszystkie próbki będą przechowywane w zamrażarce w temperaturze -80°C

- Analiza mikrobiomu W celu analizy różnorodności drobnoustrojów region zmienny V4 genu 16S zostanie amplifikowany z bakteryjnego DNA metodą PCR. Amplikony będą sekwencjonowane przy użyciu technologii Illumina (MiSeq). Próbki zostaną przetworzone i wygenerowanych zostanie ponad 10 000 sekwencji o długości 300 bp na sekwencję na próbkę.

Analiza ekspresji genów Ekstrakcja RNA zostanie przeprowadzona przy użyciu dostępnego w handlu zestawu RNeasy Mini Kit (QIAGEN). Analiza ekspresji genów zostanie przeprowadzona metodą ilościowej PCR (qPCR) przy użyciu wstępnie zaprojektowanego panelu TransplantRejection firmy SignArray (AnyGenes®, Paryż, Francja), który obejmuje 84 geny, które opisano jako powiązane z odpowiedzią immunologiczną w przypadku odrzucenia przeszczepu. Są to: Geny uwzględnione w panelu: CX3CR1, ICAM1, ITGA2, ITGAE, ITGAM, PECAM1, THBS1, THBS2, VCAM1, COL1A2, CCR5, CCR7, CD40, CD40LG, CD80, CD86, CTLA4, CXCR3, STAT4, TGFB1, CD44 , CTGF, MMP1, MMP2, MMP7, MMP9, BMP7, CCL11, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CSF2, CXCL10, IFNG, IL10, IL12A, IL13, IL16, IL1B, IL2, IL2RA, IL3, IL32, IL4, IL5 , IL6, IL8, TNF, TGFB2, TGFB3, TIMP1, VEGFA, MS4A1, CXCL11, CXCL9, CXCR4, ADAM17, C3, CASP1, CASP3, CASP8, CCR2, CCR3, CD14, CD28, CD8A, FAS, FASLG, FCGR1A, GZMA , GZMB, NFKB1, NOS2, PRF1, PSMB9, STAT1, STAT6, TAP1, TLR3, TLR4, TLR9, TNFAIP3, TNFSF10.

- Analiza cytokin Oznaczenie cytokin w płynie perfuzyjnym zostanie przeprowadzone przy użyciu testów immunologicznych opartych na technologii Luminex™ xMAP™ (profilowanie wieloanalityczne), które umożliwiają jednoczesną ocenę ilościową i detekcję różnych wydzielanych białek (cytokin, chemokin, czynników wzrostu itp.) .) Będziemy używać paneli zaprojektowanych specjalnie dla interesujących nas produktów genowych.

Poziomy cytokin mierzy się za pomocą testu immunologicznego opartego na technologii Luminex™ xMAP™, która umożliwia wieloparametryczną analizę różnych cytokin. W tym celu opracowano spersonalizowany panel cytokin w oparciu o opublikowaną literaturę na temat wpływu statyn na wytwarzanie cytokin i innych chemokin prozapalnych na poziomie ogólnoustrojowym, a także dowody bibliograficzne dotyczące cytokin biorących udział w przeszczepianiu płuc. Cytokiny analizowane w panelu przeznaczonym do tego celu to IFN gamma, IL-1 beta, IL-6, IL-8 (CXCL8), IL-18, IP-10 (CXCL10), MCP-1 (CCL2), MIP- 1 alfa (CCL3), TNF alfa, VEGF-D (niestandardowy panel Procartaplex Multiplex, Invitrogen, ThermoFisher Scientific, MA, USA). Analiza immunologiczna zostanie przeprowadzona przy użyciu oprogramowania Invitrogen ProcartaPlex Analyst 1.0, dostarczanego wraz z odczynnikami.

- Analiza bioinformatyczna sekwencji. Do określenia składu mikrobiologicznego każdej próbki posłużymy się oprogramowaniem QIIME. QIIME to potok oprogramowania, który wykorzystuje informacje filogenetyczne i wielowymiarowe techniki statystyczne do porównywania zbiorowisk drobnoustrojów i określania na przykład, czy różnią się one statystycznie. Program identyfikuje także gatunki, które w największym stopniu przyczyniają się do tych różnic i odkrywa różnego rodzaju wzorce charakteryzujące określone grupy próbek.