신경 질환에서의 맥락막 신경총 기능 장애 (PLEXFOLD)

뇌엽산 결핍증(CFD)은 뇌척수액(CSF)에 있는 5-메틸테트라히드로엽산(5MTHF, 생물학적 활성 형태의 엽산)의 낮은 농도(<41nM)로 정의되는 상태입니다. 1. CFD는 "일차적"인 것으로 간주됩니다. 엽산 대사와 관련된 여러 유전 질환과 연관되어 심각한 운동 및 인지 증상을 초래하는 경우 발생합니다. CFD는 "2차적"일 수도 있습니다. 즉, 유전적 미토콘드리아 질환 및 미확인 질병과 같은 다양한 명확한 질병과 연관될 수도 있습니다. 2차 CFD에서는 CFD의 원인이 이해되지 않습니다. 센터에서 팀은 심부 2차 CFD(혈액 엽산은 정상인 반면 5MTHF<10nM), 고단백 CSF >1g/L(N<0.5), 뇌 백질의 특정 침범이라는 공통 특성을 가진 16명의 CFD 환자를 확인했습니다. T2 강조 MRI의 고강도. 팀은 CSF 고단백질 및 FOLate 결핍을 동반한 백질뇌병증에 대해 이 증후군을 "LHIPFOLD"라고 명명했습니다(기밀, 2022년 말 제출 예정). 프랑스 대사 생화학 실험실 네트워크 내에서 팀은 6명의 LHIPFOLDpat(LHIPFOLD 환자)를 추가로 식별했습니다. 이들의 평균 연령은 42~14세(최소 15세, 최대 77세)이고 성비는 1.8(남/여)입니다. 9/22에는 대규모 미토콘드리아 DNA 결실(Kearns-Sayre) 또는 이중 대립유전자 POLG 돌연변이(미토콘드리아 DNA 복제 결함)가 있었습니다. 나머지 13명의 환자는 모두 최근까지 진단되지 않았지만, 연구팀은 연구 맥락에서 미토리보솜의 하위 단위를 코딩하는 MRPS 계열의 유전자 내에서 4/7의 테스트 환자에서 시험관 내 이중 대립유전자 변이를 확인했습니다.

LHIPFOLD 환자는 분명히 뇌내 5MTHF 수송에 결함이 있지만 뇌 엽산 수송체에는 돌연변이가 없습니다. 엽산은 맥락막 신경총(CP)2에 의해 혈액에서 뇌로 독점적으로 운반되기 때문에 연구팀은 LHIPFOLD의 CFD가 CP 기능 장애로 인한 것이라고 가정했습니다. 뇌실에 국한된 CP는 혈액-CSF 장벽 역할을 하는 혈관화된 상피 기관으로, 혈액에서 CSF로 또는 그 반대로 분자를 전달하기 위한 수많은 수송체를 발현합니다(뇌 세포에서 노폐물 제거). CP는 또한 CSF를 분비하고 다양한 기능과 관련된 CSF 분비 단백질을 발현합니다3.

혈액 뇌 장벽 변화로 인한 고단백 CSF와 두 명의 Kearns-Sayre 환자의 뇌 부검에서 보고된 비정상적인 CP 형태 또한 LHIPFOLD 4의 CP 기능 장애에 유리한 것으로 나타났습니다. 또한 두 개의 LHIPFOLDpat에서 팀은 매우 높은 농도의 CP를 발견했습니다. CSF 시알산은 시알산 관련 유전자가 관여하지 않는 반면, CP는 시알산 유출 수송체를 강력하게 발현합니다. 또한 팀은 최근 두 개의 다른 LHIPFOLD pat에서 자동 분할 후 CP 크기가 크게 감소한 것을 측정했습니다. 이러한 모든 데이터는 LHIPFOLD의 CP 기능 장애를 강력하게 주장합니다.

가설이 맞다면 이는 CFD 외에도 일반화된 CP 기능 장애의 결과로 다른 CSF 이상이 존재할 수 있음을 의미합니다. 이는 치료적 접근 측면에서 매우 흥미로울 수 있습니다. 엽산 보충은 특히 일부 환자의 경우 명확하지만 제한적인 치료 효과를 갖기 때문입니다. 불행하게도 우리의 가설을 평가하기 위해 CP 기능을 평가할 수 있는 임상적 탐색은 없지만 CP 기능 장애/변형은 여러 일반적인 신경 질환의 잠재적 발병 원인으로 제안됩니다(다음 텍스트에서 팀은 기능 장애와 변화 모두에 기능 장애를 사용할 것입니다) ). 팀은 심층 CFD에서 제안한 것처럼 LHIPFOLD에서 CP 기능 장애가 특히 심각하다고 생각하므로, 팀은 LHIPFOLD 증후군을 CP 기능을 평가하기 위한 일부 관련 진단 도구의 용량을 검증하는 데 매우 유용한 임상 모델로 간주합니다. 따라서 프로젝트의 목표는 다음과 같습니다.

1. CP 중심 이미징 및 대사체학 및 단백질체학 접근법을 사용하여 특정 및 CP 관련 MRI 및 생화학적 특징의 식별을 통해 LHIPFOLD의 CP 기능 장애를 입증합니다.
2. LHIPFOLD에서 직접 치료가 가능한 CP 관련 생화학적 바이오마커를 식별합니다.
3. 임상 실습에서 CP 기능을 평가하기 위한 설정 영상 및 생화학적 진단 테스트(바이오마커 기반 CP 기능 장애 점수).

방법론 목표를 달성하기 위해 팀은 LHIPFOLDpat의 CP 탐색과 건강한 지원자(HV) 및 신경학적 조절 환자(NCpat). NCpat는 LHIPFOLDpat에서 식별된 CP 관련 서명의 특이성을 평가하는 데 사용됩니다. 팀은 결과가 일부 NCpat에서는 HV와 유사하지만 다른 NCpat에서는 경미하거나 중간 정도의 CP 기능 장애를 반영할 것으로 예상합니다. AP-HP를 연구 후원자로 삼아 팀은 시행 중인 법률 및 규제 요구 사항에 따라 "Jardé 1" 연구에 대한 연구 윤리 위원회의 승인을 받게 됩니다.

- 환자 및 대조군 선택 및 모집 피험자는 2년 동안 전향적으로 모집됩니다. 1) LHIPFOLDpat는 이전에 설명한 대로 선택됩니다. 2) HV는 일반적인 광고 절차를 통해 모집되며, LHIPFOLDpat를 통해 연령과 성별을 매칭합니다. 3) NCpat는 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증, 알츠하이머병, 전두측두엽 치매, 특발성 두개내 고혈압, 정상압 수두증 등 신경과에서 자주 조사되는 명확한 일반적인 뇌 질환을 가진 연령 및 성별이 일치하는 환자입니다. 이러한 질병의 진단은 각 질병을 전문으로 하는 신경과 전문의의 최신 지침에 따라 이루어집니다. 모집할 샘플과 관련하여 팀은 두 가지 제약 조건을 고려했습니다. LHIPFOLDpat의 수가 제한되어 있습니다. 이 연구는 대조군과의 단순한 결정론적 비교가 아니라 균질한 환자 클러스터를 통해 CP 관련 시그니처를 식별하는 다차원 분석에 가깝습니다. 결과적으로, 전략은 5개 또는 6개의 바이오마커를 기반으로 환자를 균질하게 분류할 수 있는 전체 표본 크기를 식별하는 것이었습니다. Donicar의 공식5에 따르면 계층화된 샘플링 기법으로 적절하게 선택된 2^6명의 환자가 이를 허용해야 합니다. 이들 64명의 환자에는 LHIPFOLDpat 15명과 HV 25명, NCpat 25명이 포함됩니다. 또한 결정론적 접근 방식을 유지하고 각각 15명 및 25명의 피험자를 대상으로 LHIPFOLDpat 및 NCpat(각각 3.85 +/- 2.67 및 49.53 +/- 13.35)에서 CSF 5MTHF의 평균 및 표준 편차를 통합한 시뮬레이션 연구를 기반으로 이 표본 크기는 다음을 제공합니다. 이 두 그룹 간의 Wilcoxon Rank Sum 테스트와의 차이를 입증하기 위한 95%보다 큰 검정력입니다(참고로 HV 값은 현재 알려지지 않았습니다).

팀은 모든 피험자로부터 뇌 MRI 데이터(혈액 가돌리늄 주입 포함), 혈액 및 CSF 샘플을 수집합니다. LHIPFOLDpat과 NCpat는 Pitié-Salpêtrière 병원의 신경과에서 표준 치료의 일환으로 이러한 절차를 받게 됩니다. HV는 어느 날 임상 조사 센터에 입원하게 됩니다. 모든 피험자는 사전 동의에 서명하고 HV에 대한 연구 목적으로 MRI 검사, 혈액 및 CSF 샘플링, 환자를 위한 추가 MRI 시간 획득 및 샘플량을 받는 데 동의합니다.

• 뇌 MRI 연구 뇌 MRI는 파리 뇌 연구소(ICM)의 영상 플랫폼인 CENIR(Centre for Neuroimaging Research) 내 3 TESLA(Siemens PRISMA)에서 수행됩니다. 팀은 CP 형태와 기능을 모두 평가합니다. 1/CP 형태 분석의 경우 팀은 CP 양을 측정하고 조직 매개변수를 추출합니다. CP 세분화는 현장에서 개발된 자동화된 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다. 텍스처 분석은 MP2RAGE MRI 시퀀스를 사용하여 수행됩니다. 2/CP 기능 평가에는 모세혈관 투과성과 대혈관 관류의 정량적 측정이 포함됩니다. CP 투과성을 탐색하기 위해 가돌리늄 강화 기능이 있는 동적 T1 관류 시퀀스가 ​​사용됩니다. t-TRANS 및 기타 지역 값이 추출됩니다. 후처리는 Syngovia(Siemens) 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다. CP 대혈관 관류를 탐색하기 위해 팀은 이전에 발표된 동적 동맥 회전 라벨링 관류(가돌리늄 제외)의 더 짧은 버전을 사용할 것입니다. 이 시퀀스를 통해 팀은 동맥 통과 시간과 명백한 혈류를 평가할 수 있습니다. 데이터 분석은 CENIR에서 수행됩니다.
• CSF/혈액 구획에서 CP 기능 장애 바이오마커 후보 발견 두 가지 혼합 접근법을 사용하여 표적화되고 완전 정량 분석으로 조사할 상위 10개 바이오마커 후보(선험적으로 5개 대사산물 및 5개 단백질)를 선택합니다. i) 비표적 대사체학 및 단백질체학(CP 기능과의 가능한 연관성을 평가하기 위해 조사 결과를 검토할 예정임); ii) 가설 기반 접근법: 5MTHF 외에도 문헌의 데이터와 공개적으로 이용 가능한 생물학적 데이터베이스를 기반으로 팀은 또한 CP에 의해 특별히 운반되는 것으로 보이는 대사산물(아스코르브산 및 시알산 포함)과 단백질을 식별했습니다. CP(TRPM3 및 Klotho 포함)에 의해 구체적으로 표현됩니다. 혈액 농도가 일부 분자의 CSF 농도에 영향을 미칠 수 있기 때문에 연구팀은 CSF/혈액 농도 비율을 계산하여 혈액과 CSF를 동시에 분석할 계획입니다.

비표적 대사체학의 경우, 메탄올 보조 단백질 침전 후 CSF 및 혈장 샘플의 대사 추출물을 얻고 팀이 일상적으로 수행하는 대로 고분해능 질량 분석법(LC-HRMS)과 결합된 액체 크로마토그래피로 분석합니다. HRMS 플랫폼은 소수성 및 극성 대사산물을 모두 프로파일링하는 데 사용됩니다8. 데이터 전처리 및 통계 분석은 계산 대사체학을 위한 오픈 소스 협업 온라인 플랫폼인 Workflow4Metabolomics(W4M)를 사용하여 수행됩니다. 데이터 세트의 주석 작성과 생물학적으로 관련된 신호의 식별은 '사내' 스펙트럼 라이브러리와 MS/MS(직렬 질량 분석법) 실험을 사용하여 수행됩니다. 품질 관리 샘플을 사용한 정규화 덕분에 ~250개의 대사산물의 상대적 정량화가 달성됩니다. 표적 대사체학의 경우 CSF 5MTHF는 매우 민감하고 구체적인 분석 방법(탠덤 MS에 하이픈이 연결된 액체 크로마토그래피)을 사용하여 신경대사를 전문으로 하는 Necker 실험실에서 정기적으로 측정됩니다. 팀은 동일한 실행에 아스코르브산 및 시알산 측정값을 포함시키는 과정을 진행 중입니다. 비표적 연구에서 확인된 대사산물 바이오마커 후보의 화학적 특성에 따라 안정 동위원소를 사용하여 확실한 정량화를 위한 하나 또는 몇 가지 새로운 방법이 개발될 것입니다.

CSF 단백질이 높은 환자의 CSF와 대조군에 대한 예비 단백질체학 연구를 통해 샘플 준비 프로토콜을 확립하고 질량 분석법 분석 방법을 선택하며 데이터 분석 워크플로우를 분석할 수 있습니다. 목표는 두 가지입니다. 단백질 추출을 최적화하고 매우 다른 CSF를 비교하여 바이오마커를 식별할 수 있는 분석 전략을 개발하는 것입니다. 이 연구는 가변성과 단계 수를 최소화하고 특히 샘플의 동적 범위를 제한하지 않기 위해 라벨 없는 접근 방식을 사용하여 수행됩니다. 모든 생물정보학 분석은 E. Barillot 박사가 지휘하는 INSERM U900 생물정보학 플랫폼과 협력하여 Institut Curie에서 개발한 단백질체 데이터 관리 및 분석 소프트웨어인 myProMS9를 사용하여 수행됩니다. 표적화된 단백질체학 접근 방식을 위해 팀은 생물학적 유체의 단백질 정량화를 위한 최적의 표준 접근 방식인 안정 동위원소 표지 내부 표준 펩타이드를 사용하는 표적 MS에 대한 전문 지식을 사용하여 높은 견고성, 고감도 및 다중 분석을 실현할 것입니다10.

-교차 데이터 분석 팀은 LHIPFOLD 환자의 글로벌 CP 관련 시그니처를 식별하기 위해 MRI 및 생물학적 시료 분석을 통해 생성된 임상 및 생물학적 데이터 세트와 지식을 중앙에서 관리, 분석 및 통합합니다. 이 데이터를 통해 팀은 일상적인 임상 실습에 사용할 CP 기능 장애 점수를 확립하고 신경학적 환자의 CP를 탐색하는 데 사용할 예정입니다.