Disfunção do Plexo Coroide em Doenças Neurológicas (PLEXFOLD)

A deficiência cerebral de folato (CFD) é uma condição definida pela baixa concentração (<41 nM) de 5-metiltetrahidrofolato (5MTHF, a forma biologicamente ativa de folato) no líquido cefalorraquidiano (LCR) 1. A CFD é considerada "primária" origem se estiver associada a diversas doenças genéticas que envolvem o metabolismo do folato, levando a graves manifestações motoras e cognitivas. A CFD também pode ser “secundária”, ou seja, associada a várias doenças definidas, como doenças genéticas mitocondriais e também doenças não identificadas. Na CFD secundária, a causa da CFD não é compreendida. No centro, a equipe identificou 16 pacientes com DFC com características comuns: DFC secundária profunda (5MTHF<10nM enquanto o folato no sangue é normal), LCR rico em proteínas >1g/L (N<0,5) e um envolvimento específico da substância branca do cérebro, hiperintenso na ressonância magnética ponderada em T2. A equipe chamou essa síndrome de "LHIPFOLD" para leucoencefalopatia com alto teor de proteína no LCR e deficiência de FOLate (confidencial, envio planejado para o final de 2022). Dentro da rede francesa de laboratórios de bioquímica metabólica, a equipe identificou 6 LHIPFOLDpat adicionais (pacientes LHIPFOLD). Têm uma idade média de 42 a 14 anos (mínimo 15; máximo 77) e uma proporção sexual de 1,8 (M/F). 22/09 teve uma grande deleção de DNA mitocondrial (Kearns-Sayre) ou mutações POLG bialélicas (defeito de replicação de DNA mitocondrial). Os outros 13 pacientes não foram diagnosticados até recentemente, mas a equipe encontrou em um contexto de pesquisa e validou variantes bialélicas in vitro em 4/7 pacientes testados dentro de genes da família MRPS, codificando subunidades do mitoribossomo.

Os pacientes LHIPFOLD apresentam claramente um defeito no transporte intracerebral de 5MTHF, mas sem mutação nos transportadores cerebrais de folato. Como o folato é transportado exclusivamente do sangue para o cérebro pelo plexo coróide (CP)2, a equipe levanta a hipótese de que o CFD no LHIPFOLD é devido à disfunção do CP. A CP, localizada nos ventrículos cerebrais, é um órgão epitelial vascularizado que atua como uma barreira sangue-LCR, expressando numerosos transportadores para transferência de moléculas do sangue para o LCR e vice-versa (removendo produtos residuais das células cerebrais). A CP também secreta LCR e expressa proteínas secretadas pelo LCR relacionadas a diversas funções3.

O LCR rico em proteínas devido a uma alteração da barreira hematoencefálica e a morfologia anormal da CP relatada na autópsia cerebral em dois pacientes de Kearns-Sayre também são a favor da disfunção da CP no LHIPFOLD 4. Além disso, em dois LHIPFOLDpat, a equipe encontrou concentrações muito altas de Ácido siálico no LCR sem o envolvimento de genes relacionados ao ácido siálico, enquanto a CP expressa fortemente o transportador de efluxo de ácido siálico. A equipe também mediu recentemente uma forte diminuição no tamanho do CP após a segmentação automática em dois outros padrões LHIPFOLD. Todos esses dados argumentam fortemente a favor da disfunção da CP no LHIPFOLD.

Se a hipótese estiver correta, significa que, além da DFC, provavelmente existem outras anormalidades no LCR como consequência da disfunção generalizada da PC. Isto pode ser muito interessante em termos de abordagem terapêutica, uma vez que a suplementação de folato tem um efeito terapêutico claro mas limitado, especialmente em alguns pacientes. Infelizmente, para avaliar nossa hipótese, não há exploração clínica disponível para avaliar as funções da PC, enquanto a disfunção/alteração da PC é sugerida como um potencial contribuinte para a patogênese em várias doenças neurológicas comuns (no texto a seguir a equipe usará disfunção tanto para disfunção quanto para alteração ). Como a equipe pensa que no LHIPFOLD a disfunção da PC é particularmente grave, conforme sugerido pelo CFD profundo, a equipe considera a síndrome LHIPFOLD um modelo clínico muito útil para validar a capacidade de algumas ferramentas diagnósticas relevantes para avaliar a função da PC. Portanto, os objetivos do projeto são:

1. Prove a disfunção da CP no LHIPFOLD, através da identificação de ressonância magnética e assinaturas bioquímicas específicas e relacionadas à CP, usando imagens centradas na CP e abordagens metabolômicas e proteômicas.
2. Identifique biomarcadores bioquímicos relacionados à CP em LHIPFOLD diretamente passíveis de tratamento.
3. Configurar exames de imagem e diagnóstico bioquímico para avaliar a função da CP na prática clínica (pontuação de disfunção da CP baseada em biomarcadores).

Metodologia Para atingir os objetivos a equipe realizará um estudo diagnóstico monocêntrico de fase 1 caso-controle baseado em estatística descritiva determinística e abordagem de agrupamento multidimensional apoiado por ferramentas diagnósticas complementares projetadas especificamente para exploração de PC de LHIPFOLDpat versus voluntários saudáveis ​​(HV) e pacientes com controle neurológico (NCpat). O NCpat será usado para avaliar a especificidade das assinaturas relacionadas ao CP identificadas no LHIPFOLDpat. A equipe espera que os resultados sejam semelhantes aos da HV em alguns NCpat, mas reflitam uma disfunção leve a moderada da PC em outros. Tendo a AP-HP como patrocinadora do estudo, a equipe obterá aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa para estudo “Jardé 1”, de acordo com a legislação e requisitos regulatórios em vigor.

-Seleção e recrutamento de pacientes e controles Os indivíduos serão recrutados prospectivamente durante um período de dois anos: 1) LHIPFOLDpat será selecionado conforme descrito anteriormente; 2)HV será recrutado pelo procedimento usual de publicidade e será pareado por idade e sexo com LHIPFOLDpat; 3) NCpat serão pacientes pareados por idade e sexo com doenças cerebrais comuns definidas frequentemente exploradas no departamento de Neurologia: esclerose múltipla, esclerose lateral amiotrófica, doença de Alzheimer, demência frontotemporal, hipertensão intracraniana idiopática e hidrocefalia de pressão normal. O diagnóstico dessas doenças será feito de acordo com as mais novas orientações dos neurologistas especializados em cada doença. Relativamente à amostra a recrutar, a equipa teve em conta duas condicionantes: o número de LHIPFOLDpat é limitado; o estudo não é uma simples comparação determinística versus um grupo de controle, mas sim uma análise multidimensional que leva à identificação de assinaturas relacionadas à PC por meio de agrupamentos homogêneos de pacientes. Consequentemente, a estratégia foi identificar um tamanho de amostra global que levasse a uma classificação homogênea dos pacientes com base em 5 ou 6 biomarcadores. De acordo com a fórmula de Donicar5, 2^6 pacientes adequadamente selecionados por técnica de amostragem estratificada deveriam permitir isso. Esses 64 pacientes incluirão 15 LHIPFOLDpat e um número igual de 25 HV e 25 NCpat. Além disso, mantendo a abordagem determinística, e com base em um estudo de simulação integrando média e desvio padrão do LCR 5MTHF em LHIPFOLDpat e NCpat (3,85 +/- 2,67 e 49,53 +/- 13,35 respectivamente) com respectivamente 15 e 25 indivíduos, este tamanho de amostra fornece um poder superior a 95% para demonstrar uma diferença com um teste Wilcoxon Rank Sum entre esses dois grupos (é digno de nota que os valores em HV são atualmente desconhecidos).

A equipe irá adquirir dados de ressonância magnética cerebral (com injeção de gadolínio no sangue), amostras de sangue e LCR de todos os indivíduos. LHIPFOLDpat e NCpat serão submetidos a esses procedimentos como parte do atendimento padrão no Departamento de Neurologia do Hospital Pitié-Salpêtrière. HV ficará internado um dia em nosso Centro de Investigação Clínica. Todos os sujeitos assinarão o consentimento informado e concordarão em se submeter a exames de ressonância magnética e amostragem de sangue e LCR para fins de pesquisa para HV, e tempo adicional de aquisição de ressonância magnética e volumes de amostra para pacientes.

• Estudo de ressonância magnética cerebral A ressonância magnética cerebral será realizada em 3 TESLA (Siemens PRISMA) no Centro de Pesquisa de Neuroimagem (CENIR), a plataforma de imagem do Paris Brain Institute (ICM). A equipe avaliará a morfologia e a função do CP: 1/para análise morfológica do CP, a equipe medirá os volumes do CP e extrairá parâmetros texturais. A segmentação do CP será realizada por meio de software automatizado desenvolvido no local. A análise de textura será realizada utilizando a sequência de ressonância magnética MP2RAGE. A avaliação da função 2/CP incluirá medidas quantitativas da permeabilidade capilar e perfusão macrovascular. Para explorar a permeabilidade do CP, será utilizada sequência de perfusão dinâmica T1 com realce de gadolínio; t-TRANS e outros valores regionais serão extraídos. O pós-processamento será realizado utilizando o software Syngovia (Siemens). Para explorar a perfusão macrovascular da PC, a equipe usará uma versão mais curta da perfusão dinâmica Arterial Spin Labeling (sem gadolínio) publicada anteriormente 6. Com esta sequência a equipe poderá avaliar o tempo de trânsito arterial e o fluxo sanguíneo aparente. A análise dos dados será realizada no CENIR.
• Descoberta de candidatos a biomarcadores de disfunção CP em compartimentos LCR/sangue Duas abordagens mistas serão usadas para selecionar os 10 principais candidatos a biomarcadores (a priori 5 metabólitos e 5 proteínas) que serão investigados por uma análise direcionada e totalmente quantitativa: i) metabolômica não direcionada e proteômica (os resultados serão revisados ​​para avaliar uma possível ligação com a função do CP); e ii) abordagem baseada em hipóteses: além do 5MTHF, com base em dados da literatura e em bancos de dados biológicos disponíveis publicamente, a equipe também identificou metabólitos (incluindo ácido ascórbico e ácido siálico) que parecem ser especificamente transportados pelo CP, e proteínas expressado especificamente pelo CP (incluindo TRPM3 e Klotho). Como as concentrações sanguíneas podem influenciar as concentrações de LCR para algumas moléculas, a equipe planeja analisar o sangue e a amostra de LCR ao mesmo tempo, com o cálculo de uma proporção de concentrações de LCR/Sangue.

Para metabolômica não direcionada, extratos metabólicos de LCR e amostras de plasma serão obtidos após precipitação de proteínas assistida por metanol e analisados ​​por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa de alta resolução (LC-HRMS) conforme a equipe realiza rotineiramente 7. Uma combinação de dois LC- complementares Plataformas HRMS serão utilizadas para traçar o perfil de metabólitos hidrofóbicos e polares8. O pré-tratamento dos dados e as análises estatísticas serão obtidos usando Workflow4Metabolomics (W4M), que é uma plataforma online colaborativa de código aberto para metabolômica computacional. A anotação de conjuntos de dados e a identificação de sinais biologicamente relevantes serão realizadas usando bibliotecas espectrais 'internas' e experimentos de MS/MS (espectrometria de massa em tandem). A quantificação relativa de ~250 metabólitos será alcançada graças à normalização usando amostras de controle de qualidade. Para a metabolômica direcionada, o 5MTHF do LCR é medido rotineiramente no laboratório Necker especializado em Neurometabolismo, usando métodos analíticos muito sensíveis e específicos (cromatografia líquida hifenizada para MS em tandem). A equipe está em processo de incluir na mesma análise medidas de ácido ascórbico e ácido siálico. Dependendo da natureza química dos candidatos a biomarcadores metabólicos identificados no estudo não direcionado, serão desenvolvidos um ou alguns novos métodos para quantificação robusta utilizando isótopos estáveis.

Um estudo proteômico preliminar no LCR de um paciente com alto teor de proteína no LCR e um controle nos permitirá estabelecer um protocolo de preparação de amostras, selecionar um método de análise de espectrometria de massa e um fluxo de trabalho de análise de dados. O objetivo é duplo: otimizar a extração de proteínas e permitir a comparação de LCR muito diferentes para desenvolver uma estratégia analítica que nos permita identificar biomarcadores. O estudo será realizado utilizando uma abordagem sem rótulo para minimizar a variabilidade, o número de etapas e principalmente para não restringir a faixa dinâmica da amostra. Todas as análises de bioinformática serão realizadas com myProMS9, nosso software de análise e gerenciamento de dados proteômicos desenvolvido no Institut Curie em colaboração com a plataforma de bioinformática INSERM U900 dirigida pelo Dr. E. Barillot. Para a abordagem proteômica direcionada, a equipe usará a experiência em MS direcionada com peptídeos de padrão interno marcados com isótopos estáveis, a abordagem padrão-ouro para quantificação de proteínas em fluido biológico, resultando em alta robustez, alta sensibilidade e análise multiplex10.

-Análise cruzada de dados A equipe gerenciará, analisará e integrará centralmente conjuntos de dados clínicos e biológicos e conhecimento gerado pela ressonância magnética e análise de amostras biológicas para identificar uma assinatura global relacionada à PC em pacientes LHIPFOLD. Com esses dados, a equipe estabelecerá um escore de disfunção da PC para uso na prática clínica de rotina, destinado a ser usado para explorar a PC em pacientes neurológicos.