神经系统疾病中的脉络丛功能障碍 (PLEXFOLD)

脑叶酸缺乏症 (CFD) 是一种脑脊液 (CSF) 中 5-甲基四氢叶酸（5MTHF，叶酸的生物活性形式）浓度低 (<41 nM) 的病症。1. CFD 被认为是“原发性”的如果它与涉及叶酸代谢的几种遗传疾病有关，导致严重的运动和认知表现，则可能是其起源。 CFD 也可以是“继发性”的，即与各种明确的疾病相关，例如遗传性线粒体疾病以及不明疾病。 在继发性 CFD 中，CFD 的原因尚不清楚。 在该中心，研究小组确定了 16 名具有共同特征的 CFD 患者：深部继发性 CFD（5MTHF<10nM，而血液叶酸正常）、高蛋白 CSF >1g/L（N<0.5）以及脑白质的特定受累， T2 加权 MRI 呈高信号。 该团队将这种综合征称为“LHIPFOLD”，即伴有脑脊液高蛋白和叶酸缺乏的白质脑病（保密，计划于 2022 年底提交）。 在法国代谢生化实验室网络内，研究小组又发现了 6 名 LHIPFOLDpat（LHIPFOLD 患者）。 他们的平均年龄为 42 至 14 岁（最小 15 岁；最大 77 岁），性别比为 1.8（男/女）。 9/22 具有较大的线粒体 DNA 缺失（Kearns-Sayre）或双等位基因 POLG 突变（线粒体 DNA 复制缺陷）。 其他 13 名患者直到最近才被诊断出来，但该团队在研究背景下发现并在体外验证了 4/7 测试患者的 MRPS 家族基因中的双等位基因变异，这些基因编码线粒体核糖体的亚单位。

LHIPFOLD 患者明显存在脑内 5MTHF 转运缺陷，但脑叶酸转运蛋白没有突变。 由于叶酸完全通过脉络丛 (CP)2 从血液转运至大脑，因此研究小组推测 LHIPFOLD 中的 CFD 是由于 CP 功能障碍所致。 CP 位于脑室，是一种血管化上皮器官，充当血液-脑脊液屏障，表达大量转运蛋白，用于将分子从血液转移到脑脊液，反之亦然（清除脑细胞中的废物）。 CP还分泌CSF并表达与各种功能相关的CSF分泌蛋白3。

由于血脑屏障改变而导致的高蛋白 CSF，以及两名 Kearns-Sayre 患者脑部尸检报告的异常 CP 形态也支持 LHIPFOLD 4 中的 CP 功能障碍。此外，在两个 LHIPFOLDpat 中，研究小组发现非常高浓度的CSF唾液酸不涉及唾液酸相关基因，而CP强烈表达唾液酸外流转运蛋白。 该团队最近还在另外两个 LHIPFOLD 模型中测量到自动分割后 CP 尺寸大幅下降。 所有这些数据都强烈支持 LHIPFOLD 的 CP 功能障碍。

如果假设正确，则意味着除了 CFD 之外，其他脑脊液异常也可能是广泛性 CP 功能障碍的结果。 就治疗方法而言，这可能非常有趣，因为叶酸补充剂具有明确但有限的治疗效果，尤其是对某些患者。 不幸的是，为了评估我们的假设，目前还没有可用的临床探索来评估 CP 功能，而 CP 功能障碍/改变被认为是几种常见神经系统疾病的潜在发病机制因素（在下文中，团队将使用功能障碍来表示功能障碍和改变） ）。 由于研究小组认为 LHIPFOLD 中的 CP 功能障碍特别严重，正如深部 CFD 所表明的那样，研究小组认为 LHIPFOLD 综合征是一个非常有用的临床模型，可以验证一些相关诊断工具评估 CP 功能的能力。 因此，该项目的目标是：

1. 使用以 CP 为中心的成像以及代谢组学和蛋白质组学方法，通过识别特定的 CP 相关 MRI 和生化特征，证明 LHIPFOLD 中的 CP 功能障碍。
2. 识别 LHIPFOLD 中直接适合治疗的 CP 相关生化生物标志物。
3. 设置成像和生化诊断测试，用于评估临床实践中的 CP 功能（基于生物标志物的 CP 功能障碍评分）。

为了实现目标，该团队将基于描述性、确定性统计和多维聚类方法进行单中心诊断第一阶段病例对照研究，并得到专门为 LHIPFOLDpat 与健康志愿者 (HV) 和健康志愿者 (HV) 的 CP 探索而设计的补充诊断工具的支持。神经控制患者（NCpat）。 NCpat 将用于评估 LHIPFOLDpat 中识别的 CP 相关签名的特异性。 研究小组预计，某些 NCpat 中的发现结果将与 HV 类似，但会反映出其他 NCpat 中轻微至中度的 CP 功能障碍。 在 AP-HP 作为研究赞助商的情况下，该团队将根据现行立法和监管要求，获得研究伦理委员会对“Jardé 1”研究的批准。

-患者和对照的选择和招募 受试者将在两年内前瞻性招募： 1)LHIPFOLDpat 将按照之前的描述进行选择； 2）HV将按照通常的广告程序招募，并与LHIPFOLDpat进行年龄和性别匹配； 3) NCpat 将是年龄和性别匹配的患有神经内科常见脑部疾病的患者：多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化症、阿尔茨海默病、额颞叶痴呆、特发性颅内高压和正常压力脑积水。 这些疾病的诊断将根据专门研究每种疾病的神经科医生的最新指南进行。 对于招募的样本，团队考虑了两个限制：LHIPFOLDpat 的数量有限；该研究不是与对照组进行简单的确定性比较，而是一种多维分析，通过同质患者群识别 CP 相关特征。 因此，策略是确定全球样本量，从而根据 5 或 6 种生物标志物对患者进行同质分类。 根据多尼卡公式5，通过分层抽样技术正确选择的 2^6 名患者应该允许这样做。 这 64 名患者将包括 15 名 LHIPFOLDpat 患者以及同等数量的 25 名 HV 患者和 25 名 NCpat 患者。 此外，保持确定性方法，并基于分别对 15 名和 25 名受试者整合 LHIPFOLDpat 和 NCpat 中 CSF 5MTHF 的平均值和标准差（分别为 3.85 +/- 2.67 和 49.53 +/- 13.35）的模拟研究，该样本量提供了大于 95% 的功效可证明这两组之间的 Wilcoxon Rank Sum 检验存在差异（值得注意的是，HV 值目前未知）。

该团队将获取所有受试者的脑部 MRI 数据（注射血钆）、血液和脑脊液样本。 LHIPFOLDpat 和 NCpat 将在 Pitié-Salpêtrière 医院神经内科接受这些手术，作为标准护理的一部分。 HV 有一天将在我们的临床研究中心住院。 所有受试者将签署知情同意书，并同意接受 MRI 检查以及血液和脑脊液采样以用于 HV 研究目的，并同意为患者提供额外的 MRI 时间采集和样本量。

• 脑 MRI 研究 脑 MRI 将在巴黎脑研究所 (ICM) 的神经影像研究中心 (CENIR) 的成像平台 3 TESLA（西门子 PRISMA）进行。 该团队将评估 CP 形态和功能：1/对于 CP 形态分析，该团队将测量 CP 体积并提取结构参数。 CP 分割将使用现场开发的自动化软件进行。 将使用 MP2RAGE MRI 序列进行纹理分析。 2/CP功能评估将包括毛细血管通透性和大血管灌注的定量测量。 为了探索 CP 通透性，将使用钆增强的动态 T1 灌注序列； t-TRANS 和其他区域值将被提取。 后处理将使用Syngovia（西门子）软件进行。 为了探索 CP 大血管灌注，该团队将使用之前发布的动态动脉旋转标记灌注（不含钆）的较短版本 6。 通过这个序列，团队将能够了解动脉传输时间和表观血流。 数据分析将在 CENIR 进行。
• 在 CSF/血室中发现 CP 功能障碍生物标志物候选物 将使用两种混合方法来选择前 10 种候选生物标志物（先验 5 种代谢物和 5 种蛋白质），并通过有针对性的完全定量分析进行研究： i) 非靶向代谢组学和蛋白质组学（将审查研究结果以评估与 CP 功能的可能联系）； ii）假设驱动方法：除了5MTHF之外，根据文献和公开生物数据库的数据，研究小组还鉴定了似乎由CP特异性转运的代谢物（包括抗坏血酸和唾液酸）以及蛋白质由CP（包括TRPM3和Klotho）具体表达。 由于血液浓度会影响某些分子的脑脊液浓度，因此研究小组计划同时分析血液和脑脊液样本，并计算脑脊液/血液浓度比。

对于非靶向代谢组学，将在甲醇辅助蛋白质沉淀后获得脑脊液和血浆样品的代谢提取物，并通过液相色谱法与高分辨率质谱法 (LC-HRMS) 进行分析，正如团队常规执行的那样。 7. 两种互补 LC- 的组合HRMS 平台将用于分析疏水性和极性代谢物8。 数据预处理和统计分析将通过Workflow4Metabolomics（W4M）来实现，这是一个计算代谢组学的开源协作在线平台。 数据集的注释和生物相关信号的识别将通过使用“内部”光谱库和 MS/MS（串联质谱）实验来进行。 通过使用质量控制样品进行标准化，将实现约 250 种代谢物的相对定量。 对于靶向代谢组学，CSF 5MTHF 通常在专门研究神经代谢的 Necker 实验室中使用非常灵敏和特异的分析方法（液相色谱与串联 MS 联用）进行测量。 该团队正在将抗坏血酸和唾液酸措施纳入同一运行中。 根据非靶向研究中确定的候选代谢物生物标志物的化学性质，将开发一种或几种使用稳定同位素进行稳健定量的新方法。

对高脑脊液蛋白患者和对照的脑脊液进行初步蛋白质组学研究将使我们能够建立样品制备方案、选择质谱分析方法和数据分析工作流程。 目标是双重的：优化蛋白质的提取，并允许比较非常不同的 CSF，以便开发一种分析策略，使我们能够识别生物标志物。 该研究将通过使用无标记方法进行，以最大限度地减少变异性、步骤数，尤其是不限制样本的动态范围。 所有生物信息学分析都将使用 myProMS9 进行，这是我们在居里研究所与 E. Barillot 博士指导的 INSERM U900 生物信息学平台合作开发的蛋白质组数据管理和分析软件。 对于靶向蛋白质组学方法，该团队将利用靶向 MS 的专业知识和稳定同位素标记的内标肽，这是生物液体中蛋白质定量的金标准方法，从而实现高稳健性、高灵敏度和多重分析10。

-交叉数据分析 该团队将集中管理、分析和整合 MRI 和生物样本分析生成的临床和生物数据集以及知识，以识别 LHIPFOLD 患者的全局 CP 相关特征。 有了这些数据，该团队将建立一个用于常规临床实践的 CP 功能障碍评分，旨在用于探索神经系统患者的 CP。