Disfunzione del plesso coroideo nelle malattie neurologiche (PLEXFOLD)

La carenza cerebrale di folato (CFD) è una condizione definita da una bassa concentrazione (<41 nM) di 5-metiltetraidrofolato (5MTHF, la forma biologicamente attiva del folato) nel liquido cerebrospinale (CSF) 1. La CFD è considerata di origine "primaria" origine se è associato a diverse malattie genetiche che coinvolgono il metabolismo dei folati, portando a gravi manifestazioni motorie e cognitive. La CFD può anche essere "secondaria", cioè associata a varie malattie definite come malattie genetiche mitocondriali e anche malattie non identificate. Nei CFD secondari, la causa del CFD non è compresa. Nel centro, il team ha identificato 16 pazienti affetti da CFD con caratteristiche comuni: CFD secondaria profonda (5MTHF<10nM mentre il folato nel sangue è normale), liquido cerebrospinale ad alto contenuto proteico>1g/L (N<0,5) e un coinvolgimento specifico della sostanza bianca del cervello, iperintenso alla RM pesata in T2. Il team ha chiamato questa sindrome "LHIPFOLD" per leucoencefalopatia con deficit di proteine ​​elevate nel liquido cerebrospinale e deficit di FOLate (presentazione riservata, prevista per la fine del 2022). All’interno della rete francese dei laboratori di biochimica metabolica, il team ha identificato altri 6 pazienti LHIPFOLDpat (pazienti LHIPFOLD). Hanno un'età media compresa tra 42 e 14 anni (min 15; max 77) e un rapporto tra i sessi di 1,8 (M/F). 9/22 presentavano un'ampia delezione del DNA mitocondriale (Kearns-Sayre) o mutazioni bi-alleliche POLG (difetto di replicazione del DNA mitocondriale). Gli altri 13 pazienti non erano stati diagnosticati fino a poco tempo fa, ma il team ha trovato in un contesto di ricerca e validato in vitro varianti bi-alleliche in 4/7 pazienti testati all'interno dei geni della famiglia MRPS, che codificano per subunità del mitoribosoma.

I pazienti LHIPFOLD hanno chiaramente un difetto del trasporto intracerebrale di 5MTHF, ma senza mutazione dei trasportatori del folato cerebrale. Poiché il folato viene trasportato dal sangue al cervello esclusivamente dal plesso coroideo (CP)2, il team ipotizza che la CFD nel LHIPFOLD sia dovuta a una disfunzione del CP. CP, localizzato nei ventricoli cerebrali, è un organo epiteliale vascolarizzato che funge da barriera sangue-liquor, esprimendo numerosi trasportatori per il trasferimento delle molecole dal sangue al liquido cerebrospinale e viceversa (rimuovendo i prodotti di scarto dalle cellule cerebrali). CP secerne anche il liquido cerebrospinale ed esprime proteine ​​secrete dal liquido cerebrospinale legate a varie funzioni3.

Anche il liquido cerebrospinale ad alto contenuto proteico dovuto a un'alterazione della barriera ematoencefalica e la morfologia anomala della CP rilevata dall'autopsia cerebrale in due pazienti Kearns-Sayre sono a favore della disfunzione della CP nello studio LHIPFOLD 4. Inoltre, in due LHIPFOLDpat, il team ha riscontrato concentrazioni molto elevate di Acido sialico nel liquido cerebrospinale senza il coinvolgimento di geni correlati all'acido sialico mentre CP esprime fortemente il trasportatore di efflusso dell'acido sialico. Il team ha anche recentemente misurato una dimensione CP fortemente diminuita dopo la segmentazione automatica in altri due pat LHIPFOLD. Tutti questi dati sostengono fortemente la disfunzione della CP nel LHIPFOLD.

Se l'ipotesi è corretta, significa che oltre alla CFD, esistono probabilmente altre anomalie del liquido cerebrospinale come conseguenza di una disfunzione generalizzata della CP. Ciò può essere molto interessante in termini di approccio terapeutico, poiché la supplementazione di folati ha un effetto terapeutico chiaro ma limitato, soprattutto in alcuni pazienti. Sfortunatamente, per valutare la nostra ipotesi, non è disponibile alcuna esplorazione clinica per valutare le funzioni della CP, mentre la disfunzione/alterazione della CP è suggerita come potenziale contributo alla patogenesi di diverse malattie neurologiche comuni (per il testo seguente il team utilizzerà la disfunzione sia per disfunzione che per alterazione ). Poiché il team ritiene che nella sindrome LHIPFOLD la disfunzione della CP sia particolarmente grave, come suggerito dalla CFD profonda, considera la sindrome LHIPFOLD un modello clinico molto utile per convalidare la capacità di alcuni strumenti diagnostici rilevanti di valutare la funzione della CP. Pertanto gli obiettivi del progetto sono:

1. Dimostrare la disfunzione della CP in LHIPFOLD, attraverso l'identificazione di firme biochimiche e MRI specifiche e correlate alla CP, utilizzando l'imaging centrato sulla CP e approcci metabolomici e proteomici.
2. Identificare i biomarcatori biochimici correlati a CP in LHIPFOLD direttamente suscettibili al trattamento.
3. Impostazione di test diagnostici per immagini e biochimici per valutare la funzione CP nella pratica clinica (punteggio di disfunzione CP basato su biomarcatori).

Metodologia Per raggiungere gli obiettivi, il team condurrà uno studio caso-controllo diagnostico monocentrico di fase 1, basato su un approccio descrittivo, statistico deterministico e di clustering multidimensionale, supportato da strumenti diagnostici complementari specificamente progettati per l'esplorazione CP di LHIPFOLDpat rispetto a volontari sani (HV) e pazienti di controllo neurologico (NCpat). NCpat verrà utilizzato per valutare la specificità delle firme relative a CP identificate in LHIPFOLDpat. Il team prevede che i risultati saranno simili all'HV in alcuni NCpat, ma rifletteranno una disfunzione della CP da lieve a moderata in altri. Con AP-HP come sponsor dello studio, il team otterrà l'approvazione del Comitato Etico della Ricerca per uno studio "Jardé 1", in conformità con la legislazione e i requisiti normativi in ​​vigore.

-Selezione e reclutamento di pazienti e controlli I soggetti verranno reclutati prospetticamente durante un periodo di due anni: 1)LHIPFOLDpat sarà selezionato come precedentemente descritto; 2)HV sarà reclutato tramite la consueta procedura di inserzione, e sarà abbinato per età e sesso a LHIPFOLDpat; 3) Gli NCpat saranno pazienti abbinati per età e sesso con malattie cerebrali comuni frequentemente esplorate nel dipartimento di Neurologia: sclerosi multipla, sclerosi laterale amiotrofica, morbo di Alzheimer, demenza frontotemporale, ipertensione intracranica idiopatica e idrocefalo a pressione normale. La diagnosi di queste malattie verrà effettuata secondo le più recenti linee guida dai neurologi specializzati in ciascuna malattia. Per quanto riguarda il campione da reclutare, il team ha tenuto conto di due vincoli: il numero di LHIPFOLDpat è limitato; lo studio non è un semplice confronto deterministico rispetto a un gruppo di controllo ma più un'analisi multidimensionale che porta all'identificazione di firme correlate a CP attraverso cluster omogenei di pazienti. Di conseguenza, la strategia è stata quella di identificare una dimensione del campione globale che portasse ad una classificazione omogenea dei pazienti sulla base di 5 o 6 biomarcatori. Secondo la formula di Donicar5 2^6 pazienti opportunamente selezionati mediante una tecnica di campionamento stratificato dovrebbero consentire ciò. Questi 64 pazienti includeranno 15 LHIPFOLDpat e un numero uguale di 25 HV e 25 NCpat. Inoltre, mantenendo l'approccio deterministico e sulla base di uno studio di simulazione che integra media e deviazione standard del 5MTHF del liquido cerebrospinale in LHIPFOLDpat e NCpat (3,85 +/- 2,67 e 49,53 +/- 13,35 rispettivamente) con rispettivamente 15 e 25 soggetti, questa dimensione del campione fornisce una potenza superiore al 95% per dimostrare una differenza con un test Wilcoxon Rank Sum tra questi due gruppi (da notare che i valori in HV sono attualmente sconosciuti).

Il team acquisirà dati MRI cerebrali (con iniezione di gadolinio nel sangue), campioni di sangue e liquido cerebrospinale da tutti i soggetti. LHIPFOLDpat e NCpat saranno sottoposti a queste procedure come parte delle cure standard nel Dipartimento di Neurologia dell'Ospedale Pitié-Salpêtrière. HV sarà ricoverato un giorno nel nostro Centro di indagine clinica. Tutti i soggetti firmeranno il consenso informato e accetteranno di sottoporsi all'esame MRI e al campionamento di sangue e liquido cerebrospinale a scopo di ricerca per l'HV, nonché all'acquisizione del tempo di MRI e ai volumi di campione aggiuntivi per i pazienti.

• Studio sulla risonanza magnetica cerebrale La risonanza magnetica cerebrale verrà eseguita presso 3 TESLA (Siemens PRISMA) presso il Centro per la ricerca sul neuroimaging (CENIR), la piattaforma di imaging del Paris Brain Institute (ICM). Il team valuterà sia la morfologia che la funzione del CP: 1/per l'analisi morfologica del CP, il team misurerà i volumi del CP ed estrarrà i parametri strutturali. La segmentazione CP verrà eseguita utilizzando un software automatizzato sviluppato nel sito. L'analisi della struttura verrà eseguita utilizzando la sequenza MP2RAGE MRI. La valutazione della funzione 2/CP includerà misurazioni quantitative della permeabilità capillare e della perfusione macrovascolare. Per esplorare la permeabilità CP, verrà utilizzata la sequenza di perfusione dinamica T1 con potenziamento del gadolinio; Verranno estratti t-TRANS e altri valori regionali. La post-elaborazione verrà eseguita utilizzando il software Syngovia (Siemens). Per esplorare la perfusione macrovascolare CP, il team utilizzerà una versione più breve della perfusione dinamica Arterial Spin Labeling (senza gadolinio) pubblicata in precedenza 6. Con questa sequenza l'equipe potrà apprezzare il tempo di transito arterioso e il flusso sanguigno apparente. L'analisi dei dati sarà effettuata presso il CENIR.
• Scoperta di candidati biomarcatori di disfunzione CP nel liquido cerebrospinale/compartimenti sanguigni Verranno utilizzati due approcci misti per selezionare i 10 migliori biomarcatori candidati (a priori 5 metaboliti e 5 proteine) che saranno studiati mediante un'analisi mirata e completamente quantitativa: i) metabolomica non mirata e proteomica (i risultati saranno esaminati per valutare un possibile legame con la funzione CP); e ii) approccio basato su ipotesi: oltre al 5MTHF, sulla base dei dati della letteratura e del database biologico disponibile al pubblico, il team ha anche identificato metaboliti (inclusi acido ascorbico e acido sialico) che sembrano essere specificamente trasportati dal CP e proteine espressamente espresso dal CP (compresi TRPM3 e Klotho). Poiché le concentrazioni nel sangue possono influenzare le concentrazioni nel liquido cerebrospinale di alcune molecole, il team prevede di analizzare il sangue e il liquido cerebrospinale prelevati contemporaneamente, con il calcolo di un rapporto delle concentrazioni nel liquido cerebrospinale/sangue.

Per la metabolomica non mirata, gli estratti metabolici di campioni di liquido cerebrospinale e di plasma saranno ottenuti dopo la precipitazione proteica assistita da metanolo e analizzati mediante cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa ad alta risoluzione (LC-HRMS) come eseguito abitualmente dal team. 7. Una combinazione di due LC- Le piattaforme HRMS verranno utilizzate per profilare sia i metaboliti idrofobici che quelli polari8. Il pretrattamento dei dati e le analisi statistiche saranno ottenuti utilizzando Workflow4Metabolomics (W4M), che è una piattaforma online collaborativa open source per la metabolomica computazionale. L'annotazione dei set di dati e l'identificazione dei segnali biologicamente rilevanti verranno eseguiti utilizzando librerie spettrali "interne" ed esperimenti MS/MS (spettrometria di massa tandem). La quantificazione relativa di ~250 metaboliti sarà ottenuta grazie alla normalizzazione utilizzando campioni di controllo di qualità. Per la metabolomica mirata, il 5MTHF del liquido cerebrospinale viene misurato di routine nel laboratorio Necker specializzato in neurometabolismo, utilizzando metodi analitici molto sensibili e specifici (cromatografia liquida con trattino in tandem MS). Il team è in procinto di includere nella stessa analisi le misure dell'acido ascorbico e dell'acido sialico. A seconda della natura chimica dei candidati biomarcatori metabolitici identificati nello studio non mirato, verranno sviluppati uno o pochi nuovi metodi per una quantificazione robusta utilizzando isotopi stabili.

Uno studio proteomico preliminare sul liquido cerebrospinale di un paziente con proteine ​​elevate nel liquido cerebrospinale e un controllo ci consentiranno di stabilire un protocollo di preparazione del campione, selezionare un metodo di analisi della spettrometria di massa e un flusso di lavoro per l'analisi dei dati. L'obiettivo è duplice: ottimizzare l'estrazione delle proteine ​​e consentire il confronto di liquor molto diversi al fine di sviluppare una strategia analitica che ci consentirà di identificare biomarcatori. Lo studio sarà condotto utilizzando un approccio label-free per ridurre al minimo la variabilità, il numero di passaggi e soprattutto per non limitare il range dinamico del campione. Tutte le analisi bioinformatiche saranno eseguite con myProMS9, il nostro software di gestione e analisi dei dati proteomici sviluppato presso l'Institut Curie in collaborazione con la piattaforma bioinformatica INSERM U900 diretta dal Dr E. Barillot. Per l'approccio proteomico mirato, il team utilizzerà l'esperienza sulla MS mirata con peptidi standard interni marcati con isotopi stabili, l'approccio gold standard per la quantificazione delle proteine ​​nel fluido biologico, con conseguente elevata robustezza, alta sensibilità e analisi multiplex10.

-Analisi incrociata dei dati Il team gestirà, analizzerà e integrerà a livello centrale i set di dati clinici e biologici e le conoscenze generate dalla risonanza magnetica e dall'analisi dei campioni biologici per identificare una firma globale correlata alla CP nei pazienti LHIPFOLD. Con questi dati, il team stabilirà un punteggio di disfunzione della CP da utilizzare nella pratica clinica di routine, destinato ad essere utilizzato per esplorare la CP nei pazienti neurologici.